专利名称：一种基于薄膜纤维材料微流控芯片的细胞分析技术的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及薄膜纤维材料的微流控芯片技术领域，特别提供了一种基于薄膜纤维材料微流控芯片的细胞分析技术。
背景技术：
微流控芯片实验室作为本世纪一项重要的科学技术已经在包括化学、生物学、医学等多个领域展现了其独特的优势，更因其同细胞尺寸匹配、环境同生理环境相近、传热传质快、通量高可以集成等特点而成为新一代细胞研究的重要平台，随着近二十年的发展，基于微流控芯片系统的细胞研究已经有所突破，同细胞相关的多种应用型研究已经开始在芯片领域出现，其中细胞分析技术成为其中备受关注的重要分支研究。现有阶段的基于微流控芯片的细胞分析平台大多是利用同生物相容性好的PDMS硅胶材料作为芯片材料，利用软刻蚀技术形成微通道实现芯片内的细胞培养和各种生物物理、生物化学刺激以便得到在不同细胞外微环境下细胞的行为变化，诸如存活、增殖、凋亡、分化等。随着微流控芯片制造技术的不断发展，除了·上述利用PDMS硅胶作为材料的芯片外，利用纸制品、纤维素膜等薄膜纤维材料构建新型的微流控“纸”芯片，因其具有工艺简单，价格低廉、携带方便等多种优势逐渐成为微流控芯片制造领域的重要研究方面，特别是将其用于更为广阔的细胞研究成为近期的热点研究问题之一。而利用该种新型微流控“纸”芯片进行细胞分析还处于空白阶段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于薄膜纤维材料微流控芯片的细胞分析技术。本发明提供了一种基于薄膜纤维材料微流控芯片的细胞分析技术，该技术主要包括三个基本方面:第一个基本方面是薄膜纤维材料微流控芯片的制作技术，第二个基本方面是薄膜纤维材料微流控芯片的无菌处理技术与表面修饰，第三个基本方面是薄膜纤维材料微流控芯片的细胞培养、刺激与分析评价。本发明提供的基于薄膜纤维材料微流控芯片的细胞分析技术，该技术具体说是利用喷蜡打印机在纸、硝酸纤维素膜上进行蜡打印，使其表面形成图案化微流控通道图案，经过一系列无菌处理后在其上进行细胞培养，并给予细胞不同药物配伍的药物进行刺激，利用细胞学常用的检测方法对细胞的各种行为进行分析。本发明以喷蜡打印机为主要加工器械，以纸、硝酸纤维素膜为芯片制作材料，利用喷蜡打印的方法在纤维薄膜材料表面形成亲疏水性质不同的图案，并进行细胞培养、药物刺激、生物学检测等。该微流控芯片制作方法适用于多种纤维薄膜材料，方法简单易操作，图案样式灵化，制备后的“纸”芯片易于无菌消毒处理，可用于多种细胞的培养与多种药物的刺激，具有一定的普适性。此外，在细胞试验过程中，由于微流控芯片本身所具有的特点，还具有细胞及试剂消耗量低等优势。本发明提供的基于薄膜纤维材料微流控芯片的细胞分析技术，所述薄膜纤维材料微流控芯片的制作技术为利用喷蜡打印机将图案印染在选定的薄膜纤维材料上。所述的薄膜纤维材料为打印纸、滤纸、纤维素膜、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜中的一种或多种。所述的图案可利用制图软件按照预设样式进行绘图，可用的制图软件为Auto Computer AidedDesign (AutoCAD)、Macromedia Freehands CorelDRAW 中的一种或多种。本发明提供的基于薄膜纤维材料微流控芯片的细胞分析技术，所述薄膜纤维材料微流控芯片的无菌处理技术与表面修饰中的无菌处理技术包括紫外光照对薄膜材料两面进行照射消毒、臭氧消毒、根据材料本身性质不同也可进行高压灭菌。所述薄膜纤维材料微流控芯片的无菌处理技术与表面修饰中的表面修饰为细胞贴附的薄膜纤维材料可被涂覆修饰，修饰方法为直接浸泡入可用于增加细胞贴附的试剂；其中可用于增加细胞贴附的试剂为以下试剂的一种或多种:一型胶原、二型胶原、四型胶原、层粘蛋白、纤维粘连蛋白、明胶。本发明提供的基于薄膜纤维材料微流控芯片的细胞分析技术，所述薄膜纤维材料微流控芯片的细胞培养、刺激与分析评价为先对进行过表面修饰的薄膜微芯片进行清洗，然后根据所选用的细胞类型采用相应的细胞培养基对薄膜微芯片进行浸泡，最后采用生物学上常用的细胞检测手段对药物刺激后的细胞进行检测。所述清洗所使用的溶液为无菌水、PBS、Hanks溶液中的一种或多种。所述细胞类型为肿瘤细胞、正常细胞、干细胞中的一种。所述细胞培养基为高糖DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)培养基、低糖DMEM培养基、1640培养基、Alpha-MEM培养基、DMEM/F12培养基中的一种。所述细胞检测手段包括细胞死活标记染色、免疫荧光染色、PCR检测、蛋白质检测。本发明的优点是提供一种新型的基于薄膜纤维材料微流控芯片的细胞分析技术，其操作简便，成本低廉，试剂及细胞消耗量低，是一种可广泛用于各种细胞分析的新技术。
图1为硝酸纤维素膜材料微流控芯片示意图；图2为打印纸材料微流控芯片示意图；图3为薄膜纤维材料微流控芯片细胞显微照片，其中，1:ACCM人涎样囊性癌细胞，2 =GES人正常胃粘膜细胞，3:MSC小鼠骨髓间充质干细胞；图4为薄膜纤维材料微流控芯片细胞药物刺激后荧光照片；图5为薄膜纤维材料微流控芯片间充质干细胞分化图片，其中，1:成骨ALP染色结果，2:成脂肪Oi1-Red O染色结果。
具体实施例方式按照图1所示在电脑上用Freehand软件进行绘图，利用喷蜡打印机将该图案打印于硝酸纤维素薄膜上，将该图案剪裁为22*22毫米大小的方块并置于无菌6-孔板中，在无菌台内紫外双面照射各12小时。用水配制10微克/毫升一型胶原溶液，并将其加入孔板中，使硝酸纤维素膜完全浸泡在其中，放置于37度培养箱中2个小时。用无菌PBS冲洗硝酸纤维素膜三次，静置。加入2毫升1640培养基于孔板中，使硝酸纤维素膜完全浸没，置于37度培养箱中备用。取长势良好的ACCM人涎样囊性癌细胞进行消化、传代处理，按照没孔IX IO5个/mL细胞将其接种 于备用的硝酸纤维素膜上，放入细胞培养箱，待24小时后细胞完全帖附，如图3所示。换用含有药物的条件培养基，条件培养基为分别含有O微摩尔每升、I微摩尔每升、5微摩尔每升的放射菌素D，药物作用24小时后进行细胞死活染色，细胞凋亡染色。采用罗丹明123、DAP1、PI三种物质的染色，分别确定细胞线粒体膜电位、核大小、细胞死亡三种情况，以确定ACCM细胞的凋亡情况，如图4所示。实施例1利用实验室自行设计并制作的微流控芯片，构型如图1所示。采用一型胶原进行表面修饰后芯片接种ACCM细胞，接种密度I X IO5个/mL，24小时细胞贴壁之后换用含O微摩尔每升、I微摩尔每升、5微摩尔每升的放射菌素D的1640培养基，24小时之后细胞死活、凋亡等方面的相关染色，显微镜拍照，Image Pro软件分析。其结果如图3所示。实施例2利用实验室自行设计并制作的微流控芯片系统，构型如图2所示。采用层粘蛋白修饰后芯片接种GES，接种密度I X IO5个/mL，24小时细胞贴壁之后换用含O微摩尔每升、
I微摩尔每升、5微摩尔每升的放射菌素D的高糖DMEM培养基，24小时之后对细胞死活、凋亡等方面进行染色，显微镜拍照，Image Pro软件分析。实施例3利用实验室自行设计并制作的 微流控芯片系统，构型如图1所示。芯片接种小鼠骨髓间充质干细胞，接种密度I X IO5个/mL，24小时细胞贴壁之后换用多种配伍的LG-DMEM+10%FBS+1 μ M地塞米松+胰岛素成脂肪诱导分化培养基，每天换液，7天之后成脂肪Oil Red染色，显微镜拍照，Image Pro软件分析。其结果如图5所示，间充质干细胞发生了不同情况的成脂肪、成骨分化。实施例4胚胎干细胞:利用实验室自行设计并制作的微流控芯片系统，其俯视图如图2所示。芯片接种小鼠胚胎干细胞，接种密度I X IO5个/mL，24小时细胞贴壁之后，每天换液，并施加不同时间的多种药物刺激，分别为有道神经分化、诱导骨分化、诱导脂肪分化的条件诱导分化剂，刺激7天之后可检测到胚胎干细胞的分化情况，比如成骨分化、成神经分化、成脂肪细胞分化等。
权利要求
1.一种基于薄膜纤维材料微流控芯片的细胞分析技术，其特征在于该技术主要包括三个基本方面第一个基本方面是薄膜纤维材料微流控芯片的制作技术，第二个基本方面是薄膜纤维材料微流控芯片的无菌处理技术与表面修饰，第三个基本方面是薄膜纤维材料微流控芯片的细胞培养、刺激与分析评价。
2.按照权利要求I所述基于薄膜纤维材料微流控芯片的细胞分析技术，其特征在于所述薄膜纤维材料微流控芯片的制作技术为利用喷蜡打印机将图案印染在选定的薄膜纤维材料上。
3.按照权利要求2所述基于薄膜纤维材料微流控芯片的细胞分析技术，其特征在于所述的薄膜纤维材料为打印纸、滤纸、纤维素膜、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜中的一种或多种。
4.按照权利要求2所述基于薄膜纤维材料微流控芯片的细胞分析技术，其特征在于所述的图案可利用制图软件按照预设样式进行绘图，可用的制图软件为AutoCAD、Freehand、CorelDRAW 中的一种或多种。
5.按照权利要求I所述基于薄膜纤维材料微流控芯片的细胞分析技术，其特征在于所述薄膜纤维材料微流控芯片的无菌处理技术与表面修饰中的无菌处理技术包括紫外光照射消毒、臭氧消毒、高压灭菌。
6.按照权利要求I所述基于薄膜纤维材料微流控芯片的细胞分析技术，其特征在于 所述薄膜纤维材料微流控芯片的无菌处理技术与表面修饰中的表面修饰为将薄膜纤维材料直接浸泡入可用于增加细胞贴附的试剂中；其中可用于增加细胞贴附的试剂为以下试剂的一种或多种一型胶原、二型胶原、四型胶原、层粘蛋白、纤维粘连蛋白、明胶。
7.按照权利要求I所述基于薄膜纤维材料微流控芯片的细胞分析技术，其特征在于所述薄膜纤维材料微流控芯片的细胞培养、刺激与分析评价为先对进行过表面修饰的薄膜微芯片进行清洗，然后根据所选用的细胞类型采用相应的细胞培养基对薄膜微芯片进行浸泡，最后采用生物学上常用的细胞检测手段对药物刺激后的细胞进行检测。
8.按照权利要求7所述基于薄膜纤维材料微流控芯片的细胞分析技术，其特征在于所述的清洗所使用的溶液为无菌水、PBS、Hanks溶液中的一种或多种。
9.按照权利要求7所述基于薄膜纤维材料微流控芯片的细胞分析技术，其特征在于所述细胞类型为肿瘤细胞、正常细胞、干细胞中的一种。
10.按照权利要求7所述基于薄膜纤维材料微流控芯片的细胞分析技术，其特征在于所述细胞检测手段包括细胞死活标记染色、免疫荧光染色、PCR检测、蛋白质检测。
全文摘要
本发明提供了一种基于薄膜纤维材料微流控芯片的细胞分析技术，该技术主要包括三个基本方面第一个基本方面是薄膜纤维材料微流控芯片的制作技术，第二个是薄膜纤维材料微流控芯片的无菌处理技术与表面修饰，第三个是薄膜纤维材料微流控芯片的细胞培养、刺激与分析评价；本发明具有操作简便，成本低廉，试剂及细胞消耗量低等优点，是一种可广泛用于各种细胞分析的新技术。
文档编号G01N33/68GK103255195SQ201210037430
公开日2013年8月21日 申请日期2012年2月20日 优先权日2012年2月20日
发明者秦建华, 高兴华, 张敏, 张旭, 马慧朋 申请人:中国科学院大连化学物理研究所