多表位测定的制作方法

专利名称：多表位测定的制作方法
技术领域：
本发明涉及亲和力测定的领域。具体地，本发明涉及一种在亲和力测定中检测生物学靶标的方法以及生物学靶标的检测配置。
背景技术：
亲和力测定是测量溶液中的物质，分析物的存在或浓度的生物化学测试，所述溶液通常包含物质的复杂混合物，例如生物学液体，如血液、唾液、血清或尿。这样的测定基于给定分子或所述分子的特定部分如抗体以高特异性结合至一种或非常有限组的其他分子的能力。测定的特异性取决于分析物能够结合至其特异性结合伙伴以排除待分析的样品中的所有其他物质的程度。
除了需要特异性，必须选择对分析物具有足够高亲和力的结合伙伴以产生准确和可重复的测量，即可测量信号。在历史上，这通过测量一些物理特征如光散射的变化或折射率的变化来完成。通过现代仪器，这类方法再次越来越受欢迎。然而，现在的大多数免疫测定依赖于使用分析试剂以结合至分析物，所述分析试剂与可检测的标记相关。已证实各种标记，包括用于放射免疫测定的放射性元素；酶；荧光、磷光和化学发光染料；乳胶和磁性颗粒；染料微晶、金、银和硒胶体颗粒；金属螯合物；辅酶；电活性基团；寡核苷酸、稳定的自由基、聚合物等。这类标记用于分离游离和结合的标记试剂之后检测和定量结合事件，或者通过以结合事件影响标记产生的信号的变化这样的方式设计系统来检测和定量结合事件。
亲和力测定通常探测肽、蛋白、寡核苷酸、寡糖或小分子如适配体与固定的结合伙伴的相互作用。典型的结合伙伴包括蛋白，其可以为受体、酶或抗体，但是还包括多肽和多氨基酸(例如，镍结合位点的多His标签、酰胺或Schiff碱连接的多赖氨酸、硫醚连接的多半胱氨酸)。例如，基于固定方案的链霉亲和素广泛用于将生物素化的生物学元素连接至测定表面。
例如，亲和力测定可以进一步分类为竞争性和非竞争性测定。在竞争性亲和力测定中，生物学样品中的分析物与标记的分析物类似物竞争结合其伙伴。然后测量结合至伙伴的标记的分析物类似物的量。在这种方法中，反应信号与生物学样品中分析物的浓度成反比。这是因为反应信号越大，样品中越少分析物可用于与标记的分析物类似物竞争。
在非竞争性亲和力测定中，其也称为“夹心测定”，生物学样品中的分析物结合至其伙伴，然后标记试剂结合至所述分析物。然后测量位点上标记试剂的量。不像竞争性方法，非竞争性方法即夹心测定的结果直接与生物学样品中分析物的浓度成比例。这是因为如果生物学样品中不存在分析物，则标记试剂不会结合。
亲和力测定，特别是免疫测定广泛用作细菌、病毒、内分泌和寄生疾病的诊断工具以及滥用和慢性疾病状态的检测药物，一个实例是可以导致心脏病发作的心脏疾病。
各种技术如放射免疫测定、免疫过氧化物酶和ELISA目前用于亲和力测定，特别是免疫测定。然而，放射免疫测定具有需要使用危险和破坏环境的试剂的缺点。
此外，除了特异性，如上文所述，灵敏度对于测定性能是至关重要的。测定的灵敏CN 102947703 A书明说2/15 页度可以通过结合事件产生的特异性信号与系统的背景噪声相比的比例来定义。
降低信噪比(SNR)的因素包括试剂如抗体非特异性结合至测定的各种组分。此外，与测定的试剂如酶底物反应的测定基质的一些内源性组分的活性倾向于产生“假”反应产物，其干扰标记的复合物如标记的抗体_抗原复合物形成的“真正”产物的准确检测。
通常，将添加剂如封闭试剂加入测定基质以降低测定噪声并减少假阳性信号。发明内容
本发明的目的是提供一种与现有技术已知的亲和力测定相比具有更高信噪比的亲和力测定。
本发明的另一目的是提供这样的亲和力测定，其适合广泛的分析物。
具体地，本发明的目的是提供一种适合整合入医疗点或者台面、装置和微型化的亲和力测定。
本发明的另一目的是提供一种产生最少假阳性结果的快速和可靠的亲和力测定。
这些目的通过用独立权利要求所示的亲和力测定检测生物学样品中的生物学靶标的方法来实现。从属权利要求表明优选的实施方案。在这种上下文中值得注意的是，以下描述中给出的所有范围应当理解为它们包括限定这些范围的值。·


本发明的这些和其他方面参考下文所述的实施方案会清楚和阐明。
图I图示根据本发明将捕获的生物学靶标浓缩为小于生物学样品体积的洗脱体积以及检测和/或定量的进一步任选存在的步骤的一个实例。
图2图示根据本发明在亲和力测定中检测生物学靶标的方法的一个实例。
图3示出本发明怎样实现增加信噪比的目的的另一方面。
图4示出第一捕获部分的组织的实例。
图5示出合适的接头的模块设计的一些实例。
图6示出富集的3-表位亲和力测定的概念验证。
图7示出来自建立心肌肌钙蛋白-I (cTnl)和前列腺特异性抗原(PSA)的3_表位亲和力测定的初步实验的结果。
图8图示热切割然后竞争性亲和力测定的实例。
图9更详细地示出3-表位测定中的第一捕获部分不干扰检测。
图10示出捕获时间常数的确定。
图11示出步骤c)的评价，即对各种体积浓缩因素的生物学靶标浓缩的评价。
图12示出步骤c)的剂量反应曲线，即生物学靶标浓缩的剂量反应曲线。
具体实施方式
根据本发明，通过亲和力测定检测生物学样品中的生物学靶标的方法包括以下步骤
a)提供包含所述生物学靶标的生物学样品体积；
b)将第一捕获部分加入包含所述生物学靶标的生物学样品体积，其中所述第一捕5获部分粘附至颗粒；
c)将捕获的生物学靶标浓缩为小于步骤a)中的生物学样品体积的洗脱体积；
d)从所述颗粒切割所述第一捕获部分或所述生物学靶标；
e)以夹心或竞争性亲和力测定形式直接或间接检测和/或定量所述生物学靶标， 其中所述生物学靶标与至少一种捕获部分相关，优选与至少两种捕获部分相关。
这种亲和力测定具有这样的优势，将生物学靶标浓缩并去除可以干扰检测的因素，因此导致增加的特异性结合和减少的非特异性结合，从而导致测定的大大增加的信噪比和更高的灵敏度。
具体地，生物学靶标结合至第一捕获部分与生物学靶标的检测和/或定量分开是有益的。因此第一捕获部分的量与粘附的颗粒可以是大的，以便捕获尽可能多的生物学靶标，但是第一捕获部分与粘附的颗粒不干扰生物学靶标的检测和/或定量。例如，如果第一捕获部分与粘附至它们的大磁性颗粒用来捕获大体积的生物学靶标，例如生物学样品，其比较小的颗粒更易于驱动。因此，更易于从大体积(生物学样品)收集这些较 大的颗粒，并且将它们和结合的生物学靶标转移至较小的体积(洗脱体积)。
如本文所用，术语“生物学靶标”指待检测的生物学来源的物质。生物学靶标的非限制性实例为蛋白、肽、抗体、毒性物质、脂质、氨基酸、胺、信使或小分子、碳水化合物、细胞组分、病毒、细胞外基质的组分、细胞、细胞片段、核酸、半抗原和/或药物。
如本文所用，术语“亲和力测定”指测量生物学靶标的存在或浓度的生物化学测试，其基于捕获部分以高特异性结合至生物学靶标以及任选地结合至一种或非常有限组的其他分子的能力。
如本文所用，术语“生物学样品体积”指其中最初提供生物学靶标的体积或部分体积。
如本文所用，术语“捕获部分”指结合元件，例如这样的部分，其包含选择性结合至生物学靶标的表位的互补性决定区域并可以结合至至少一种其他实体如颗粒，并且可以具有与其相关的试剂。
在一优选实施方案中，捕获部分为抗体，例如动物抗体、人抗体、人嵌合抗体和人源化抗体及其片段，如Fab片段等，或者为适配体，或者为核酸或多肽或包含结合位点的任何物质。
如本文所用，术语“结合元件”指另一元件可以结合或关联的位点。在本发明的一优选实施方案中，结合位点为表位，即抗原决定簇，即被免疫系统，特别是抗体、B细胞或T 细胞识别的抗原部分。
适配体是结合至特异性祀分子的寡核酸(oligonucleic acid)或肽分子。适配体通常通过从大的随机序列池选择来产生，但是天然适配体还存在于核糖开关(riboswitch) 中。
如本文所用，术语“颗粒”指能够支持捕获部分的粘附的结构，例如珠。颗粒可以制备自琼脂糖、聚苯乙烯、乳胶、聚乙烯醇、硅。在一优选实施方案中，颗粒可以具有 5 μ m-o. I μ 的直径，更优选 I μ m-0. 3 μ m,即彡 O. 3、0· 4、0· 5、0· 6、0· 7、0· 8、0· 9 和 / 或 < I μ m0
如本文所用，术语“切割”指从颗粒分离捕获部分或者从捕获部分分离生物学靶标。
如本文所用，术语“粘附至”指捕获部分通过接头粘附至颗粒之一的情况。
如本文所用，术语“接头”指允许从颗粒分离第一捕获部分的结构。接头可以位于第一捕获部分上和/或颗粒中。例如，如果采用PH诱导的切割就可以是这样。或者，接头可以是偶联至捕获部分和/或颗粒的分离结构。
接头可以利用模块设计来构建；图5给出一些实例。原则上可以使用任何偶联(生物)化学(羧基、胺、sulfhydride、马来酰亚胺等)，优选互相不同。此外,接头应当包含可切割的实体。可切割的实体的实例和切割的方法包括但不限于
可以通过蛋白酶切割的肽(优选特异性氨基酸序列)；和/或
可以通过核酸酶切割的核酸序列(优选特异性序列/核酸酶)；和/或
光致断裂兀件(Photocleavableelement);和 / 或
温度诱导的切割；和/或
化学诱导的切割(例如S-S键的还原)；和/或
pH诱导的切割。
接头的实例为包含限制位点的合成DNA片段，但是接头的许多不同选择是可用的。
如本文所用，术语“相关”指物理关联。
如本文所用，术语“直接检测和/或定量”表示检测和/或定量生物学靶标本身。
如本文所用，术语“间接检测和/或定量”表示使用竞争性亲和力测定，其中不检测和/或定量生物学靶标本身，但是检测和/或定量与生物学靶标竞争步骤e)的至少一种捕获部分的实体，例如生物学靶标的类似物。
在一优选实施方案中，步骤e)中的至少一种捕获部分为检测表面的一部分。
如本文所用，术语“检测表面”指能够结合生物学靶标以及使得能够检测的表面。 为了本发明的目的，检测表面可以是生物的、非生物的、有机的、无机的或者它们的组合，并且可以为颗粒、链、沉淀、凝胶、片、管、球、容器、毛细管、垫、薄片、膜、玻片等的形式，具有任何方便的形状，包括圆盘、球形、圆形等，只要其允许检测结合的生物学靶标。
在这样的设定中，特别优选步骤e)中的至少一种捕获部分包含以这样的方式构建的生物化学分子或结构，其允许结合至支持物以及生物学靶标。这样的生物化学分子或结构的实例为核酸，优选多达200个碱基的DNA寡核苷酸，以及蛋白和半抗原如抗体或凝集素，其可以结合分子结构如DNA序列、抗体、抗原或酶。
步骤e)中的至少一种捕获部分还可以包含强结合物质如链霉亲和素。
如本文所用，术语“检测”指确定生物学靶标的物理存在和/或定量检测生物学靶标。
在一优选实施方案中，亲和力测定为免疫测定，即该测定利用抗体特异性结合分析物，即生物学靶标。这有利于可获得具有不同结合位点的不同抗体的良好选择的那些生物学靶标，因为抗体_抗原结合通常是高度特异性和非常灵敏的。
在另一优选实施方案中，步骤a)-d)顺序应用一次或多次。这是有利的，因为其允许更高地富集和/或纯化溶液中的生物学靶标。
此外，优选生物学靶标与步骤e)中的至少两种捕获部分相关，其中所述两种捕获部分中的一种为检测表面的一部分，而另一种使得能够在这种表面上检测。换句话说，生物学靶标直接结合至检测表面。
这种生物学靶标直接结合至检测表面的捕获部分具有这样的优势，检测和/或定量生物学靶标不需要额外的系列结合步骤。
在本发明的方法的另一优选实施方案中，在步骤e)中，第一捕获部分或第二捕获部分与另一捕获部分相关。
因此，如果第一捕获部分与生物学靶标一起从颗粒切割，第一捕获部分或其一部分可以用来结合至另一捕获部分。优选地，额外的捕获部分是检测表面的一部分。这样，生物学靶标间接结合至额外的捕获部分并因此结合至检测表面，从而使得能够检测(参见例如图3B)。
如本文所用，术语“间接结合”表示生物学靶标本身不结合至检测表面。取而代之， 第一捕获部分的一部分如第三实体或标签结合至检测表面(参见例如图3B和图3C)。
如果生物学靶标仅具有一个捕获部分可以结合的位点，则间接结合特别有利，因为在检测表面上的生物学靶标的重新捕获发生时这个位点已被第一捕获部分占据。
或者，无论第一捕获部分是否与生物学靶标一起从颗粒切割，第二捕获部分均可以结合至生物学靶标，并且这种第二捕获部分转而可以用来结合至另一捕获部分。因此同样地，如果额外的捕获部分是检测表面的一部分，则生物学靶标间接结合至额外的捕获部分并因此结合至检测表面，从而使得能够检测(参见例如图3C)。
在本发明的方法的另一优选实施方案中，在步骤e)中，生物学靶标与进一步的捕获部分相关。
因此在这个优选实施方案中，生物学靶标与至少3种捕获部分相关。例如，这些可以是与生物学靶标一起从颗粒切割的第一捕获部分以及两种额外的捕获部分，其中一种是检测表面的一部分，而另一种使得能够在这种表面上检测。换句话说，生物学靶标直接结合至检测表面(参见例如图3D)。
这种生物学靶标直接结合至检测表面的捕获部分具有这样的优势，检测和/或定量生物学靶标不需要额外的系列结合步骤。
此外，生物学靶标可以与4种捕获部分相关，如果第一捕获部分与生物学靶标一起从颗粒切割就可以是这样。可能来自生物学靶标的第二轮浓缩并在切割之后还保持连接至生物学靶标的第二捕获部分结合至第三捕获部分，其是检测表面的一部分，而第四捕获部分连接至颗粒，使得能够在这种检测表面上检测。第二部分可以通过DNA-接头结合至第三捕获部分，所述DNA-接头具有第三捕获部分识别的表位。
例如，如果检测表面的捕获部分即第三捕获部分与第二捕获部分之间的结合通过强结合物质介导，如生物素与链霉亲和素之间的相互作用，则这种配置是有利的。
在本发明的方法的另一优选实施方案中，试剂与至少一种捕获部分相关，或者在竞争性亲和力测定形式的情况下，与步骤e)中的生物学靶标的类似物相关。
如本文所用，术语“试剂”指使得能够在亲和力测定中检测生物学靶标和/或促进在亲和力测定中检测生物学靶标的物质。
如本文所用，术语“生物学靶标的类似物”指在竞争性亲和力测定中与生物学靶标竞争结合位点的物质。
包含这个额外步骤的亲和力测定是有利的，因为试剂可以是与本领域已知的公认的检测系统一起工作的许多物质中的任何一种。因此，无论测定的生物学靶标，实际的检测反应可以从多种已知的方法中选择。
如果亲和力测定包含这个额外步骤，如果接头包含间隔元件，这是有益的，因为检测表面与试剂之间的距离增加，这允许非特异性与特异性结合之间更好的区别。
优选地，所述试剂选自
放射性同位素；和/或
固相，例如磁珠或乳胶珠或检测表面；和/或
荧光、磷光和/或化学发光染料；和/或
酶和/或酶底物；和/或
核酸序列、肽；和/或
胶体或纳米颗粒；和/或
聚合物或大分子，例如树状聚体或脂质体。
在本发明的优选方法中，将捕获的生物学靶标浓缩为小于步骤a)中的生物学样品体积的第二体积通过磁性分离或重力来进行。
优选地，在浓缩步骤中，生物学样品体积以1:2-1:1000的比例减小，S卩1:2、1:3、 1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:100、1:200、1:500 和 / 或 1:1000。
此外，生物学样品体积优选具有I μ l-5ml的体积，即彡I μ 1,2 μ 1,3 μ 1,4 μ I, 5 μ 1、6μ 1、7μ 1、8μ 1、9μ 1、10μ 1、11μ 1、12μ 1、13μ 1、14μ 1、15μ 1、16μ 1、17μ I、 18 μ 1、19μ I >20 μ 1、21μ I >22 μ 1、23μ I >24 μ 1、25μ I、26 μ 1、27μ 1、28μ I、29 μ I、 30 μ 1,50 μ I、100 μ 1,300 μ 1,500 μ l、lml、3ml 和 / 或 5ml。
浓缩步骤之后的生物学样品体积，这里也称为洗脱体积，对于酶促洗脱可以高达例如5 μ L,而对于光化学洗脱可以高达例如15 μ L。
可用于浓缩步骤a)中的生物学靶标的两种方法磁性分离或重力是快速、可靠的技术。
在一可选实施方案中，生物学样品体积比生物学靶标比例的减小通过过滤来进行。在这种情况下，颗粒可以为His-标签，即由至少5个组氨酸(His)残基组成的氨基酸基序，并且过滤可以利用亲和介质如Ni Sepharose> NTA-琼脂糖、His60Ni、HisPur树脂或 Talon树脂来进行。
优选地，颗粒为磁性颗粒和/或超顺磁颗粒。这是有益的，因为磁性颗粒和/或超顺磁颗粒具有高表面比体积比例，并且磁性颗粒使得生物学样品体积比生物学靶标的比例能够通过磁性分离而减小。
例如，如果颗粒为磁性颗粒，则本发明的方法可以如下进行首先，将包含生物学靶标的生物学样品体积提供在第一室中。然后，加入粘附至磁性颗粒的第一捕获部分。在足够的生物学靶标与粘附至磁性颗粒的第一捕获部分之间的结合发生之后，利用磁力将捕获部分与生物学靶标转移至第二个较小的室，从而减小生物学样品体积比生物学靶标的比例。随后，从磁性颗粒切割第一捕获部分，并且将磁性颗粒从第二个较小的室去除。最后， 在检测表面上重新捕获生物学靶标，并且在检测表面上检测和/或定量生物学靶标。
利用这种方法，大量磁性颗粒可以用来分离和浓缩生物学样品体积内的生物学靶标而不干扰随后的检测步骤。
在本发明的另一优选方法中，从颗粒切割第一捕获部分通过酶促、热和/或光化学切割进行。
还可以平行或顺序(after each other)联合使用的每种不同的切割方法具有其特定优势。然而，所有切割方法均可以与亲和力测定联合使用，因为所有切割方法均引起最小干扰和流体的最小污染。可选方法，例如通过降低PH切割或化学诱导的切割如还原反应可以强烈影响生物学靶标的状态和构象，并且可以改变溶液的化学条件，从而强烈干扰随后的亲和力测定。虽然最后这两种方法均为简单的公知的从抗体洗脱分析物的方式，但是它们具有在过程中以后影响生物学靶标的亲和力测定的缺点。
例如酶促切割可以用于所有靶标，并且它是温和的过程，可以用于是蛋白的生物学靶标，因为它通常不变性蛋白。因此，本发明的方法对于浓缩即蛋白的富集特别有利，浓缩的进行通常非常具有挑战性，这是由于蛋白分子对温度的敏感性和缓冲制剂的变化。此外，酶促切割允许随后的免疫测定。使用DNA的优势是测定的性能可以通过在抗体结合以外的地方放置限制位点来增强。剩余的DNA接头可以用来增加最终测定上的检测信号。
切割的优选酶为DNase和EcoRl。对于优选实施方案，DNAse表现出比EcoRl更高的收率。可以使用任何特异性核酸酶，具有对DNA序列的最小影响。这里,在优选实施方案中，EcoRI用来显示系统可以是可适应的，并且还显示核酸检测方法的通用性。
热切割具有这样的优势，切割位点具有比酶促切割少的特异性要求，其特别适合可以耐受高温的生物学靶标，例如小分子。然而，如果小心不要使用可以变性蛋白的温度， 则还可以对是蛋白的生物学靶标进行热切割。
在热切割的情况下，从颗粒切割第一捕获部分的步骤可以被从第一捕获部分切割生物学靶标代替。然而，当然还可能将热切割位点构建入接头和/或第一捕获部分本身。
光化学切割是有益的，因为不需要加入其他底物，例如酶促反应的酶。关于将这种测定整合入紧凑型装置，光化学切割也表现出一些优势。
然而，用这种形式的切割，测定需要在允许光穿透的环境如暗盒(cartridge)中进行。
此外，优选的检测和/或定量方法选自
-光学检测,例如突光、磷光、化学发光、吸收、散射、成像、瞬逝场技术、受抑全内反射、表面等离子共振、拉曼、光谱学；和/或
-酶反应；和/或
-核酸扩增技术，例如免疫-PCR、滚环扩增；和/或
-磁性检测，例如通过磁致电阻、霍尔效应、线圈；和/或
-声波检测，例如表面声波、体声波、悬臂、石英晶体；和/或
-电检测，例如电导、阻抗、电流、氧化还原循环、电荷；和/或
-光磁检测。
一种光学检测技术为受抑全内反射(FTIR)。在正确的角度照明，通常反射击中传感器的活性表面下侧的光强度没有任何损失，这是全内反射。然而，当纳米颗粒结合至表面的对侧时，它们散射并吸收光，减少反射光束的强度。通过传感器检测对应于结合的纳米颗CN 102947703 A书明说8/15 页粒的数量的反射光束的这些强度变化，例如与数码相机中使用的相似的CMOS图像传感器。 这是FTIR。
各种合适的酶反应如辣根过氧化物酶是本领域公知的。
免疫-PCR为抗原检测系统，其中特异性DNA分子用作标记，并且PCR用来检测这种标记。
如果试剂为磁性颗粒，检测的优选方法为FTIR，因为其可靠、快速，并且可以在小体积中工作。
在本发明的方法的一优选实施方案中，切割为酶促的，试剂为磁珠，并且生物学靶标与进一步的捕获部分相关。
在另一优选实施方案中，生物学靶标结合至第一捕获部分、第二捕获部分和第三捕获部分全部通过生物学靶标上的结合位点进行。
在这样的情况下，生物学靶标上的3个结合位点被与试剂相关的第一捕获部分、 第二捕获部分以及第三捕获部分占据，所述第三捕获部分优选为检测表面的一部分。
本发明的发明人令人惊讶地发现虽然生物学靶标上的2个结合位点已被占据，靶标仍然可以通过第三结合位点直接结合至检测表面。换句话说，已结合的元件不空间上阻碍生物学靶分子的检测，即使在磁珠作为试剂，第二捕获部分试剂复合物非常大的情况下也是如此。
在另一优选实施方案中，生物学靶标结合至第一捕获部分、第二捕获部分和第三捕获部分全部通过结合至表位进行，即结合至生物学靶标的抗原决定簇。
这种“3-表位_测定”是有利的，因为其具有高特异性，这是由于结合至生物学靶标的3个抗原决定簇。此外，由于从颗粒酶促切割第一捕获部分，生物学靶标在空间上对于试剂相关的第二捕获部分非常易于接近，并且直接结合至检测表面。
在一可选实施方案中，提供生物学靶标的检测配置，其包含第一、第二和第三捕获部分，其中试剂与第二和/或第三捕获部分相关，并且生物学靶标直接结合至所有三个捕获部分，从而使得能够检测。
在这种检测配置的一优选实施方案中，生物学靶标通过表位结合至所有捕获部分。
在另一可选实施方案中，提供捕获部分，其包含
a)用于附着至颗粒的第一实体，
b)用于切割对颗粒的附着的第二实体，以及
c)用于附着至检测表面的第三实体。
优选地，权利要求13的捕获部分在权利要求1-10中任一项的方法中用作第一捕获部分。
因此，当使用这个实施方案时，第一捕获部分结合至生物学靶标，并且与生物学靶标一起从颗粒切割。
优选地，检测表面包含进一步的捕获部分。
与上述3-表位测定相反，结合至检测表面是间接的，因为第三实体结合至检测表面而不是生物学靶标。
在这种情况下，如果接头包含间隔是有益的，因为这增加检测表面上第三实体的11结合面积。具体地，间隔增加在检测表面上找到结合位置的面积，因为其中第三实体可以成功地结合更多方向或空间。
一般来说，可以研究本发明的方法的步骤b)期间发生的第一捕获反应作为时间和颗粒浓度的函数。步骤b)期间发生的第一捕获部分与生物学靶标之间的相互作用可以模拟为一阶速率表达式及之后的重排；捕获效率(ε capt)如下
权利要求
1.一种在亲和力测定中检测生物学靶标的方法，所述方法包括以下步骤a)提供包含所述生物学靶标的生物学样品体积；b)将第一捕获部分加入包含所述生物学靶标的生物学样品体积，其中所述第一捕获部分粘附至颗粒；c)将捕获的生物学靶标浓缩为小于步骤a)中的生物学样品体积的洗脱体积；d)从所述颗粒切割所述第一捕获部分或所述生物学靶标；e)以夹心或竞争性亲和力测定形式直接或间接检测和/或定量所述生物学靶标，其中所述生物学靶标与至少一种捕获部分相关，优选与至少两种捕获部分相关。
2.如权利要求I所述的方法，其中在步骤e)中，所述第一捕获部分或第二捕获部分与另一捕获部分相关。
3.如权利要求I或2所述的方法，其中在步骤e)中，所述生物学靶标与进一步的捕获部分相关。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤e)中，试剂与至少一种捕获部分相关，或者在竞争性亲和力测定形式的情况下，与所述生物学靶标的类似物相关。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述试剂选自放射性同位素；和/或固相，例如磁珠或乳胶珠或检测表面；和/或荧光、磷光和/或化学发光染料；和/或酶和/或酶底物；和/或核酸序列、肽；和/或胶体或纳米颗粒；和/或聚合物或大分子，例如树状聚体或脂质体。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述捕获的生物学靶标浓缩为小于步骤a)中的生物学样品体积的洗脱体积通过磁性分离或重力来进行。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述颗粒为磁性颗粒。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中从所述颗粒切割所述第一捕获部分或所述生物学靶标通过酶促、热和/或光化学切割进行。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测和/或定量方法选自-光学检测，例如荧光、磷光、化学发光、吸收、散射、成像、瞬逝场技术、FTIR、表面等离子共振、拉曼、光谱学；和/或 _酶反应；和/或-核酸扩增技术，例如免疫-PCR、滚环扩增；和/或 -磁性检测，例如通过磁致电阻、霍尔效应、线圈；和/或 -声波检测，例如表面声波、体声波、悬臂、石英晶体；和/或 -电检测，例如电导、阻抗、电流、氧化还原循环、电荷。
10.如权利要求3-9中任一项所述的方法，其中所述切割是酶促的，所述试剂为磁珠， 并且所述生物学靶标与进一步的捕获部分相关。
11.一种生物学靶标的检测配置，其包括生物学靶标，第一、第二和第三捕获部分，其中试剂与第二和/或第三捕获部分相关，并且所述生物学靶标直接结合至所有三个捕获部分，从而使得能够检测。
12.如权利要求11所述的检测配置，其中所述生物学靶标通过表位结合至所有捕获部分。
13.—种用于如权利要求1-10所述的方法的捕获部分,其包含a)用于附着至颗粒的第一实体(404)，b)用于切割对颗粒的附着的第二实体(406)，以及c)用于附着至检测表面的第三实体(407)。
14.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中加入所述生物学样品体积的第一捕获部分包含a)用于附着至颗粒的第一实体(404)，b)用于切割对颗粒的附着的第二实体(406)，以及c)用于附着至检测表面的第三实体(407)。
全文摘要
本发明涉及一种在亲和力测定中检测生物学靶标的方法，所述方法包括以下步骤提供包含所述生物学靶标的生物学样品体积；将第一捕获部分加入包含所述生物学靶标的生物学样品体积，其中所述第一捕获部分粘附至颗粒；将捕获的生物学靶标浓缩为小于步骤a)中的生物学样品体积的洗脱体积；从所述颗粒切割所述第一捕获部分或所述生物学靶标以及以夹心或竞争性亲和力测定形式直接或间接检测和/或定量所述生物学靶标，其中所述生物学靶标与至少一种捕获部分相关，优选与至少两种捕获部分相关。
文档编号G01N33/543GK102947703SQ201180029393
公开日2013年2月27日 申请日期2011年6月14日 优先权日2010年6月17日
发明者G·萨瓦特, M·W·J·普林斯, T·H·埃弗斯, W·M·哈德曼, J·G·奥塞尔 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司