专利名称：一种小球藻蛋白分子制备及鉴定方法
技术领域：
本发明属于生物制药、保健食品的制备与鉴定。特别涉及一种小球藻蛋白分子制备及鉴定方法。
背景技术：
目前已有的蛋白分子制备是(一 )分离纯化蛋白分子的技术流程I.材料的预处理及细胞破碎
主要的方法有①机械破碎法利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等；②渗透破碎法在低渗条件使细胞溶胀而破碎；③反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破；④超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎；⑤酶法用溶菌酶破坏微生物细胞等。2.蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂(十二烧基磺酸钠、tritonX-100等)，使膜结构破坏,利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。3.蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的方法有①等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性；③有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度；④样品的进一步分离纯化。用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。(二)小球藻蛋白分子的分离纯化鉴定I.基于小球藻蛋白的温度敏感性，在分离提纯小球藻蛋白质时，要保证蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以采用合适的方法将藻细胞破碎非常关键；2.传统方法没有涉及到分离纯化后蛋白分子的化学结构的鉴定，明确蛋白分子的具体化学结构对于下一步人工合成和应用功能蛋白至关重要。
发明内容
本发明的目的是解决传统技术中蛋白分子分离纯化和鉴定中存在的问题，提供一种小球藻蛋白质分子制备及鉴定方法，为小球藻功能蛋白的人工合成和在医药保健方面的应用提供技术支撑。本发明的内容将小球藻泥悬浮于pH 7. O的O. OOlmol/L磷酸缓冲液(PBS)中，反复冻融3次；冰浴中超声波破碎9min ;在温度4°C条件下，采用12000r/min离心30min,取上清液,加 30 %饱和度硫酸铵；在温度4°C条件下静置24h，再在温度4°C条件下，采用12000r/min离心30min ;将上清液用超滤杯浓缩至200mL，沉淀用少量PBS溶解，置入透析膜于pH 7. O的O. OOlmol/LPBS中搅拌透析2d，聚乙二醇-6000包埋浓缩至60mL ；经硅胶柱层析将代谢产物干法拌硅胶后通过硅胶柱层析进行粗分离，洗脱液依次为石油醚、体积比I : I的石油醚二氯甲烷(V/V)、体积比I : 2的石油醚二氯甲烷(I 2，V/V)、二氯甲烷、体积比5 I的二氯甲烷甲醇(5 1，V/V)、体积比5 3的二氯甲烷甲醇(5 3，V/V)、体积比I : I的二氯甲烷甲醇(I 1，V/V)、甲醇、体积比I I 的甲醇水(I 1，V/V)；再经TLC薄板层析TLC薄板层析使用硅胶铝板，展层剂采用二氯甲烷和甲醇不同体积(V/V)配比的溶剂，样品展层后在254nm的紫外照射下，用5ml浓硫酸溶解于IOOml乙醇中的5%硫酸喷洒后，在温度100°C条件下加热5min，进行检测；具有相同展层斑点的分离相合并，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定，Bradford法测定蛋白含量；高效液相色谱HPLC纯化纯度检测采用双泵系统，流动相采用去离子水和甲醇，以不同体积(V/V)配比的溶剂洗脱，使用系列电子光电管检测器(DAD)检测；HPLC/ESI-Q-q-TOF-MS 测定纯化的蛋白分子的分子量用 HPLC/ESI-Q-q-TOF-MS进行测定，测定条件为电喷雾离子源ESI正离子模式poshive mode ;扫描范围100-1000 毛细管电压3. 5KV ;喷雾气压0. 278Mpa(45psi);干燥器流速12. 0L/min ;气体温度3500C ;裂解电压200V ;锥孔电压60V ;破碎电压100V ;参比溶液121. 0509,922. 0098 ；分辨率 9500 ±500 (922. 0098)；NMR测定纯化的蛋白样品溶解于氣代丙酮中，NMRt1H, 13C, homonuclearcorrelation spectroscopy(COPY), heteronuclear single quantum coherencespectroscopy (HSQC), 和 heteronuclear multiple bond correlationspectroscopy (HMBC)]用BRUKER核磁共振仪测定，测定1H在400Hz条件下操作，测定13C在IOOMz 条件下操作，tetramethylsiane (TMS)作为内标。本发明的特点优点采用本方法分离小球藻的纯化蛋白分子，蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。能准确地明确蛋白分子的具体化学结构。
具体实施例方式将小球藻泥悬浮于pH 7. O的0. 001mol/L磷酸缓冲液(PBS)中，反复冻融3次；冰浴中超声波破碎9min ;在温度4°C条件下，采用12000r/min离心30min,取上清液,加30%饱和度硫酸铵；在温度4°C条件下静置24h，再在温度4°C条件下，采用12000r/min离心30min ;将上清液用超滤杯浓缩至200mL，沉淀用少量PBS溶解，置入透析膜于pH 7. O的
O.OOlmol/LPBS中搅拌透析2d，聚乙二醇-6000包埋浓缩至60mL ；经硅胶柱层析将代谢产物干法拌硅胶后通过硅胶柱层析进行粗分离，洗脱液依次为石油醚、体积比I : I的石油醚二氯甲烷(V/V)、体积比I : 2的石油醚二氯甲烷(I 2，V/V)、二氯甲烷、体积比5 I的二氯甲烷甲醇(5 1，V/V)、体积比5 3的二氯甲烷甲醇(5 3，V/V)、体积比I : I的二氯甲烷甲醇(I 1，V/V)、甲醇、体积比I I 的甲醇水(I I, V/V)； 再经TLC薄板层析TLC薄板层析使用硅胶铝板，展层剂采用二氯甲烷和甲醇不同体积(V/V)配比的溶剂，样品展层后在254nm的紫外照射下，用5ml浓硫酸溶解于IOOml乙醇中的5%硫酸喷洒后，在温度100°C条件下加热5min，进行检测；具有相同展层斑点的分离相合并，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定，Bradford法测定蛋白含量；高效液相色谱HPLC纯化纯度检测采用双泵系统，流动相采用去离子水和甲醇，以不同体积(V/V)配比的溶剂洗脱，使用系列电子光电管检测器(DAD)检测；HPLC/ESI-Q-q-TOF-MS 测定纯化的蛋白分子的分子量用 HPLC/ESI-Q-q-TOF-MS进行测定，测定条件为电喷雾离子源ESI正离子模式poshive mode ;扫描范围100-1000 毛细管电压3. 5KV ;喷雾气压0. 278Mpa(45psi);干燥器流速12. 0L/min ;气体温度3500C ;裂解电压200V ;锥孔电压60V ;破碎电压100V ;参比溶液121. 0509,922. 0098 ；分辨率 9500 ± 500 (922. 0098)；NMR测定纯化的蛋白样品溶解于氣代丙酮中，NMRt1H, 13C, homonuclearcorrelationspectroscopy (COPY), heteronuclear single quantum coherencespectroscopy (HSQC), 和 heteronuclear multiple bond correlationspectroscopy (HMBC)]用BRUKER核磁共振仪测定，测定1H在400Hz条件下操作，测定13C在IOOMz 条件下操作，tetramethylsiane (TMS)作为内标。
权利要求
1.一种小球藻蛋白分子制备方法，其特征在于 将小球藻泥悬浮于PH 7.0的0.001!1101/1磷酸缓冲液( 85)中，反复冻融3次；冰浴中超声波破碎9min ;在温度4°C条件下，采用12000r/min离心30min，取上清液，加30%饱和度硫酸铵；在温度4°C条件下静置24h，再在温度4°C条件下，采用12000r/min离心30min ；将上清液用超滤杯浓缩至200mL，沉淀用少量PBS溶解，置入透析膜于pH 7. O的O. OOlmol/L PBS中搅拌透析2d，聚乙二醇-6000包埋浓缩至60mL ； 经硅胶柱层析将代谢产物干法拌硅胶后通过硅胶柱层析进行粗分离，洗脱液依次为石油醚、体积比I : I的石油醚二氯甲烷、体积比I : 2的石油醚二氯甲烷、二氯甲烷、体积比5 I的二氯甲烷甲醇、体积比5 3的二氯甲烷甲醇、体积比I : I的二氯甲烷甲醇、甲醇、体积比I : I的甲醇水； 再经TLC薄板层析TLC薄板层析使用硅胶铝板，展层剂采用二氯甲烷和甲醇不同体积(V/V)配比的溶剂，样品展层后在254nm的紫外照射下，用5ml浓硫酸溶解于IOOml乙醇中的5%硫酸喷洒后，在温度100°C条件下加热5min，进行检测；具有相同展层斑点的分离相合并，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定，Bradford法测定蛋白含量。
2.—种小球藻蛋白分子检测方法，其特征在于 高效液相色谱HPLC纯化纯度检测采用双泵系统，流动相采用去离子水和甲醇，以不同体积(V/V)配比的溶剂洗脱，使用系列电子光电管检测器(DAD)检测； HPLC/ESI -Q-q-TOF-MS测定纯化的蛋白分子的分子量用HPLC/ESI-Q-q-TOF-MS进行测定，测定条件为电喷雾离子源ESI正离子模式poshive mode ;扫描范围100-1000 :毛细管电压3. 5KV ;喷雾气压0. 278Mpa(45psi);干燥器流速12. 0L/min ;气体温度350°C ；裂解电压200V ;锥孔电压60V ;破碎电压100V ;参比溶液121. 0509,922. 0098 ;分辨率.9500 ±500 (922. 0098)； NMR测定纯化的蛋白样品溶解于氣代丙酮中，NMRt1H, 13C, homonuclear correlationspectroscopy (COPY), heteronuclear single quantum coherence spectroscopy (HSQC),和 heteronuclear multiple bond correlation spectroscopy (HMBC)]用 BRUKER核磁共振仪测定，测定1H在400Hz条件下操作，测定13C在IOOMz条件下操作，tetramethylsiane (TMS)作为内标。
全文摘要
一种小球藻蛋白分子制备及鉴定方法将小球藻泥悬浮于pH 7.0的0.001mol/L磷酸缓冲液中，反复冻融3次；冰浴中超声波破碎9min；在温度4℃下，采用12000r/min离心30min，取上清液，加30％饱和度硫酸铵；在温度4℃下静置24h，再在温度4℃下，采用12000r/min离心30min；将上清液用超滤杯浓缩至200mL，沉淀用少量PBS溶解，置入透析膜于pH 7.0的0.001mol/L PBS中搅拌透析2d，聚乙二醇-6000包埋浓缩至60mL。采用本方法分离小球藻的纯化蛋白分子，蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。能准确地明确蛋白分子的具体化学结构。
文档编号G01N24/08GK102675435SQ20121011537
公开日2012年9月19日 申请日期2012年4月19日 优先权日2012年4月19日
发明者乔秀亭, 何家瑞, 周文礼, 孙金辉, 毕相东, 毛海涛, 王庆奎, 邢克智, 陈成勋, 韩鈺松 申请人:天津农学院, 天津海友佳音生物科技股份有限公司