本发明涉及其上盖有盖玻片的显微镜检验用试样的制备方法。
本发明还涉及用于检查其上盖有盖玻片的试样覆盖质量的装置。
背景技术：
在显微研究的准备过程中，例如可以是诸如组织切片的欲查验的试样通常被放在载玻片上，并在盖上盖玻片之前用覆盖介质进行处理，覆盖介质优选具有适合盖玻片或载玻片折射率的折射率，且起到粘结剂的功能。由于覆盖试样通常是个非常耗时的过程，经常为此使用覆盖机器。
例如从DE 101 44 048 A1已知用于处理载玻片和盖玻片的装置。使用该装置，借助于由致动臂引导的接纳单元，盖玻片被分别接纳，并置于载玻片上的期望位置。
在覆盖过程中会出现多种缺陷。例如，可能会发生盖玻片整个或局部破裂的情况，这会导致覆盖介质露出，形成进一步的缺陷。作为进一步的缺陷，在盖玻片下会出现包含气体；这将在之后的显微查验中造成不利影响，或者使得显微研究实际上不可能进行。
当覆盖过程中出现缺陷时，这些缺陷通常只有在显微镜检验中才被发现。这为常规实验室操作带来了大量严重问题，因为这时通常不能重新覆盖试样。尤其是在有大量试样要查验时，例如在连续处理中，这种缺陷导致实验室整体研究效率的大幅度降低，因为整个过程顺序而不仅仅是覆盖过程被打乱了。
US5566249公开了一种用于检测覆盖介质中的气泡的装置。该装置包括图像生成器件，盖玻片的图像可以利用该器件产生，而且该器件可实施成自动扫描显微镜。还设有用于识别气泡边缘和用于进一步的图像处理的器件。
技术实现要素：
本发明的目的是描述一种方法，该方法使避免或者至少减轻前面提到的问题成为可能。
这一目的通过一种方法达到，该方法的特征在于，自动地并至少部分在暗场照明下光学地检查覆盖质量。
本发明进一步的目的是描述一种装置，该装置使快速且可靠地检查其上盖有盖玻片的试样的覆盖质量成为可能。
这进一步的目的通过一种装置来实现，该装置的特征在于，自动和至少部分在暗场照明下操作的光学成像装置。
已认识到，依照本发明，经过早期可靠的覆盖质量检查，会在常规实验室操作中出现的、由于有缺陷地覆盖试样而引起的大量问题能够至少被减轻。关于试样是否是有缺陷地被覆盖的早期检查，和优选地关于检测出的缺陷的种类的辨别，使随后的实验室过程、特别是显微镜检验可以在很大程度上与缺陷地覆盖的试样无关。例如通过重新覆盖，还创造了同时消除所识别的覆盖缺陷的可能性。
在本发明的一个特定实施例中，进行关于在盖上盖玻片操作后盖玻片是否破损的检查，特别是关于在覆盖操作后盖玻片是否存在裂痕的检查。作为选择地或者另外地，可规定进行在覆盖介质中是否存在包含气体和/或在盖玻片和试样之间是否存在气体包容物的检查。作为选择地或者另外地，还可规定进行是否存在盖玻片表面不规则的检查。
为了实施前面提到的检查，可生成盖玻片和/或覆盖介质中有利地至少一个、优选是显微的图像。可特别地规定生成灰度图像作为图像。盖玻片和/或嵌入介质的图像的生成使得特别在生成数字图像数据时可就是否存在覆盖缺陷和/或其特性作出自动的、例如计算机控制的分析。在此可以特别规定，将已知的覆盖缺陷和/或特定地频繁出现的覆盖缺陷的图像模式存储在存储器里，并与所生成图像的图像细节进行比较。
盖玻片和/或嵌入介质被适当地照亮以生成图像，在此情况下可特别地规定在明场照明下生成图像。已发现特别有利的是，首先在明场照明下生成第一图像，以对成像的物体进行分类，并选择性地将它们与参考模式进行比较。
优选地在(入射)明场照明系统和照相机关于载玻片的轴对称布置的情况下获得图像，结果是大体平行的波前冲击盖玻片的整个表面，良好地反射，并因此也容易被检测出。位于盖玻片下的物体减弱了光线，并且该光线的一部分也行进到探测器。
覆盖缺陷，诸如气体包含物、表面不规则、或玻璃裂痕，引起照明光线的反射，该反射与在没有缺陷地覆盖试样的情况下出现的反射完全不同。这一点特别清晰的显示在灰度图像中。其中，气体包含物引起增强的反射，并在图像中表现为明亮区域。盖玻片的表面不规则和裂痕使光线偏转，并在图像中表现为特别暗的区域，因为较少光线从这些区域行进到探测器。
通过标定，最优曝光时间被优选地确定，该最优曝光时间允许背景在中性灰度区内成像，因而，特别亮和/或特别暗的区域从背景特别良好地突显出来。
当借助定向的照明来照亮试样时，除照明光线在空气-玻璃边界层处的反射之外，也在被封闭的气泡和围绕气泡的覆盖介质(粘结剂)之间的边界层处出现反射。从而，在具有气泡的情况下出现了双重反射，以致气泡在图像中表现为非常特别的明亮区域。优选地，选择如下材料和入射角，即，它们确保背景反射不超过一定值，以使空气包含物的反射总是高于其它部分处的反射，例如在载玻片或盖玻片的边界处的反射。为确保这一点，例如可采用特别是光学涂层的载玻片或盖玻片。
优选地，所有参数选择成使背景表现为灰度值100，而图像中的空气包含物具有大约200的灰度值。已发现，如果空气包含物具有相对于背景至少20％的对比度，就可以可靠地识别出空气包含物。
盖玻片的表面几何形状与理想的平坦表面的偏差引起入射光以两倍的角度误差被反射。另外，从盖玻片反射出的光线不再表现为完全平坦的波前(Wellenfront)。探测几何形状优选地选择成使从缺陷()反射出的光线不进入探测器。缺陷的图像因此显得比背景暗。特别地，相应地选择探测距离、探测器进入口(Eintrittsblende)尺寸、探测器(例如，照相机)光圈。
在一个特别有利的实施例中，由分析装置计算出比背景高出20％以上对比度的区域的轮廓。然后，计算出的区域可以根据灰度值进行滤波，并与覆盖缺陷相关联。
代替或除了在明场照明的情况下生成图像，也可规定，在暗场照明的情况下生成图像。特别准确和可靠的是这样的实施例，即，首先在明场中生成第一图像以对成像物体分类，然后在暗场照明下生成第二图像以实现对在明场照明条件下发现的物体的更精确的分类。
暗场照明的特征特别是在于照明光线以足够斜度入射到物体上，该斜度使得被反射的光线不射入目标，并因此不有助于图像的产生。由此特别地实现仅折射和散射的光有助于图像的产生。有利地，目标结构因此通常在暗背景上显得亮。
例如，暗场照明通过以平角照明(照明光线相对于盖玻片的表面法线的入射角较大)而获得。从而，亮的、边界突出的物体出现在图像中，具有相对于背景的高对比度。在这种情况下可规定，照明呈半圆模式，以使得探测到的物体轮廓也因此不完整和连续。
为了对发现一半的图像物体进行准确地分类，可以对在暗场照明下生成的图像进行关于人为因素(如特殊反射)是否出现于图像的同一位置的附加检查。从而，可以特别可靠地区分在图像之一中可探测到的人为因素是否与覆盖缺陷相关联，或者是例如是否由试样自身引起。
正如已经提及的，有利地可规定，利用分析装置对图像或多个图像进行自动分析，和/或利用包含数据处理设备的、特别是包含个人计算机的分析装置对图像或多个图像进行自动分析。这种实施方式不仅特别快速，而且也特别可靠和准确。
明场照明图像和暗场照明图像都进行生成并随后将这些图像相互比较(例如，通过分析装置)的实施例如前所述以特别可靠的方式提供是否存在覆盖缺陷和涉及哪一种覆盖缺陷的信息。当进行对于在一个图像里探测到的细节是否在另一图像中存在对应细节的检查(例如，利用分析装置)时，这是特别可靠的。
在一个特定实施例中规定，图像获取角和/或照明角以与将要查验的试样的种类和尺寸相适应的一种方式分别进行调整。在这一条件下，有利地可利用一种允许对图像获取角和/或照明角较佳为无级地进行调整的装置。
此外，这种装置的优点在于装置可以在明场照明下(例如在0°的照明光线的入射角的情况下)生成图像，也可以在暗场照明下(例如在50到80°范围内的照明光线的入射角的情况下)生成图像。特别地，利用这种装置，在明场照明图像生成之后，试样可以保持在试样台上或试样架中，而且在修正了图像获取角和/或照明角之后，暗场照明可以立即生成。特别地，可规定照明光源和/或探测器(例如，照相机)分别装配在可枢转的支架臂上。作为选择地或者附加地，还可以例如借助可转动的镜子转动各自的光束通道。
如果在检查盖上盖玻片质量之前，手动地或自动地测量参考图像的、特别是没有试样的被盖上盖玻片的载玻片的平均亮度和/或亮度分布，则得到特别可靠的结果。优选地存储参考测量的灰度值分布，以在查验被覆盖的试样时可以与后续图像的灰度值分布进行比较。特别地，可以借助参考测量、特别是基于测得的亮度和/或亮度分布可以为每一图像进行明暗(Shading)校正(例如，利用分析装置)。因为周围条件会随时间变化，有利地可规定按预先确定的或可接受的时间间隔进行标定过程。例如，环境条件的相对变化可以是环境温度或老化的照明光源的改变的照射性能。
特别有利地可规定，由测得的平均亮度和/或亮度分布求出用于生成图像的曝光时间，和/或由测得的平均亮度和/或亮度分布以如下方式求出用于生成图像的曝光时间，即，实现用于背景的预定或可预定的亮度。
在一个特定的实施例中规定，首先生成总图像，和/或读出试样特征码、特别是附连于载玻片或盖玻片的条形码。特别可规定，利用用于检查覆盖质量的成像装置生成总图像，和/或借助用于检查覆盖质量的成像装置读出试样特征码、特别是附连于载玻片或盖玻片的条形码。
这种实施例的优点在于待查验的试样根据与检测覆盖缺陷无关的特征来识别，并且例如与病人相关联。此外，可规定，除了检查覆盖缺陷之外，还检查着色质量、特别是苏木精-曙红着色剂的着色质量和/或色彩强度。在此，可采用也用来检查覆盖质量的同一装置。这具有特别优势，不需要额外的装置，且试样不必被传递到另外的装置；最终的结果是时间可以被节省。
正如根据例子已解释过的，可规定，同一个覆盖结果可以在不同条件下按时间顺序依次进行检查，和/或同一个覆盖结果可以在不同条件下按时间顺序依次在不同的测试站进行检查。
正如已经提及的，为了检查其上盖有盖玻片的试样的覆盖质量，特别有利的是成像装置、特别是具有暗场照明的成像装置。
在根据本发明的用于检查试样的覆盖质量的、包含自动操作的光学成像装置的装置的一个特定实施例中，附加地设有优选自动操作的分析装置，该分析装置查验由该成像装置生成的至少一个图像。特别可规定，这种分析装置查验由成像装置生成的图像：在覆盖操作之后盖玻片是否被破坏和/或在覆盖操作之后盖玻片是否存在裂痕和/或空气包含物是否出现在覆盖介质中和/或空气包含物是否存在在盖玻片和试样之间和/或盖玻片的表面不规则是否存在。
为此目的，特别地可规定，成像装置生成盖玻片和/或覆盖介质的至少一个图像，和/或成像装置生成盖玻片和/或覆盖介质的至少一个显微图像，和/或成像装置生成灰度图像。
根据本发明的装置的一个优势实施例包含用于在生产图像时照亮盖玻片和/或嵌入介质的照明装置，其中，照明装置可以被设计成生成明场照明和/或暗场照明。正如已经提及的，在此有利地可规定，借助一个且同一个照明装置生成明场照明和暗场照明。
特别是可规定，分析分析装置由参考图像的、特别是没有试样的被覆盖的载玻片的测得的平均亮度和/或亮度分布计算出用于生成图像的曝光时间，和/或分析装置由参考图像的、特别是没有试样的被覆盖的载玻片的测得的平均亮度和/或亮度分布以如下方式计算出用于生成图像的曝光时间，即，在生成时达到用于背景的预定或可预定的亮度。
正如已经提及的，有利地可规定，装置构造成生成总图像和/或读出试样特征码、特别是放置于载玻片或盖玻片上的条形码。特别地，装置可有利地构造成在不同条件下和/或在不同测试站按时间顺序依次检查同样的覆盖结果。
在根据本发明的装置的具备特别高的自动化水平的特定实施例中，设有将待查验的被覆盖的试样送入成像装置的扫描区域的操作装置。在此可规定特别是该操作装置自动地操作。
例如，这种操作装置可以从接收装置、特别是从堆叠架依次移去待查验的盖有盖玻片的试样，并将其送入成像装置的扫描区域。还可规定操作装置在检查完试样之后将每个试样存回到接收装置内。
用于检查覆盖质量的装置可以是覆盖机的一部分和/或可以集成到盖片机中。从而，覆盖和覆盖质量的检查二者可以出现在一个结构中。还可规定如果检测到覆盖缺陷则重复覆盖操作，特别是自动地重复。
代替将用于检查覆盖质量的装置集成到覆盖机中，也可以规定将用于检查覆盖质量的装置实施成、特别是自动地实施成从覆盖机中接收至少一个已配备盖玻片的试样，或者从覆盖机移去至少一个已配备盖玻片的试样。
为了允许在短时间内可靠的分析和处理较大量的试样，有利地可规定关于覆盖质量的数据和/或试样特征码、特别是附连于载玻片或盖玻片的条形码被送入更高水平的数据处理系统。作为选择地或者附加地，可规定例如关于覆盖质量的数据和/或试样特征码、特别是附连于载玻片或盖玻片的条形码、和/或关于与试样相关的病人数据和/或关于试样的当前所在位置的数据与更高水平的数据处理系统进行交换。
根据特定的发明构思，可以利用装备了根据本发明的装置的试样处理系统完成特别可靠的处理和查验，特别是在较大量的试样的情况下。特别地，这种系统可以包括更高水平的数据处理系统，该数据处理系统从用于检查覆盖质量的装置接收关于覆盖质量的数据和/或试样特征码、特别是附连于载玻片或盖玻片的条形码，和/或关于与试样相关联的病人数据和/或关于试样的当前所在位置的数据。特别地，这种更高水平的数据处理系统可以包括用于存储这些数据的存储器。还可规定将接收的数据与先前存储的数据相比较，例如以控制试样的进一步处理。还可规定试样处理系统包括更高水平的数据处理系统，用于检查覆盖质量的系统与该数据处理系统交换数据，数据例如是关于覆盖质量或试样的当前所在位置或关于与数据相关联的病人数据。
附图说明
本发明的更深一层目标、优势、特征、和可利用性从以下参照附图对示范性实施例的说明中是显而易见的。所说明的和/或示意描绘的所有特征，它们本身或以任意有益的组合构成本发明的主旨，这与它们在权利要求书中的分组或内部引用无关。
图1示出用于检查其上盖有盖玻片的试样的覆盖质量的装置的示例性实施例，
图2示意性地示出当存在包含气体时在明场照明下被覆盖的试样的图像的生成，
图3示意性地示出当盖玻片存在裂痕时在明场照明下被覆盖的试样的图像的生成，
图4示意性地示出在暗场照明下图像的生成。
具体实施方式
图1是用于检查其上盖有盖玻片16(图1中未画出)的试样1的覆盖质量的装置的示范性实施例的示例性总体说明。该装置包括操作装置(未更详细画出)，其从堆叠架2移走待查验的相应的被覆盖的试样1，并将试样放进试样平台3的扫描区域内。在每个试样1都完成查验后，操作装置把查验好的试样1放回堆叠架2内。这些操作以水平双向箭头表示。
堆叠架2可以沿垂直方向移位，以使另一待查验的试样1可以被带到试样平台3的高度并且被移走。这一操作以垂直双向箭头表示。
用于检查覆盖质量的装置包括用于明场照明的第一光源4。第一光源4发射第一照明光束5，第一照明光束5被分束器6和偏转镜7引导到待查验的被覆盖的试样1。从试样沿同一光路、但沿相反反向(即从偏转镜7回到分束器6)反射的探测到的光线8(画成虚线)穿过分束器6，并最终到达实施成CCD照相机的探测器9。探测器9安置在电路板10上，电路板10带有分析电子系统(未进一步画出)。
还提供了光学器件，特别是远心光学镜，用于引导和成形照明光线和探测到的光线，所述器件仅示意地并以示例方式示出为透镜11。
此外，该装置包括用于暗场照明的另一光源12，该另一光源仅示意地画出。特别地，另一光源12可以是半圆形光源。
可例如规定，一检测到覆盖缺陷，用于检查覆盖质量的装置就输出光学或声学信号。
图2示意性地示出当位于载玻片15上的试样1的盖玻片14下方存在包含气体13时，在明场照明下图像的生成，特别是灰度图像的生成。向被覆盖的试样1发射光线的光源4用作明场照明。从被覆盖的试样1反射的光线借助实施为照相机的探测器9探测到。
特别是在气体包含物13和试样1的材料或其覆盖介质(粘结剂)之间的过渡区域除出现附加的反射，并使得这一区域在灰度图像中相对于背景显得特别明亮。
图3示意地示出当盖玻片14存在被覆盖介质(粘结剂)充填的裂缝17时，在明场照明下被覆盖的试样1图像的生成，特别是灰度图像的生成。尤其因为裂缝17的不规则表面结构和出现在这一区域的黏合剂18，从光源4射出的光线以与光射到被覆盖的试样1不同的方向在没有覆盖缺陷的区域内反射。
距离、角度、和光学属性选择成使得没有在裂缝17的区域内反射的光线或者只有小部分这种光线抵达探测器9。这样的结果是，裂缝17区域在灰度图像中相对于背景显得特别暗。
注意到在明场照明背景中，照明光线的入射角不一定等于0°。特别地，相对于入射垂线，即相对于(未证实的)盖玻片表面的垂线、在0°到30°范围内的入射角在实践中也被用于明场照明。优选地，在此情况下，探测器的位置应选择为使得没有反射光线、只有折射和/或散射光线抵达探测器。
图4示意性地示出在暗场照明下图像的生成，特别是灰度图像的生成。光源16的照明光线相对于试样1以平角、即相对于盖玻片表面法线的较大入射角来入射。借助对试样1的垂直视图来发生探测。
所生成的图像示出具有高对比的明亮的、界线突出的物体，使得能够进行覆盖缺陷的识别，特别是覆盖缺陷的自动识别。特别地，在暗场照明下生成的这种图像使得可以检查先前在明场照明下进行的查验的分析结果。特别地，可以对在一幅图像中探测到的细节检查在另一图像中是否存在对应细节。
部件列表
1 被覆盖的试样
2 堆叠架
3 试样台
4 用于明场照明的第一光源
5 照明光束
6 分束器
7 偏转镜
8 探测到的光线
9 探测器
10 电路板
11 透镜
12 另一光源
13 气体包含物
14 盖玻片
15 载玻片
16 用于暗场照明的光源
17 盖玻片14的裂缝
18 出现的粘结剂