专利名称：一种快速高效测定葡萄酒中黄烷醇的方法
技术领域：
一种快速高效测定葡萄酒中黄烷醇的方法，具体涉及到采用超高效液相色谱(UPLC)技术分析葡萄酒中黄烷醇的方法，属于葡萄酒风味物质分析技术领域。
背景技术：
黄烷醇类物质是葡萄酒中一类重要的酚类化合物，黄烷醇具有极强的抗氧化能力，从而具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗血栓、抗自由基、心血管保护等多种生理保健功能。黄烷醇与葡萄酒的品质同样具有密切的关系，研究表明，葡萄酒中的黄烷醇能够影响葡萄酒的许多感官特征，如颜色、苦味、收敛性等等。因此，建立一种简单、快速、准确分离和测定葡萄酒中黄烷醇的分析方法，对于葡萄酒中黄烷醇的进一步研究有着重要的意义。
黄烷醇均具有共同的母核，即2-苯基氧杂萘。其结构相似、分子量相近、极性相 仿，这使得分离十分困难。再加上葡萄酒中其它多酚物质非常多，干扰大，使得黄烷醇单体分离及测定非常困难。长期以来，形成了许多种测定方法。早期黄烷醇多采用化学比色法测定，但由于这类试剂不仅仅与黄烷醇类发生反应，因而在没有结合较好的前处理分离技术的前提下，所得数据是不可靠的。随着分离技术的发展，高效液相色谱(HPLC)法成为测定样品中黄烷醇的首选方法。许多学者利用HPLC对食品中的黄烷醇进行了测定。同时，为了减少或消除其它酚类物质对测定的干扰，多首先利用色谱柱，如聚酰胺柱、C18 Sep-Pak柱等对样品进行分离，或对提取方法加以改进后，采用HPLC法对其进行定量分析。但利用HPLC检测葡萄酒中黄烷醇仍存在检测时间长，前处理复杂等缺点。目前基于HPLC的黄烷醇测定方法并不能快速高效的对葡萄酒中黄烷醇进行定性和定量分析。
发明内容
本发明的目的是为解决现有的黄烷醇测定方法存在成本高，前处理复杂等问题，提供了一种利用超高效液相色谱仪对葡萄酒中黄烷醇进行定性、定量分析的方法。本发明的技术方案一种快速高效测定葡萄酒中黄烷醇的方法，利用超高效液相色谱UPLC和二极管阵列检测器同时对葡萄酒中5种黄烷醇进行分离和测定；
所述5种黄烷醇分别为儿茶素、表儿茶素、表倍儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表倍儿茶素没食子酸酯；测定步骤为
(I)标准溶液配置
分别精确称取儿茶素等5种黄烷醇2. 3-16.0 mg，用甲醇溶解并转移至10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，封口，作为标准贮备液，在_20°C保存备用。使用前，根据实验需要将此标准贮备液用甲醇稀释至适宜含量，以配制标准工作液和混合标准工作液。(2)葡萄酒样品进样前无需任何前处理，直接过0. 45 Mffl滤膜即可进样。(3)色谱分离检测条件
检测仪器Waters ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪，包括四元溶剂管理器(QSM)，样品管理器(SM-FTN)，色谱柱温箱，光电二极管阵列检测器(PDA)。
色谱条件美国bridge ethylene hybrid (BEH) C18 色谱柱(100 mm X 2. Imm, I. 7 iim，Waters)，或同类UPLC C18色谱柱。紫外检测为280nm，柱温30°C，进样量为IU L,以峰面积外标法定量。流动相流动相A为2%乙酸水；B为甲醇；流速为0. 3 mL/min。洗脱程序0-5.5 min，流动相 A 为 92%-75%，流动相 B 为 8%-25% ;5. 5-6. 5min，流动相 A 为 75% -60%，流动相 B 为 25% -40%;6. 5-8. 6 min，流动相 A 为 60% -92%,流动相B为40% -8% ；8. 6-10 min,流动相A为92%,流动相B为8%。(4)定性:
对5种黄烷醇混合标准品进行色谱检测，得到5种黄烷醇标准品色谱图(如图I所示)；对葡萄酒样品进行色谱检测，得到葡萄酒样品中5种黄烷醇的UPLC色谱图(如图2所示)。结果表明，5种黄烷醇标准品和葡萄酒样品在上述色谱条件下，能够充分分离。 用增高法进行定性，图I所示的5种黄烷醇标准品出峰顺序依次为表倍儿茶素(EGC,3. 666 min)、儿茶素(CAT，3. 843 min)、表倍儿茶素没食子酸酯(EGCG，5. 230 min)、表儿茶素(EC，5.823 min)、表儿茶素没食子酸酯(ECG、7. 190 min)。(5)制作标准曲线，定量
制作标准曲线准确配制0. 23-160 mg/L的五个不同浓度的5种黄烷醇的混合标准品，标准品浓度的选择依据为最终检测葡萄酒样品中5种黄烷醇的含量在制作标准曲线的线性范围内。按照上述液谱条件进样，进样量为Iu L。以峰面积Y为纵坐标，质量浓度X为横坐标，计算得到5条标准曲线，结果见表I。从表I中可知，5种黄烷醇标准品的溶液含量和检测响应值呈现出良好的线性关系，并且最低检测限都较低，表明此方法灵敏度较高。
定量每种待测物质分别对应于外标做标准曲线，经过UPLC检测后将峰面积代入相对应的标准曲线方程计算出待测物质的含量。表I 5种黄烷醇的保留时间、回归方程和检出限
化合_ r_时间标准諭线相关鎌 mmm 最低I
__(aiia)____(mgl) 銜,IR
EGC 3 666 Y ^ ^ 69e-Q02 X - 6 4~e-00 0 999 0 94420 PO Q 045 CAT .S4 Y = 2 62e-0Q3 X - 3.6Ie-Cru3 0,999 0.6 -160.00 D-02S I EGCG 5 230 Y = 6 I "e-C> 33 X -1 S >-003 Q 999 0 3-30 PO 0 0 9| EC 5.S:3 Y = 2J2e-Q03 X - I oje-00 0399 0J4-120—00 OMi ECG - 190 Y = 6 65g-003 X > 3 ^Sg-OO 0 999 Q 23 PO +++++++++++++O^QMj
(6)稳定性检验
在上述色谱条件下，分别将葡萄酒样品连续进样5次，对其保留时间和5种黄烷醇的含量进行统计分析。结果表明(见表2)其保留时间相对标准偏差(RSD)都极小，均低于1% ;样品含量相对标准偏差均小于2%。结果表明，色谱工作稳定，重现性良好。表2色谱稳定性检验
_化合物I保留时间(min) Irsd |含量(mg/L) Irsd EGC 3. 721OT14. 50~
CAT 3.851KW15.06TTI
EGCG 丨5.273|o. 08 |o. 53|l. IEC |5.814|0.28 111. 27|l. 7
ECG \7. 209|o. 27 |o. 46|l. 8
本发明的有益效果
I、建立了一种利用超高效液相色谱高效、快速检测葡萄酒中的黄烷醇物质的方法。2、葡萄酒无需进行任何前处理，采用直接进样，不仅减少前处理次数，最大限度的减少样品在前处理过程中的损失，真实的反映样品中黄烷醇含量。3、通过对流动相的选择和洗脱条件的优化，使葡萄酒中的黄烷醇分离效果良好；并且洗脱时间明显缩短，可以在10 min内对葡萄酒中5种黄烷醇进行检测分析，分析过程快速，方便易操作，大大提高了检测效率及节省更多的流动相成本。
图I 5种黄烷醇标准品色谱图 图2葡萄酒样品色谱图。
具体实施例方式实施例I
取某红葡萄酒样品经0. 45 Mffl滤膜过滤后进行UPLC检测分析。色谱条件美国BridgeEthylene Hybrid (BEH) C18 色谱柱(100 mm X 2. I mm, I. 7 u m, Waters),或同类 UPLCC18色谱柱。紫外检测波长为280 nm,柱温30°C，进样量为I U L。流动相A为2%乙酸水；B为甲醇；流速为0.3 mL/min。洗脱程序0-5. 5 min，A为92%-75%，流动相B为8%-25%;
5.5-6. 5 min, A 为 75% -60%，流动相 B 为 25% -40% ；6. 5-8. 6 min, A 为 60% -92%，流动相B为40% -8% ；8. 6-10 min, A为92%，流动相B为8%。样品检测重复三次，以峰面积外标法定量。结果表明，该方法能够成功对红葡萄酒中5种黄烷醇进行定性定量分析，并且具有良好的重现性。表3为某红葡萄酒样品中黄烷醇的检测结果。表3某红葡萄酒样品黄烷醇酸含量(mg/L)
" I重复11重复21重复31平均值 EGC I. 21~ I. 25 I. 27 I. 24 CAT 33. 7~ 33. 53 33. 77 33. 67 EGCG I. 19~ I. 15 I. 21 I. 18 EC 11. 3~ 11. 29 11. 27 11. 31 ECG |o. 06 |o. 06 |o. 06 |o. 06 "
实施例2
取某白葡萄酒样品经0. 45 Mffl滤膜过滤后进行UPLC检测分析。色谱条件美国BridgeEthylene Hybrid (BEH) C18 色谱柱(100 mm X 2. I mm, I. 7 u m, Waters),或同类 UPLCC18色谱柱。紫外检测波长为280 nm,柱温30°C，进样量为I U L。流动相A为2%乙酸水；B为甲醇；流速为0.3 mL/min。洗脱程序0-5.5 min，A为92%-75%，流动相B为8%-25%;
5.5-6. 5 min, A 为 75% -60%，流动相 B 为 25% -40% ；6. 5-8. 6 min, A 为 60% -92%，流动相B为40% -8% ；8. 6-10 min, A为92%，流动相B为8%。样品检测重复三次，以峰面积外标法定量。结果表明，该方法能够成功对白葡萄酒中5种黄烷醇进行定性定量分析，并且具有良好的重现性。表4为某白葡萄酒样品中黄烷醇的检测结果。表4某白葡萄酒样品黄烷醇含量(mg/L)
权利要求
1.一种快速高效测定葡萄酒中黄烷醇的方法，其特征在于利用超高效液相色谱UPLC和二极管阵列检测器同时对葡萄酒中5种黄烷醇进行分离和测定； 所述5种黄烷醇分别为儿茶素、表儿茶素、表倍儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表倍儿茶素没食子酸酯；测定步骤为 (1)标准溶液配置 分别精确称取所述5种黄烷醇各2. 3-16. Omg,用甲醇溶解并转移至IOmL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，封口，作为标准贮备液，在_20°C保存备用；使用前，根据实验需要将此标准贮备液用甲醇稀释至适宜含量，以配制标准工作液和混合标准工作液； (2)葡萄酒样品进样前过0.45Mm滤膜； (3)超高效液相色谱分离检测条件 所述超高效液相色谱分析是指通过流动相梯度洗脱，进行紫外波长检测，洗脱和检测条件为 色谱柱美国Bridge Ethylene Hybrid (BEH) C18色谱柱或同类UPLC反相C18色谱柱； 流动相流动相A为2%的乙酸水，流动相B为甲醇； 洗脱程序:0-5. 5 min，流动相A为92%-75%，流动相B为8%-25% ;5. 5-6. 5 min,流动相A为75% -60%，流动相B为25% -40% ；6. 5-8. 6 min,流动相A为60% -92%，流动相B为40% -8% ；8. 6-10 min，流动相A为92%，流动相B为8% ； 流速设定0. 3 mL/min ； 紫外检测波长280 nm ； 柱温30 °C，进样量为I y L，以峰面积外标法定量； 紫外检测选用二极管阵列检测器； (4)定性 对所述5种黄烷醇混合标准品进行色谱检测，得到5种黄烷醇标准品色谱图；对葡萄酒样品进行色谱检测，得到葡萄酒样品中5种黄烷醇的UPLC色谱图；通过比较进行定性分折； (5)制作标准曲线,定量 制作标准曲线准确配制0. 23-160 mg/L的五个不同浓度的5种黄烷醇的混合标样，按照上述液谱条件进样，进样量为I U L ;以峰面积Y为纵坐标，质量浓度X为横坐标，计算得到5条标准曲线； 定量每种待测物质分别对应于外标做标准曲线，经过UPLC检测后将峰面积代入相对应的标准曲线方程计算出待测物质的含量。
全文摘要
一种快速高效测定葡萄酒中黄烷醇的方法，属于葡萄酒风味物质分析技术领域。本发明具体为采用超高效液相色谱技术快速测定葡萄酒中5种黄烷醇，解决现有的黄烷醇测定方法存在检测时间长，前处理复杂等问题。本发明利用超高效液相色谱和BEHC18色谱柱，并对色谱分离条件进行优化，能够在10min内对葡萄酒中的5种黄烷醇物质进行分离和测定。本发明无需进行任何样品前处理，最大限度的减少样品在前处理过程中的损失，真实的反映样品中黄烷醇含量；并且分析过程快速，分离效果良好，大大提高了检测效率。
文档编号G01N30/06GK102721759SQ20121020895
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月25日 优先权日2012年6月25日
发明者唐柯, 徐岩 申请人:江南大学