七清败毒颗粒质量控制方法
【专利摘要】本发明提供了一种使用HPLC色谱法同时测定黄芪苷和大黄素含量的方法，以实现对七清败毒颗粒的质量控制，该方法包括以下步骤：分别制备黄芪苷和大黄素的标准样品与七清败毒颗粒的供试样品；将上述样品分别经HPLC色谱层析法处理，比较计算获得七清败毒颗粒的供试样品中的黄芪苷和大黄素的含量。本发明的方法是对2010版兽药典二部中七清败毒颗粒的质量控制方法的改进，本发明的方法的含量控制方法操作简单，实现了对有效成分种类复杂的中药产品中有效成分量化控制要求，使产品的质量水平提升，可以作为新的七清败毒颗粒的质量控制的标准方法。
【专利说明】七清败毒颗粒质量控制方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种七清败毒颗粒质量控制方法，特别是指一种对七清败毒颗粒中黄芪苷和大黄素的含量同时进行测定的方法。
【背景技术】
[0002]七清败毒颗粒是一种常见的兽药方，具有清热解毒，燥湿止泻等功效。药方含黄芩、虎杖、白头翁、苦参、板蓝根、绵马贯众、大青叶等，主要用于湿热泄泻，雏鸡白痢，同时也用于防治猪繁殖与呼吸综合症、温和性猪瘟、圆环病毒、蓝耳病毒、流感病毒和禽温和型流感、非典型新城疫、慢性呼吸道病、传染性支气管炎、传染性喉气管炎、法氏囊病、减蛋综合症、禽肠毒综合症等，还具有增强免疫、降低应激反应等功效，并可作为保健佳品使用。因此，七清败毒颗粒在市场上得到普遍认可。由于七清败毒颗粒药物中黄芪苷、大黄素的作用，黄芪苷、大黄素含量对七清败毒颗粒的质量控制非常重要。《中华人民共和国兽药典》(2010年二部)公开了一种使用薄层色谱法进行七清败毒颗粒质量控制的方法，但该七清败毒颗粒的质量标准只对黄芩苷、虎杖、大黄素、靛蓝和靛玉红的鉴别，没有具体的含量测定项，因此，对七清败毒颗粒质量控制难以达到量化的标准。
[0003]由于七清败毒颗粒是一种含多组分复杂成分的兽药复方中药，由于成分复杂，造成含量不易控制，使中药的安全性和有效性受到影响。
【发明内容】
[0004]有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种使用HPLC色谱法同时测定黄芪苷和大黄素含量的方法，以实现对七清败毒颗粒的质量控制。
[0005]即本发明提供了一种七清败毒颗粒质量控制方法，为使用HPLC色谱法同时测定黄芪苷和大黄素含量。
[0006]优选地，本发明所述的质量控制方法，包括以下步骤:
[0007]A、分别制备黄芪苷和大黄素的标准样品；
[0008]B、制备七清败毒颗粒的供试样品；
[0009]C、将所述的黄芪苷和大黄素的标准样品、和七清败毒颗粒的供试样品分别经HPLC色谱层析法处理，比较计算获得七清败毒颗粒的供试样品中的黄芪苷和大黄素的含量。
[0010]即本发明是通过将黄芪苷的标准样品和大黄素的标准样品、和七清败毒颗粒的供试样品分别经HPLC色谱层析法处理，以获得黄芪苷的标准样品和大黄素的标准样品的标准曲线后，与七清败毒颗粒的供试样品经HPLC色谱层析法处理的色谱曲线对照，以获得七清败毒颗粒的供试样品中的黄芪苷和大黄素的含量。
[0011]为了充分释放七清败毒颗粒的供试样品，可以使用有机溶剂进行提取；更优选地，使用乙醇进行提取；更优选地，使用70%的乙醇对七清败毒颗粒的供试样品进行提取；也可以使用本领域常用的其他任何有机溶剂提取。
[0012]为了充分释放七清败毒颗粒的供试样品，还可以使用机械处理的方法对七清败毒颗粒的供试样品进行处理；优选地，可以对七清败毒颗粒进行研磨处理；更优选地，可以对七清败毒颗粒进行超声震荡处理；也可以使用本领域常用的其他机械处理的方法对七清败毒颗粒的供试样品进行处理。
[0013]本发明的七清败毒颗粒质量控制方法中，使用了 HPLC色谱法对黄芪苷的标准样品和大黄素的标准样品、和七清败毒颗粒的供试样品进行处理，其中，HPLC色谱法中使用的色谱柱为反相色谱柱；优选地，HPLC色谱法中使用的色谱柱为C18柱。
[0014]优选地，所述的HPLC色谱层析法中使用的流动相为乙腈-水-磷酸。优选地，所述的HPLC色谱层析法中流动相比例为乙腈-水-磷酸=22:78:0.2。
[0015]优选地，所述的HPLC色谱层析法中的流速为lml/min ;检测波长:270nm ；柱温:35。。。
[0016]由上可以看出，本发明提供了一种HPLC色谱法测定法，同时测定七清败毒颗粒中的黄芪苷和大黄素含量，解决了七清败毒颗粒的质量控制问题。
[0017]发明效果
[0018]本发明参考2010版兽药典二部黄芩中黄芩苷和虎杖中大黄素的含量的检测方法，结合实际情况进行适当改进，并经方法学验证。该七清败毒颗粒的含量控制方法操作简单，实现了对有效成分种类复杂的中药产品中有效成分量化控制要求，使产品的质量水平提升，具有商业上推广的前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为黄芪苷的标准样品和大黄素的标准样品的色谱图；
[0020]图2为阴性对照的色谱图；
[0021]图3为七清败毒颗粒的供试样品的色谱图。
【具体实施方式】
[0022]本发明实施例中使用的C18柱是指反相ODS柱(十八烷基硅烷键合硅胶填料，Octadecylsilyl,简称ODS柱),通过本发明的实施例,本领域技术人员知晓所有的C18柱都可以用来实现本发明，如waters的Symmetry-R)Cl 8色谱柱等都可以实现本发明。
[0023]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0024]实施例1HPLC法同时测定七清败毒颗粒中黄芩苷和大黄素的含量
[0025]本发明实施例中HPLC色谱条件为:
[0026]色谱柱:Agilent_C18(150mm X 4.6mm, 5um)。
[0027]流动相:乙腈-水-磷酸(22:78:0.2 )
[0028]流速:lml/min;检测波长:270nm ;柱温:35°C。
[0029]对照品溶液制备:取60°C减压干燥4h的黄芩苷对照品和大黄素对照品各适量，精密称定，置同一 25ml量瓶中，加入70%的乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每毫升含黄芩苷0.3mg、大黄素20ug的对照品溶液。[0030]供试品溶液制备:取研细的供试品约0.2g，精密称定，置25ml量瓶中，加入70%的乙醇20ml，超声振荡提取15min后，放冷至室温，加70%的乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
[0031]测定法:精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，记录色谱图，以外标法按峰面积计算，即得。
[0032]本发明的含量测定方法采用的色谱条件、样品处理方法均为新方法。
[0033]1、仪器与试剂、样品
[0034]仪器:WaterSe2695高效液相色谱仪；UV2489紫外检测器。
[0035]试剂:甲醇、乙睛为色谱纯；冰醋酸为分析纯；水为二次重蒸水。
[0036]对照品:黄芩苷(110715-201014)、大黄素(110756-201110)购自中国兽医药品监察所
[0037]样品:七清败毒颗粒，由洛阳惠中兽药有限公司生产。{[处方]黄芩IOOg虎杖IOOg白头翁80g苦参80g板蓝根IOOg绵马贯众60g大青叶40g ;[制法]以上7味，加水煎煮2次，第一次2小时，第二次I小时，煎液滤过，滤液合并，80°C以下减压浓缩至相对密度为1.30?1.35 (55°C)，得清膏，加入适量的蔗糖和糊精，混匀，制成颗粒，干燥，制成560g，
即得。I
[0038]2色谱条件:
[0039]色谱柱:Agilent_C18(150mm X 4.6mm, 5um)。
[0040]流动相:乙腈-水-磷酸(22:78:0.2 )
[0041]流速:lml/min;检测波长:270nm ;柱温:35°C。
[0042]3溶液的制备:
[0043]①对照品溶液的制备:
[0044]a.取60°C减压干燥4h的黄芩苷对照品适量，精密称定，置25ml量瓶中，加入70%的乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每毫升含黄芩苷0.3mg的对照品溶液。
[0045]b.取60°C减压干燥4h的大黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每Iml约含大黄素20ug的对照品溶液。
[0046]②供试品溶液的制备:取研细的供试品约0.2g,精密称定，置25ml量瓶中，加入70%的乙醇20ml，超声振荡提取15min后，放冷至室温，加70%的乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
[0047]③阴性样品的制备:取未加黄芩和虎杖的样品，按供试品溶液的制备方法制备，按要点2中的色谱条件测定，结果见图2。在与对照品图谱(图1)比较可见，在对照品图谱中黄芩苷、大黄素峰出现的位置上未见有峰出现。
[0048]4标准曲线的制备:
[0049]分别取要点3中对照品溶液5，10，20，30，50ul,注入高效液相色谱仪，按照要点2的色谱条件，得到图1的色谱图，测定峰面积。以对照进样量为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程黄芩苷:y=93186x+25150，R2=0.9993 ;大黄素:y=6021.2x-22.043，R2=0.9991。结果表明黄芩苷在1.5?15ug,大黄素在100?IOOOng范围内线性关系良好。
[0050]5精密度试验:[0051]取七清败毒颗粒1份，按要点3项下②中方法制备供试液，取供试液10ul，按上述色谱条件测定，结果如图3。连续重复进样6次，以外标法计算黄芩苷和大黄素的含量，结果测得RSD分别为1.34%和2.16%。
[0052]6回收率测定:
[0053]取己知含量的七清败毒颗粒6份，精密称定，分别向其中加入黄芩苷对照品溶液10ml、大黄素对照品溶液IOml按3项下②中方法制备供试液，在要点2的色谱条件下测定各自含量，计算回收率。结果平均回收率分别为98.05%,97.94%, RSD分别为1.93%,2.08%。
[0054]7样品测定:
[0055]分别取相同工艺制备的12个批号七清败毒颗粒样品(批号:100501、100502、100503、100504、100601、100602、100603、100604、100702、100703、100704、100801 洛阳惠
中兽药有限公司生产)，按3项下②中方法制备供试液，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液10ul，按上述色谱条件，测定，计算样品中黄芩苷和大黄素的含量。经对12批样品进行黄芩苷和大黄素含量测定，结果如下表1。其中黄芩苷最高值为17.186mg/g，最低值为14.534mg/g，大黄素最高值为1.307mg/g，最低值为1.009mg/g。根据黄苗药材中黄岑苷的限量为9.0%，虎杖药材中大黄素的限量为0.6%，计算得本品中黄芩苷的理论含量为
16.07mg/g，大黄素为1.07mg/g。考虑到大生产过程中的损失，将本品中黄芩苷的含量的限度定为每克颗粒中不少于12.5mg,大黄素为0.8mg/g,以控制内在质量。
[0056]表1使用本发明的方法 对12批样品的测定结果
[0057]
【权利要求】
1.一种七清败毒颗粒质量控制方法，其特征在于，所述方法为使用HPLC色谱法同时测定黄芪苷和大黄素含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤: A、分别制备黄芪苷和大黄素的标准样品； B、制备七清败毒颗粒的供试样品； C、将所述的黄芪苷和大黄素的标准样品、和七清败毒颗粒的供试样品分别经HPLC色谱层析法处理，比较计算获得七清败毒颗粒的供试样品中的黄芪苷和大黄素的含量。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤B中所述的七清败毒颗粒的供试样品为使用超声震荡方法处理的。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤C中所述的HPLC色谱层析法中使用的流动相为乙腈-水-磷酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤C中所述的HPLC色谱层析法中流动相比例为乙腈-水-磷酸=22:78:0.2。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤C中所述的HPLC色谱层析法中使用色谱柱为反相柱。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤C中所述的HPLC色谱层析法中使用色谱柱为C18柱。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤C中所述的HPLC色谱层析法中的流速为lml/min ;检测波长:270nm;柱温:35。。。
9.根据权利要求1-8所述的方法，其特征在于，所述步骤C中所述的黄芪苷的标准样品和大黄素的标准样品、和七清败毒颗粒的供试样品为使用相同的HPLC色谱条件处理。
10.根据权利要求1-9任意一项所述的方法在七清败毒颗粒质量控制中的用途。
【文档编号】G01N30/88GK103575841SQ201210257529
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年7月23日 优先权日:2012年7月23日
【发明者】张许科, 刘兴金, 张晓会 申请人:洛阳惠中兽药有限公司