专利名称：二氧化碳结合力的检测方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及检验测定技术领域，更具体地说，涉及一种二氧化碳结合力的检测方法和试剂盒。
背景技术：
二氧化碳结合力指血浆中碳酸氢根所含的二氧化碳的含量。血清或血浆中二氧化碳结合力含量测定是临床生化检验的常规项目，测定二氧化碳结合力可以了解人体内酸碱平衡的情况。呼吸性酸中毒，(肺气肿、肺纤维化)、呼吸肌麻痹、支气管扩张、气胸及呼吸道阻塞；代谢性碱中毒，例如呕吐、肾上腺皮质功能亢进、缺钾及服用碱性药物过多等都会引起酸碱中毒，从而使二氧化碳结合力增高；代谢性酸中毒，例如尿毒症、休克、糖尿酮症、严重腹泻及脱水；呼吸性碱中毒，例如呼吸中枢及呼吸加快等会引起二氧化碳结合力降低。因此，测定血清或血浆中的二氧化碳结合力含量，是输液疗法纠正失衡的重要指标，对治疗有重要意义。目前，测定二氧化碳结合力的方法包括PH电极测定法、酸碱清空法和量压法等， 量压法主要是采用瓦式呼吸机进行测定，即根据样品中的碳酸氢根与乳酸作用生成二氧化碳，在密闭的环境下，测定出二氧化碳的体积从而测算出碳酸氢根的含量，从而得到二氧化碳结合力。但是，上述方法测定操作误差较大，测定结果的准确度不高，很难作为医院常规检验项目开展。随着各种半、全自动生化分析仪的普遍应用，近年来普遍采用磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)偶联的速率法(简称PEPC法)测定二氧化碳结合力。其反应原理为碳酸氢根与磷酸烯醇式丙酮酸在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的作用下生成草酰乙酸和磷酸；草酰乙酸与还原型辅酶在苹果酸脱氢酶的作用下生成苹果酸和氧化型辅酶。在PEPC法中，通过测定还原型辅酶的用量，测定碳酸氢根的含量，从而得到二氧化碳结合力。但是，空气中二氧化碳会与还原型辅酶发生反应，从而造成还原型辅酶下降； 此外，待检测样品中内源性物质的增高，例如某些疾病会使血乳酸增高，从而使样品中乳酸脱氢酶含量增加，由于乳酸脱氢酶的作用，使还原型辅酶下降，影响检测二氧化碳结合力的准确性。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种二氧化碳结合力的检测方法和试剂盒，该检测方法能够准确检测二氧化碳结合力。本发明提供了一种二氧化碳结合力的检测方法，包括步骤a)提供二氧化碳结合力的待检测样品；步骤b)将所述待检测样品与检测液混合，反应，得到反应液，所述检测液包括PH 值为4. 8 5. 2的Tris-HCl缓冲液、氯化钠、碳酸酐酶和显色剂；
步骤c)检测步骤b)得到的反应液在540 550nm波长下的吸光度值，计算得到
二氧化碳结合力。优选的，所述待检测样品为血 清或肝素抗凝血浆。优选的，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为10 50mmol/L。优选的，所述检测液中氯化钠的浓度为150 160mmol/L。优选的，所述检测液中碳酸酐酶的浓度为3000 5000U/L。优选的，所述检测液中显色剂的浓度为120 500mg/L。优选的，所述检测液还包括聚乙二醇6000、白蛋白和氯化钠。本发明还提供一种试剂盒，包括pH值为4. 8 5. 2的Tris-HCl缓冲液、氯化钠、碳酸酐酶和显色剂。9、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述碳酸酐酶的浓度为3500 4500U/L。优选的，还包括标准液，所述标准液为40g/L的牛血白蛋白和26mmol/L的碳酸氢钠。从上述的技术方案可以看出，本发明提供一种二氧化碳结合力的检测方法和试剂盒，该检测方法包括将二氧化碳结合力的待检测样品与检测液混合，反应，得到反应液，所述检测液包括PH值为4. 8 5. 2的Tris-HCl缓冲液、氯化钠、碳酸酐酶和显色剂；检测所述反应液在540 550nm波长下的吸光度值，计算得到二氧化碳结合力。在检测过程中，所述待检测样品中的二氧化碳在碳酸酐酶的作用下生成碳酸氢根，从而使反应液的PH值升高，显色剂显色，然后通过检测所述反应液的吸光度值，计算得到二氧化碳结合力。与现有技术相比，本发明利用显色反应，无需使用还原型辅酶，检测的二氧化碳结合力具有很好的准确性。
具体实施例方式下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明提供一种二氧化碳结合力的检测方法，包括步骤a)提供二氧化碳结合力的待检测样品；步骤b)将所述待检测样品与检测液混合，反应，得到反应液，所述检测液包括PH 值为4. 8 5. 2的Tris-HCl缓冲液、氯化钠、碳酸酐酶和显色剂；步骤c)检测步骤b)得到的反应液在540 550nm波长下的吸光度值，计算得到
二氧化碳结合力。本发明中，所述Tris-HCl缓冲液的浓度优选为10 50mmol/L，更优选为20 30mmol/L，最优选为30mmol/L。所述检测液中氯化钠的浓度优选为150 160mmol/L，更优选为152 158mmol/L，更优选为154mmol/L。所述检测液中碳酸酐酶的浓度优选为3000 5000U/L，更优选为3800 4200U/L，最优选为3900 4100U/L。所述检测液中显色剂的浓度优选为120 500mg/L，更优选为150 300mg/L，最优选为180 250mg/L。本发明采用的显色剂优选为质量比为7 3 10的酚红、溴百里香酚蓝和氯化钠的混合物。所述检测液还包括稳定剂，所述稳定剂的浓度优选为10 14g/L，更优选为11 13g/L，最优选为11 12g/L。本发明所述稳定剂优选为质量比为1 1 10的聚乙二醇6000、白蛋白和氯化钠的混合物。本发明提供的检测方法采用的标准液优选为40g/L的牛血白蛋白和 26mmol/L的碳酸氢钠。本发明提供的二氧化碳结合力的检测方法为碳酸酐酶比色法，通过待检测样品与试剂盒混合发生的反应，引起PH变化，显色剂显色，然后利用紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪，检测所述反应液在540 550nm波长下的吸光度值，计算得到二氧化碳结合力。本发明提供的二氧化碳结合力的检测方法测定速度快，并且，由于所述检测液呈弱酸性，不易吸收空气中的二氧化碳，抗干扰能力强。此外，即使所述试剂盒吸收了少量空气中的二氧化碳，本发明可以通过对检测液的空白测定，避免对测定结果的影响，保证了测定准确度；并且，本发明提供的检测方法无需反复定标，使用方便。本发明提供的二氧化碳结合力的检测方法的检测原理为本发明所述待检测样品优选为无溶血、无乳糜的血清或肝素抗凝血浆。由于所述待检测样品中的碱度主要是碳酸盐缓冲系统，其中以碳酸氢根为主，其次是碳酸和碳酸根，在PH为5左右的弱酸性介质中， 碳酸和碳酸根转化为二氧化碳和水。利用本发明提供的二氧化碳结合力的检测方法检测待检测样品中的二氧化碳结合力时，待检测样品中的二氧化碳在碳酸酐酶的作用下生成碳酸氢根，生成的碳酸氢根使反应液的PH值升高，显色剂显色。原试剂盒在pH值5以下时为黄色，由于碳酸氢根含量越高显色就越深，当PH值升高时反应液由黄色变为紫红色。所述反应液的最佳吸收波长为540 550nm，优选为546nm。将最终反应液置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，在540 550nm波长下测定吸光度值大小。通过吸光度值与碳酸氢根含量的正比关系，测算得到二氧化碳结合力的含量。检测原理具体为碳酸+氢氧根一水+ 二氧化碳二氧化碳和水在碳酸酐酶作用下生成氢离子和碳酸氢根本发明还公开一种试剂盒，包括pH值为4. 8 5. 2的Tris-HCl缓冲液、氯化钠、碳酸酐酶和显色剂。本发明中，所述Tris-HCl缓冲液的浓度优选为10 50mmol/L，更优选为20 30mmol/L，最优选为30mmol/L。所述氯化钠的浓度优选为150 160mmol/L，更优选为 152 158mmol/L，更优选为154mmol/L。所述碳酸酐酶的浓度优选为3000 5000U/L，更优选为3800 4200U/L，最优选为3900 4100U/L。所述显色剂的浓度优选为120 500mg/ L，更优选为150 300mg/L，最优选为180 250mg/L。本发明采用的显色剂优选为质量比为7 3 10的酚红、溴百里香酚蓝和氯化钠的混合物。所述检测液还包括稳定剂，所述稳定剂的浓度优选为10 14g/L，更优选为11 13g/L，最优选为11 12g/L。本发明所述稳定剂优选为质量比为1 1 10的聚乙二醇6000、白蛋白和氯化钠的混合物。按照本发明，还包括标准液，所述标准液为40g/L的牛血白蛋白和^mmol/L的碳酸氢钠。本发明提供的试剂盒可以为单一试剂，也可以为双试剂。例如，将Tris-HCl缓冲液、氯化钠溶液、碳酸酐酶和显色剂制成单一试剂；或者，将Tris-HCl缓冲液和氯化钠制成第一试剂，将碳酸酐酶、显色剂、稳定剂制成第二试剂，在利用该试剂盒检测二氧化碳结合力时，将第一试剂与第二试剂混合，从而检测待检测样品中的二氧化碳结合力。
本发明提供的试剂盒优选按照如下方法制备按30mmol/L称取Tris加蒸馏水溶解，用IN的HCl调pH至4. 8 5. 2，加入氯化钠、碳酸酐酶及显色剂，混合。将得到的混合溶液分装入瓶。本发明可以通过对所述分装入瓶的混合溶液进行冷冻干燥，制成干粉试剂， 所述干粉试剂在使用前需用蒸馏水复溶；可以直接制备得到液体试剂，便于直接使用。为了进一步说明本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。实施例1试剂盒的配制按30mmol/L称取Tris加蒸馏水溶解，用IN的HCl调pH至4. 8 5. 2，分别加入氯化钠、碳酸酐酶和显色剂，得到混合溶液，将所述混合溶液分装入瓶，冷冻干燥，得到干粉试剂，所述混合溶液中包括以下成分
Tris-HCl 缓冲液30mmol/L
氯化钠154mmol/L
碳酸酐酶5000U/L
质量比为7: 3: 10的酚红、溴百里香酚蓝和氯化钠200mg/L将40g/L的牛血白蛋白和^mmol/L的碳酸氢钠混合，得到标准液。实施例2将实施例1制备的试剂盒与蒸馏水混合，静置10分钟，得到检测试剂；将血清、实施例1制备的标准液与上述制备的检测试剂分别置于全自动生化分析仪的样品盘和试剂盘中，仪器自动按设定参数8μ 1样品和240 μ 1检测试剂取样，混合，反应，得到反应溶液，在37°c下，孵育时间为300秒，检测546nm波长下的吸光度值，根据计算公式C#=A#/AfeXCfe(26mmol/L)，测算出二氧化碳结合力的浓度大小，其中C#为被测样本浓度；A#为样本吸光度值；Cfe为标准液浓度(已知)为标准液吸光度值。实施例3试剂盒的配制制备第一试剂按30mmol/L称取Tris加蒸馏水溶解，用IN的HCl调pH至4. 8 5. 2，加入氯化钠，得到第一试剂。制备第二试剂用4%的牛血白蛋白溶液溶解碳酸酐酶，用50%甲醇溶解显色剂，然后加入蒸馏水和稳定剂，得到第二试剂。所述第一液体试剂与所示第二液体试剂中成分如下Tris-HCl 缓冲液30mmol/L
氯化钠154mmol/L
碳酸酐酶5000U/L
质量比为7: 3: 10的酚红、溴百里香酚蓝和氯化钠 200mg/L 质量比为1: 1: 10的聚乙二醇6000、白蛋白和氯化钠 12g/L制备标准液将40g/L的牛血白蛋白和26mmol/L的碳酸氢钠混合，得到标准液。实施例4将肝素抗凝血浆、实施例3制备的标准液、第一试剂、第二试剂分别置于全自动生化分析仪的样品盘和试剂盘中，仪器自动按设定参数8μ 1样品和200 μ 1第一试剂、40 μ 1 第二试剂取样，混合，反应，得到反应溶液，在37°C下，孵育时间为300秒，检测546nm波长下的吸光度值，根据计算公式C#=A#/Afe XCfe，从而测算出二氧化碳结合力的浓度大小，其中工#为被测样本浓度；A#为样本吸光度值为标准液浓度为标准液吸光度值。如表1所示，为本发明检测二氧化碳结合力的测定参数。表1碳酸酐酶比色法测定参数
权利要求
1.一种二氧化碳结合力的检测方法，其特征在于，包括 步骤a)提供二氧化碳结合力的待检测样品；步骤b)将所述待检测样品与检测液混合，反应，得到反应液，所述检测液包括PH值为 4. 8 5. 2的Tris-HCl缓冲液、氯化钠、碳酸酐酶和显色剂；步骤c)检测步骤b)得到的反应液在540 550nm波长下的吸光度值，计算得到二氧化碳结合力。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待检测样品为血清或肝素抗凝血浆。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为10 50mmol/L。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测液中氯化钠的浓度为150 160mmol/L。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测液中碳酸酐酶的浓度为 3000 5000U/L。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测液中显色剂的浓度为120 500mg/Lo
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测液还包括聚乙二醇6000、白蛋白和氯化钠。
8.一种试剂盒，其特征在于，包括PH值为4. 8 5. 2的Tris-HCl缓冲液、氯化钠、碳酸酐酶和显色剂。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述碳酸酐酶的浓度为3500 4500U/L。
10.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括标准液，所述标准液为40g/L的牛血白蛋白和^mmol/L的碳酸氢钠。
全文摘要
本发明公开了一种二氧化碳结合力的检测方法和试剂盒，该检测方法包括将二氧化碳结合力的待检测样品与检测液混合，反应，得到反应液，所述检测液包括pH值为4.8～5.2的Tris-HCl缓冲液、氯化钠、碳酸酐酶和显色剂；检测所述反应液在540～550nm波长下的吸光度值，计算得到二氧化碳结合力。在检测过程中，所述待检测样品中的二氧化碳在碳酸酐酶的作用下生成碳酸氢根，从而使反应液的pH值升高，显色剂显色，然后通过检测所述反应液的吸光度值，计算得到二氧化碳结合力。与现有技术相比，本发明利用显色反应，无需使用还原型辅酶，检测的二氧化碳结合力具有很好的准确性。
文档编号G01N21/78GK102156126SQ20111007223
公开日2011年8月17日 申请日期2011年3月24日 优先权日2011年3月24日
发明者董理 申请人:董理