高效液相色谱法测定复合维B+双氯芬酸钠片中维生素B₁₂含量的方法

专利名称：高效液相色谱法测定复合维B+双氯芬酸钠片中维生素B₁₂含量的方法
技术领域：
本发明涉及药物含量测定领域，具体涉及一种高效液相色谱法测定复合维B+双氯芬酸钠片中维生素B12含量的方法。
背景技术：
复合维B+双氯芬酸钠片产品为外贸出口品种，主要市场在非洲大陆尼日利亚等国家，在当地是一国际名牌产品，每年销量5000万片以上，价格上有强劲优势。但由于该产品在国内外均没有现成的法定检验标准，按照外国公司提供的内部标准检验只能检出维生素&与维生素 及双氯芬酸钠的含量，维生素B12的含量没有方法检测和做鉴别的要求。由于没有方法检验出复合维B+双氯芬酸钠片中维生素B12的含量，本申请人曾发生过出口产品被尼日利亚国家海关扣封的事件。于是，本申请人痛定思痛，决定对该产品检验技术进行技术攻关，填补该标准上维生素B12检验的空白。本处方制剂最主要的难点是维生素B12在处方中用量极少(50 μ g/510mg)，理论上仅有可能做色谱鉴别或者理化辨别。维生素B12及其制剂在CP2005、BP2009、USP31中均收载有检验方法，但均是以单方和规格量较大形式建立的法定标准，且最小单元重量合理，便于检验上样品纯化处理，检验方法相对成熟。上述标准中的方法经过试验结果不好，一是量小检不出，如果加大称样量，样品溶液非常难纯化处理，不符合微量分析思维逻辑；二是虽然客服了操作方法纯化处理好样品溶液，但维生素仏与维生素 及双氯芬酸钠有干扰峰出现，无法给维生素B1定位和计算含量。试验成功希望渺小。花高价请上级部门药检所和国外药检实验机构做维生素B12鉴别或含量，均检测不出维生素B12。

发明内容
本发明的目的在于，提出一种高效液相色谱法测定复合维B+双氯芬酸钠片中维生素B12含量的方法，以准确可靠地测定复合维B+双氯芬酸钠片中维生素B12的含量。为了实现上述目的，本发明提出的高效液相色谱法测定复合维B+双氯芬酸钠片中维生素B12含量的方法包括(1)在避光条件下往维生素B12对照品中加流动相溶解制备对照品溶液(2)在避光条件下将复合维B+双氯芬酸钠片样品除去包衣，研细后加入流动相并用超声波溶解，摇勻后离心沉淀，取上清液，称定重量，加热煮沸后放冷，再滴加流动相至煮沸前的重量，摇勻，过滤，制得供试品溶液(3)色谱条件色谱柱选用十八烷基硅烷键合硅胶柱；以甲醇和0.05moL/L磷酸二氢钾溶液体积比为22 78作为流动相，磷酸二氢钾溶液的PH值为6.4 ；柱温为:35°C;
检测波长为36 Inm;流速为 1. OmL/min ；进样量为20 μ L。本发明方法对复合维B+双氯芬酸钠片中维生素B12含量的测定结果准确、可靠，方法简便、科学，试验时间短，无干扰峰，分离度、拖尾因子、不对称度均符合中国药典求，检测结果良好。
具体实施例方式1.仪器与试药采用LC-lOATvp日本岛津高效液相色谱仪，SPD-lOAvp紫外检测器，美国制造P/ N(7725i)手动进样器，浙江大学N-2000数据工作站，柱温箱，电子天平为十万分之一分析天平，DD80型超声脱气机，800型离心机。维生素^2对照品从中国药物生物制品检定所购买(批号100248-200802，供HPLC法含量测定，含量95.5% )，复合维B+双氯芬酸钠片样品自产(批号为091011)，甲醇为一级色谱纯(产地天津四友精细化学品有限公司出品)， 水为双蒸馏水(自制)，其他试剂为分析级试剂。2.色谱条件色谱柱选用十八烷基硅烷键合硅胶柱，尺寸为4. 60mmX 250mm，填料为Hypersil 0DS2，填料的粒径为5 μ m。以甲醇和0. 05moL/L磷酸二氢钾溶液体积比为22 78作为流动相，用10%磷酸溶液或者2moL/L氢氧化钾溶液把磷酸二氢钾溶液的PH调为6. 4，流动相使用前先用超声脱气机超声脱气处理30分钟，以去除流动相中的气泡，柱温为35°C，紫外检测器的检测波长为361nm，流速为1. OmL/min，进样量为20 μ L。对于流动相的选择，进行了几次摸索试验，先以甲醇和0. 028mol/L磷酸氢二钠溶液的体积比为26 74作为流动相，用磷酸把磷酸氢二钠溶液的PH值调为3. 5，维生素B12 的出峰时间提前在10分钟左右，而且不能和同类水溶性维生素B1与 有效分离开，结果不是很理想。后选择以甲醇和0. 05mol/L磷酸氢二钾溶液的体积比为35 65作为流动相， 用10%磷酸溶液或2mol/L氢氧化钾溶液把磷酸氢二钾溶液的PH值调为6. 4，维生素B12的出峰时间仍在前面，有类似干扰。最后再把流动相中甲醇和0.05mol/L磷酸氢二钾溶液的体积比调为22 78，用10%磷酸溶液或2mol/L氢氧化钾溶液把磷酸氢二钾溶液的PH值调为6. 4，能够有效分开干扰峰，试验结果满意。对于紫外检测器的检测波长选择，用线性项下3mL置20mL量瓶中的溶液用紫外分光光度计在200-400nm波长段扫描，发现在361nm波长处均有最大的吸收值，故选择该波长为检测波长。3.样品含量测定对照品溶液的制备精密称取维生素B12对照品2. 5mg置IOOmL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇勻，即得浓度为25 μ g/mL的对照品溶液。供试品溶液的制备取复合维B+双氯芬酸钠片样品20片除去包衣，研细，精密称取细粉5. 0849g置50mL量瓶中，精密加20mL流动相用超声波溶解，摇勻后用离心机离心沉淀，取上清液置50mL干燥烧杯中，称定重量，加热煮沸后放冷，再滴加流动相至煮沸前的重量，摇勻，过滤，即得供试品溶液。
对照品溶液和供试品溶液均在避光条件下制备。在上述色谱条件下，取对照品溶液和供试品溶液各20 μ L，注入高效液相色谱仪， 记录色谱图，再经分析计算得出维生素A2的含量，结果测得复合维B+双氯芬酸钠片样品中的维生素B12含量95. 49%。本方法测定复合维B+双氯芬酸钠片样品中的维生素B12含量方法简单且科学，含量测定准确可靠。4.专属性试验对照品溶液的制备精密称取维生素B12对照品2. 5mg置IOOmL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇勻，即得浓度为25 μ g/mL的对照品溶液。供试品溶液的制备取复合维B+双氯芬酸钠片样品20片除去包衣，研细，精密称取细粉5. OOOg (相当于B12O. 5mg)置50mL量瓶中，精密加20mL流动相用超声波溶解，摇勻后用离心机离心沉淀，取上清液置50mL干燥烧杯中，称重，加热煮沸后放冷，再滴加流动相至煮沸前的重量，摇勻，过滤，即得浓度为25 μ g/mL的供试品溶液。对照品溶液和供试品溶液均在避光条件下制备。按复合维B+双氯芬酸钠片处方制得不含维生素B12的阴性样品颗粒，按上述供试品溶液的制备方法制成空白样品溶液，按上述色谱条件，精密吸取对照品溶液、供试品溶液及空白样品溶液各20 μ L，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果表明空白样品溶液不干扰供试品的含量测定。5.线性考察储备溶液的制备精密称取维生素B12对照品7. 5mg置IOOmL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇勻，得到储备溶液。避光操作制备储备溶液。分别精密吸取储备溶液0. 5mL、l. OmL,3. OmL,5. OmL,7. OmL,9. OmL 置 20mL 量瓶中，
加流动相至刻度摇勻，得到各浓度溶液。分别精密吸取20 μ L，注入高效液相色谱仪，测定。 每一浓度溶液分别各进样二次，求峰面积平均值，再以系列峰面积进行线性考察。以维生素 B12的浓度C(mg/mL)为横坐标，峰面积Y为纵坐标进行线性回归，结果表明维生素B12进样量在1. 875 33. 75 μ g范围内呈现良线性关系，回归方程为Y = 20M04X-99700，相关系数 r = 0. 9994。6.检测限及最低检测浓度精密吸取线性关系试验项下0. 5mL置20mL量瓶中的溶液lmL，置IOmL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇勻，为样品溶液，进样量为20 μ L。当峰信号噪音与基线噪音比约为 3 1时得最小检测浓度为0. 1875 μ g/mL，最小检测量为3. 75ng。7.精密度试验(避光操作)以线性关系项下7. OmL到20mL量瓶中的溶液为样品溶液，连续进样6次，求取峰值面积，计算RSD = 0.57% (n = 6)，表明该方法精密度良好。8.重现性试验(避光操作)对照品溶液的制备精密称取维生素B12对照品2. 5mg置IOOmL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇勻，作为对照品溶液。供试品溶液的制备取复合维B+双氯芬酸钠片样品20片除去包衣，研细，精密称取细粉5. OOOg (相当于B12O. 5mg)置50mL量瓶中，精密加20mL流动相用超声波溶解，摇勻后用离心机离心沉淀，取上清液置50mL干燥烧杯中，称重，加热煮沸后放冷，再滴加流动相至煮沸前的重量，摇勻，过滤，即得供试品溶液。取对照品溶液和供试品溶液，按色谱条件各进样20 μ L，测定维生素B12的含量， RSD = 0. 9% (n = 5)。表明本发明方法测定维生素B12的含量能达到真实、准确的分析要求。9.稳定性试验(避光操作)对照品溶液的制备精密称取维生素B12对照品2. 5mg置IOOmL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇勻，作为对照品溶液。供试品溶液的制备取复合维B+双氯芬酸钠片样品20片除去包衣，研细，精密称取细粉5. OOOg (相当于B12O. 5mg)置50mL量瓶中，精密加20mL流动相用超声波溶解，摇勻后用离心机离心沉淀，取上清液置50mL干燥烧杯中，称重，加热煮沸后放冷，再滴加流动相至煮沸前的重量，摇勻，过滤，即得供试品溶液。取照品溶液和供试品溶液，按色谱条件项下方法操作，每隔池进样检测，分别求取面积值，RSD为1. 3% (n = 5)。表明供试品溶液在他内稳定性良好。10.回收率试验精密称取维生素B12对照品6份，分别精密加入一定量处方中混合均勻的空白辅料颗粒，按含量方法测定，按外表一法计算回收率。结果表明维生素B12回收率平均为 99. 80%，RSD为1.84%，回收率良好。结果如表1所示。表1回收率试验结果(n = 6)
权利要求
1.高效液相色谱法测定复合维B+双氯芬酸钠片中维生素B12含量的方法，包括(1)在避光条件下往维生素B12对照品中加流动相溶解制备对照品溶液(2)在避光条件下将复合维B+双氯芬酸钠片样品除去包衣，研细后加入流动相并用超声波溶解，摇勻后离心沉淀，取上清液，称定重量，加热煮沸后放冷，再滴加流动相至煮沸前的重量，摇勻，过滤，制得供试品溶液(3)色谱条件色谱柱选用十八烷基硅烷键合硅胶柱；以甲醇和0. 05moL/L磷酸二氢钾溶液体积比为22 78作为流动相，磷酸二氢钾溶液的PH值为6. 4 ；柱温为:35°C ；检测波长为36 Inm ；流速为 1. OmL/min ；进样量为20 μ L。
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱法测定复合维B+双氯芬酸钠片中维生素B12含量的方法，其特征在于，用10%磷酸溶液或者2moL/L氢氧化钾溶液调节磷酸二氢钾溶液的 PH值。
3.根据权利要求2所述的高效液相色谱法测定复合维B+双氯芬酸钠片中维生素B12含量的方法，其特征在于，所述色谱柱的尺寸为4. 60mmX 250mm,填料粒径为5 μ m。
4.根据权利要求3所述的高效液相色谱法测定复合维B+双氯芬酸钠片中维生素B12含量的方法，其特征在于，所述流动相在使用前先超声脱气处理。
5.根据权利要求4所述的高效液相色谱法测定复合维B+双氯芬酸钠片中维生素B12含量的方法，其特征在于，所述水为双蒸馏水。
全文摘要
本发明涉及一种高效液相色谱法测定复合维B+双氯芬酸钠片中维生素B12含量的方法，包括(1)在避光条件下制备对照品溶液(2)在避光条件下将复合维B+双氯芬酸钠片样品除去包衣，研细后加入流动相并用超声波溶解，摇匀后离心沉淀，取上清液，称定重量，加热煮沸后放冷，再滴加流动相至煮沸前的重量，摇匀，过滤，制得供试品溶液(3)色谱条件色谱柱选用十八烷基硅烷键合硅胶柱；以甲醇和0.05mol/l磷酸二氢钾溶液体积比为22∶78作为流动相，磷酸二氢钾溶液的pH值为6.4；柱温为35℃；检测波长为361nm；流速为1.0ml/min；进样量为20μl。本发明测定结果准确、可靠，方法简便、科学，符合中国药典求，检测结果良好。
文档编号G01N30/36GK102226795SQ201110082370
公开日2011年10月26日 申请日期2011年3月31日 优先权日2011年3月31日
发明者孙伟东, 艾建高 申请人:宁波双伟制药有限公司