专利名称：石榴中没食子酸、鞣花酸和安石榴甙a&b的分析方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于天然产物分析检验及应用领域，特别涉及石榴中没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B分析方法的建立，以及该方法在石榴产品分析检测中的应用。
背景技术：
石榴属于石榴科(Punicaceae)石榴属(Punica)，是一种营养价值很高的水果。石榴常用于鲜食，或加工成石榴汁饮料、石榴酒、石榴酱等，产品种类繁多。石榴不仅含有普通植物所共有的碳水化合物、脂质、蛋白质等成分外，还富含多种活性成分，如多酚、黄酮、花青素、生物碱等。多酚化合物因具有抗氧化、清除自由基、抗癌、抗衰老、保护心血管系统、保护消化系统、降血糖等生理活性功能，备受人们关注。随着人们健康意识的提高，天然产物中活性成分的分离提取、分析检测和功能性评价研究成为关注的热点。石榴资源丰富，是很好的抗氧化活性多酚的生产原料。不同部位来源的多酚组成和含量不尽相同。石榴汁中多酚含量约为0.21%，主要包括没食子酸、鞣花酸和儿茶素。石榴皮中多酚含量约为10.49Γ21.3%，主要包括安石榴甙、鞣花酸和没食子酸。石榴籽油中多酚含量很低，仅为0. 015%。这些多酚化合物严重地影响着石榴的营养价值，同时石榴所具有的一些重要的保健医疗功效也主要归功于没食子酸、鞣花酸、安石榴甙等多酚化合物，如石榴果汁在体内的减少氧化应激、抗动脉粥样硬化和减少血小板凝聚功效，石榴皮提取物在体外的抗氧化、抑制微生物生长和抑菌功效。没食子酸是一种很强的抗氧化剂，具有抗真菌、抑制细菌、保护细胞免受氧化破坏等功效，被广泛应用于制药领域。安石榴甙是一种很有潜力的抗氧化剂，研究发现安石榴甙有两个可逆的A和B (α-和异头物，可以预防对油脂、氨基酸和鸟嘌呤核苷的氧化破坏作用，但是β-异构体比α-异构体具有更强的抗氧化能力。鞣花酸是一个膳食多酚，具有很强的抗氧化、抗癌和抗动脉粥样硬化等功效。目前，对于石榴中没食子酸、鞣花酸和安石榴甙Α&Β的研究，主要集中在分离提取和功能性评价方面，关于分析检测的研究在国内外比较少。文献检索发现目前几乎没有关于石榴产品中没食子酸、鞣花酸、安石榴甙A和安石榴甙B分析方法的研究。考虑到这些多酚化合物的重要保健医疗功效，非常有必要建立一种石榴中没食子酸、鞣花酸和安石榴甙 Α&Β的新型快速检测方法，并探讨其在石榴产品分析检测中的应用前景。本发明中所测定的没食子酸、鞣花酸和安石榴甙Α&Β的结构式如图3 — 5所示。
发明内容
本发明为了克服上述现有技术中的不足，第一方面提供一种石榴中没食子酸、鞣花酸和安石榴甙Α&Β的新型快速检测方法，第二方面提供了该方法在石榴产品分析检测中的应用。本发明的第一方面提供的技术方案为石榴中没食子酸、鞣花酸和安石榴甙Α&Β的分析方法，其特征在于采用高效液相色谱技术，通过优化HPLC分析条件一次性分离检出4种多酚化合物——没食子酸、鞣花酸、安石榴甙A和安石榴甙B，建立一种石榴中没食子酸、 鞣花酸和安石榴甙A&B的高效液相色谱分析方法。石榴中没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B的分析方法，具体按照下述步骤进行 (1)准确称取没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B标准品适量，依次用HPLC级水、NaOH溶液和甲醇溶解，混勻，配制成标准储备溶液，避光-18 °C保存；临用时，用HPLC级水、NaOH溶液和甲醇稀释上述标准储备溶液，配置成不同浓度的没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B标准工作液，避光-18 °C保存；
(2)用HPLC级水、磷酸和乙腈来配制流动相A和B；
(3)开启高效液相色谱系统，设定高效液相色谱分析条件；
(4)由稀至浓依次将不同浓度的没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B标准工作液用上述高效液相色谱分析条件来检测，记录HPLC色谱图和峰面积，确定没食子酸、鞣花酸、安石榴甙A和安石榴甙B的检测波长、保留时间、检出限、定量限、线性关系和相关系数、方法回收率和稳定性，建立4种多酚化合物的线性方程；
(5)将经过预处理的石榴样品溶液，用0.2 μ 微孔滤膜过滤即得供试石榴样品溶液； 用上述高效液相色谱分析条件来检测，记录HPLC色谱图和峰面积，根据4种多酚化合
物的线性方程，计算即获得不同石榴样品中没食子酸、鞣花酸、安石榴甙A和安石榴甙B的含量。其中所述的步骤中(1)中安石榴甙A&B中含有51. 54%安石榴甙A和48. 46%安石榴甙B ； NaOH溶液的浓度为0. 06 mol/L ；标准储备溶液的浓度没食子酸为四9. 40mg/L, 鞣花酸为570. 00 mg/L，安石榴甙A&B为1905. 36 mg/L。其中所述的步骤中(3)中高效液相色谱分析条件为=Kinetex C18色谱柱(100 mmX4. 6 mm, 2. 6 Mm)和KrudKatcher Ultra在线过滤预柱，进样量 10 μ ，流速 1.8 mL/min, 柱温30 °C，PDA检测波长20(T600 nm ；流动相组合为流动相A :0. 1%( ν/ν)磷酸水溶液，流动相B 0. 1% (ν/ν)磷酸乙腈溶液；梯度洗脱条件为:1%Β等梯度洗脱(Tl. 5 min, 1% 4· 5%B 递增线性洗脱1. 5 3. 0 min,4. 5%B等梯度洗脱3. 0 5· 0 min,4. 5% 7· 0%B递增线性洗脱 5. 0 6. 5 min, 7. 0%B 等梯度洗脱 6. 5 8. 5 min, 7. 0% 25. 0%B 递增线性洗脱 8. 5 13. 73 min, 25. 0% 90. 0%B递增线性洗脱13. 73 14. 39 min,90. 0% 1. 0%B递减线性洗脱14. 40 16. 39 min。采用Masslynx软件来控制整个HPLC系统和收集试验数据，用Masslynx软件的 QuanLynx功能来处理试验数据。本发明的第二方面提供的上述方法在石榴中没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B分析方法的应用可用于包括石榴提取物、石榴汁或石榴饮料等多种石榴产品中4种多酚化合物——没食子酸、鞣花酸、安石榴甙A和安石榴甙B的分析检测，用作检验石榴产品真伪的快速检测方法。本发明的优点1、本发明的方法快速简便、灵敏度高、回收率高、通用性强、线性相关性和稳定性良好。2、本发明的方法可以定性和定量地检测出多种石榴产品中的4种多酚化合物——没食子酸、鞣花酸、安石榴甙A和安石榴甙B，可以用作检验石榴产品真伪的快速检测方法。
其中图1为石榴提取物的HPLC色谱图，其中GA-没食子酸，PA-安石榴甙A，PB-安石榴甙B，EA-鞣花酸。图2分别为石榴汁(A)、Honest Ade石榴饮料(B)、Langers 100%石榴饮料(C)、 All Natural 100% 石榴饮料(D)和 POM Wonderful 100% 石榴饮料(E)的 HPLC 色谱图。图3没食子酸的结构式1，图4为鞣花酸的化学结构式，图5为安石榴甙A&B (c) 的化学结构式。
具体实施例方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。 所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。从下面给出的说明结合附图，本发明的上面和其他目的和特征将变得明了。高效液相色谱分析方法如下
(1)准确称取没食子酸、鞣花酸(Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，密苏里州，美国))和安石榴甙A&B (51. 54%安石榴甙A和48. 46%安石榴甙B) (ChromaDex公司(欧文，加利福尼亚州，美国))标准品适量，依次用HPLC级水、NaOH溶液(0. 06 mol/L)和甲醇溶解，混勻，配制成299. 40,570. 00和1905. 36 mg/L的标准储备溶液，避光-18 °C保存。临用时，用HPLC 级水、NaOH溶液(0. 06 mol/L)和甲醇稀释上述标准储备溶液，配置成不同浓度的没食子酸、 鞣花酸和安石榴甙A&B标准工作液，避光-18 °C保存。(2 )用HPLC级水、磷酸和乙腈来配制流动相A和B。(3)开启高效液相色谱系统(Waters公司(米尔德福，马萨诸塞州，美国))，设定高效液相色谱分析条件。系统条件为Kinetex C18色谱柱(100 mmX4. 6 mm, 2. 6 Mm)和 KrudKatcher Ultra在线过滤预柱(Phenomenex公司(托兰斯，加利福尼亚州，美国))，进样量10 μ ，流速1. 8 mL/min，柱温30 °C，PDA检测波长200 600 nm ；流动相组合为流动相 A 0. 1% (ν/ν)磷酸水溶液，流动相B 0. 1% (ν/ν)磷酸乙腈溶液；梯度洗脱条件为1%Β等梯度洗脱(Tl. 5 min, 1% 4· 5%B递增线性洗脱1. 5 3. 0 min,4. 5%B等梯度洗脱3. 0 5· 0 min, 4. 5% 7. 0%B递增线性洗脱5. 0 6. 5 min, 7. 0%B等梯度洗脱6. 5 8. 5 min, 7. 0% 25. 0%B递增线性洗脱 8. 5 13. 73 min, 25. 0% 90. 0%B 递增线性洗脱 13. 73 14. 39 min, 90. 0% 1. 0%B 递减线性洗脱14. 4(Γ16. 39 min。采用Masslynx软件(4. 0版本)来控制整个HPLC系统和收集试验数据，用Masslynx软件的QuanLynx功能来处理试验数据。(4)由稀至浓依次将不同浓度的没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B标准工作液用上述高效液相色谱分析条件来检测，记录HPLC色谱图和峰面积，确定没食子酸、鞣花酸、安石榴甙A和安石榴甙B的检测波长、保留时间、检出限(L0D)、定量限(L0Q)、线性关系和相关系数、方法回收率和稳定性，建立4种多酚化合物的线性方程，每个项目测定3个平行样取平均值，所得结果见表1和2。
(5)取预处理过的石榴样品溶液，用0. 2 Mffl微孔滤膜过滤即得供试石榴样品溶液， 用上述高效液相色谱分析条件来检测，记录HPLC色谱图和峰面积，根据4种多酚化合物的线性方程，计算获得不同石榴样品中没食子酸、鞣花酸、安石榴甙A和安石榴甙B的含量。表1 4种多酚化合物的保留时间、检测波长、检出限(LOD)和定量限(LOQ)
权利要求
1.石榴中没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B的分析方法，其特征在于按照下述步骤进行(1)准确称取没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B标准品适量，依次用HPLC级水、NaOH溶液和甲醇溶解，混勻，配制成标准储备溶液，避光-18 °C保存；临用时，用HPLC级水、NaOH溶液和甲醇稀释上述标准储备溶液，配置成不同浓度的没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B标准工作液，避光-18 °C保存；(2)用HPLC级水、磷酸和乙腈来配制流动相A和B；(3)开启高效液相色谱系统，设定高效液相色谱分析条件；(4)由稀至浓依次将不同浓度的没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B标准工作液用上述高效液相色谱分析条件来检测，记录HPLC色谱图和峰面积，确定没食子酸、鞣花酸、安石榴甙A和安石榴甙B的检测波长、保留时间、检出限、定量限、线性关系和相关系数、方法回收率和稳定性，建立4种多酚化合物的线性方程；(5)将经过预处理的石榴样品溶液，用0.2 Mm微孔滤膜过滤即得供试石榴样品溶液；用上述高效液相色谱分析条件来检测，记录HPLC色谱图和峰面积，根据4种多酚化合物的线性方程，计算即获得不同石榴样品中没食子酸、鞣花酸、安石榴甙A和安石榴甙B的含量。
2.根据权利要求1所述得石榴中没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B的分析方法，其特征在于其中所述的步骤中(1)中安石榴甙A&B中含有51. 54%安石榴甙A和48. 46%安石榴甙B ； NaOH溶液的浓度为0. 06 mol/L ；标准储备溶液的浓度没食子酸为四9. 40mg/L,鞣花酸为 570. 00 mg/L，安石榴甙 A&B 为 1905. 36 mg/L。
3.根据权利要求1所述得石榴中没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B的分析方法，其特征在于其中所述的步骤中(3)中高效液相色谱分析条件为规格为100 mmX4.6 mm的 Kinetex 2. 6 Mm C18色谱柱，KrudKatcher Ultra在线过滤预柱，进样量10 μ ，流速1.8 mL/min,柱温30 V，PDA检测波长200 600 nm ；流动相组合为流动相A 体积比0. 1%磷酸水溶液，流动相B 体积比0. 1%磷酸乙腈溶液；梯度洗脱条件为1%B等梯度洗脱(Tl. 5 min, 1% 4. 5%B递增线性洗脱1. 5 3. 0 min，4. 5%B等梯度洗脱3. 0 5. 0 min，4. 5% 7. 0%B 递增线性洗脱5. 0 6· 5 min, 7. 0%B等梯度洗脱6. 5 8. 5 min, 7. 0% 25. 0%B递增线性洗脱 8. 5 13. 73 min, 25. 0% 90. 0%B递增线性洗脱13. 73 14. 39 min, 90. 0% 1. 0%B递减线性洗脱 14. 40 16. 39 min ；采用Masslynx软件来控制整个HPLC系统和收集试验数据，用Masslynx 软件的QuanLynx功能来处理试验数据。
4.权利要求1中石榴中没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B的分析方法的应用可用于包括石榴提取物、石榴汁或石榴饮料等多种石榴产品中4种多酚化合物——没食子酸、鞣花酸、安石榴甙A和安石榴甙B的分析检测。
全文摘要
本发明石榴中没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B的分析方法及应用，其特征在于采用高效液相色谱技术，通过优化HPLC分析条件一次性分离检出4种多酚化合物——没食子酸、鞣花酸、安石榴甙A和安石榴甙B，建立一种石榴中没食子酸、鞣花酸和安石榴甙A&B的高效液相色谱分析方法。可用于包括石榴提取物、石榴汁或石榴饮料等多种石榴产品中4种多酚化合物——没食子酸、鞣花酸、安石榴甙A和安石榴甙B的分析检测，用作检验石榴产品真伪的快速检测方法。本发明的方法快速简便、灵敏度高、回收率高、通用性强、线性相关性和稳定性良好。
文档编号G01N30/36GK102253154SQ201110105648
公开日2011年11月23日 申请日期2011年4月27日 优先权日2011年4月27日
发明者任晓锋, 曲文娟, 潘忠礼, 陈伟, 马海乐 申请人:江苏大学