一种在黄绿光波段测量时间分辨荧光仪器响应函数的方法
【专利摘要】本发明的目的在于提供一种在黄绿波段测量时间分辨荧光仪器响应函数的方法。该方法包括以下步骤：a.使用淬灭的荧光素钠作为参考染料，其中以荧光素钠作为荧光染料；以碘离子（I-）作为淬灭剂；b.通过测量仪器获得该参考染料的时间分辨荧光光谱；以及c.以该时间分辨荧光光谱作为该测量仪器的仪器响应函数。其中荧光素钠的终浓度为200-800μM，碘离子（I-）的终浓度为8-12.2M，体系的pH值为pH≥9。与固体颗粒散射测量仪器响应函数的方法相比，利用本发明方法获得仪器响应函数避免了不同激发波长之间的颜色效应，提高了整个实验结果的准确性，并且避免了更换滤波片的麻烦。
【专利说明】一种在黄绿光波段测量时间分辨荧光仪器响应函数的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于光学光谱测量领域，涉及时间分辨荧光仪器响应函数的测量方法，尤 其涉及一种在黄绿光波段测量时间分辨荧光仪器响应函数的方法。
【背景技术】
[0002] 在时间分辨荧光光谱测量中，所测得的荧光衰减曲线实际上是仪器响应函数 (Instrument Response Function, IRF)和理想时间衰减曲线的卷积。要获得理想时间衰 减曲线，就需要去除仪器响应函数（IRF)所带来的影响。因此，仪器响应函数是否准确将直 接影响到理想时间衰减曲线的测量准确性。通常，仪器响应函数是通过测量激发光的时域 剖面图来获得的。瑞利光散射为这一测量提供了足够强度的信号，可以通过测量仪器对瑞 利散射的响应来获得仪器响应函数。用这种方法获得仪器响应函数时，存在一些缺陷，比如 只能将探测波长靠近激发波长位置处进行信号探测，然而，被激发的物质发出的荧光的波 长相对于激发光的波长有一定的偏移，而且测量仪器如单色仪、光电倍增管或雪崩光电二 极管都存在颜色效应，这将导致用这种方法得到的仪器响应函数出现系统误差。因此，人们 期望一种新的能获得更精确的仪器响应函数的方法。
[0003] 荧光素是一种常见的具有光致荧光特性的染料，因其具备消光系数高、量子产率 大、以及吸收和发射带存在大量重叠区域等优点，作为一种单寿命的荧光染料被广泛应用 在突光光谱领域中（ZhengH, ZhanXQ, BianQN, et al. ChemCommun, 2013, 49(5) :429_47,《化 学通讯》；HolcovaV, SimaJ, DusekJ. Cent Eur J Chem, 2013, 11 (2): 200-4,《中欧化学杂 志》)，被用作测量时间分辨荧光仪器响应函数的参考染料。除了荧光素，罗丹明6G(Hanley QS，Subramaniam V，Arndt-Jovin DJ, et al. Cytometry, 2001，43 (4) :248-60《细胞计数》） 和玫瑰红（Szabelski M，Luchowski R，Gryczynski Z，et al.ChemPhysLett，2009,471(l_3 ):153-9,《化学物理快报》）也被用作测量时间分辨荧光仪器响应函数的参考染料。
[0004] 荧光素钠较荧光素具有更高的荧光强度和更短的荧光寿命。另外，与罗丹明6G和 玫瑰红的发射波长不同，荧光素钠的发射波长为黄绿光波段，与生物分子中应用广泛的绿 色荧光蛋白（GFP)和黄色荧光蛋白（YFP)的发射波长范围一致。由于在样品发射波段来测 量仪器响应函数，能提高整个实验结果的准确性，并且可避免更换滤光片的麻烦，因此，用 荧光素钠的碱性溶液来获得仪器响应函数（IRF)是合适的，S卩非常适合用作测量仪器响应 函数的参考燃料。尤其对于绿色和黄色荧光蛋白的研究，使用荧光素钠作为一种在黄绿光 波段测量仪器响应函数的参考染料具有重要的参考价值。
[0005] 如前所述，测量仪器测得的荧光衰减曲线是理想荧光衰减曲线和仪器响应函数的 卷积。如果某种物质(荧光团）的荧光寿命非常小，以致于远小于仪器本身的响应时间，那 么，测量测得的该物质的荧光衰减曲线数据基本上就可以作为该仪器装置的仪器响应函 数，从而简单地通过测量该被测物质的荧光衰减曲线来快速地获得仪器响应函数。
[0006] 有很多方法可以将荧光团寿命有效减小至皮秒量级，从而使其作为仪器响应函数 的参考物质成为可能。碰撞淬灭（Lawrence WG, VanMarter TA, Nowlin ML, et al. J Chem Phys，1997, 106 (I) :127-41《化学物理学报》）就是其中一种最简单可行的办法。
[0007] 碰撞淬灭的淬灭机制是使处于激发态的突光团与溶液中的淬灭剂发生碰撞导致 荧光强度的减弱。通过改变染料中的淬灭剂的浓度可以改变荧光衰减过程。作为测量仪器 响应函数的染料分子，碘化物淬灭的罗丹明6G的突光寿命为50ps (Hanley QS, Subramaniam V，Arndt-Jovin DJ, Jovin TM. 2001. Cytometry43:248_60《细胞计数》；Harris JM, Lytle FE. 1977. Review of Scientific Instruments48:1469-76《科学仪器评论》）；淬灭的赤藓 红B 的突光寿命为 25ps (Szabelski M，Ilijev D，Sarkar P，Luchowski R，Gryczynski Z，et al. 2009. Applied Spectroscopy63:363-8《应用光谱学》），淬灭的LDS798的荧光寿命为 24ps (Luchowski R, Gryczynski Z,Sarkar P,Borejdo J, Szabelski M, et al. 2009. Rev Scilnstrum80:033109《科学仪器综述》）。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提出一种在黄绿光波段测量时间分辨荧光的仪器响应函数的 方法。
[0009] 本发明的方法中，使用淬灭的荧光素钠作为参考染料,其中以荧光素钠作为荧光 染料；以碘离子（0作为淬灭剂；通过测量仪器获得所述荧光素纳的时间分辨荧光光谱； 以及以所述的时间分辨荧光光谱作为所述测量仪器的仪器响应函数。
[0010] 该参考染料中，所述荧光素钠的终浓度为200-800iiM，所述碘离子（〇的终浓度 为8-12. 2M，所述参考染料的pH值为pH彡9。
[0011] 该参考染料的制备包括以下步骤：
[0012] al.配制高浓度或饱和的碘化物溶液，称取一定质量的碘化物溶液并将其溶于所 需pH值的pH缓冲液中，配制成高浓度或饱和的碘化物碱性溶液；
[0013] a2.配制高浓度或饱和的荧光素钠溶液,称取一定质量的荧光素钠溶液并将其溶 于所需pH值的pH缓冲液中，配制成高浓度或饱和荧光素钠碱性溶液；以及
[0014] a3.将该碘化物碱性溶液和该荧光素钠碱性溶液按一定比例混合,使其满足该碘 离子终浓度和该荧光素钠终浓度，以构成该参考染料。
[0015] 该碘化物为碘化钠或碘化钾。
[0016] 该pH缓冲液为磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼砂-氢 氧化钠缓冲液以及碳酸钠-氢氧化钠缓冲液中的任何一种。
[0017] 该测量仪器为频率上转换时间分辨荧光装置或时间分辨单光子计数装置。
[0018] 本发明与现有的仪器响应函数测量方法相比，具有如下有益效果：
[0019] ⑴本发明在荧光发射波段来测量仪器响应函数，与采用固体颗粒的散射测量仪器 响应函数相比，避免了不同激发波长之间的颜色效应，提高了整个实验结果的准确性，并且 避免了更换滤波片的麻烦；
[0020] ⑵本发明所选用的参考染料消光系数高、量子产率大、以及吸收和发射带存在大 量重叠区域等优点，并且具有对酸碱环境比较敏感，在水中溶解度大的优点；
[0021] ⑶本发明对时间分辨荧光仪器响应函数的测量适用于黄绿波段，这与生物分子中 的绿色荧光蛋白（GFP)和黄色荧光蛋白（YFP)的发射波长一致。因此，本发明非常适于绿色 和黄色荧光蛋白的研究；
[0022] ⑷本发明与现有的用于时间分辨荧光仪器响应函数的参考染料相比具有更短的 寿命（17ps)，现有的碘化物淬灭的罗丹明6G的荧光寿命为50ps，淬灭的赤藓红B的荧光寿 命为25ps，淬灭的LDS798的荧光寿命为24ps ;
[0023] (5)本发明的参考染料体系成本低廉，易于制备。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1为本发明的参考染料为淬灭的荧光素钠的频率上转换时间分辨荧光光谱图；
[0025] 图2为本发明的参考染料为淬灭的荧光素钠的TCSPC系统获得的时间分辨荧光光 谱图；
[0026] 图3为利用本发明方法获得的仪器响应函数对荧光素时间分辨荧光测量的光谱 图；
[0027] 图4为利用本发明方法获得的仪器响应函数对环形绿色荧光蛋白时间分辨荧光 测量的光谱图；以及
[0028] 图5为利用本发明方法获得的仪器响应函数对环形黄色荧光蛋白时间分辨荧光 测量的光谱图。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合附图和实施例对本发明的【具体实施方式】做进一步详细的说明，但不应以 此限制本发明的保护范围。
[0030] 参考染料的配制
[0031] 先准备好PHlO的磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液，秤取碘化钠（NaI) 18. 3g，用准 备好的PHlO的缓冲液定容至10mL，配制成12. 2M (接近饱和）的NaI溶液；秤取荧光素钠 I. 91g，用准备好的pHIO的缓冲液定容至IOOmL,配制成51. 4mM的荧光素钠碱性溶液；量取 配制好的12. 2M的NaI (碘化钠）溶液1000 ii L，51. 44mM的荧光素钠溶液10 ii L并混匀，得 到的混合溶液即为用于测量时间分辨荧光的仪器响应函数的参考染料，其中作为淬灭剂的 碘离子的终浓度为12. 1M，作为荧光染料的荧光素钠的终浓度为510 ii M，参考染料体系的 pH 为 10。
[0032] 上述参考染料的配制中，碘化物为碘化钠。作为可选的实施方式，也可以为碘化 钾。
[0033] 上述参考染料的配制中，缓冲液为磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液。作为可选的实 施方式，也可以是甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液以及碳酸钠-氢氧化钠 缓冲液中的任何一种。
[0034] 参考染料寿命的测量
[0035] 下面将描述对前述配制的参考染料进行寿命的测量。如前所述，参考染料为pHIO 的NaI-荧光素钠溶液，其中碘离子的终浓度为12. 1M，荧光素钠的终浓度为510 iiM。采用 频率上转换时间分辨荧光装置作为测量仪器，对上述参考染料的时间分辨进行测量，激发 波长为475nm，探测波长选在315nm。该探测波长由参考染料520nm的荧光与800nm的探测 光通过频率上转换得到，计算方式如下：Vs = Ve+Vd，V = c/x，其中vs、ve、vd分别为上转换 信号频率、激发光频率、探测光频率，C为光速，A为波长。通过测量，获得参考染料的时间 分辨荧光光谱(即荧光衰减曲线)，见图1。
[0036] 接着，再获取前述频率上转换时间分辨荧光装置的仪器响应函数。该上转换时间 分辨荧光装置的仪器响应函数由如下方式获得：以520nm激发光代替上述参考染料520nm 的荧光，其它条件不变，测量上转换信号的时间分辨光谱，从而获得仪器响应函数，如图1 中的小图所示。仪器响应函数的FWHM (半高全宽）为300fs。
[0037] 如前所述，已获得参考染料的时间分辨荧光光谱以及探测仪器的仪器响应函 数。测量仪器测得的荧光衰减曲线是理想荧光衰减曲线和仪器响应函数的卷积，可表示为 =/c?"K〇, Isig(t)是指实验所测荧光强度衰减曲线，I。是指理想的荧光衰减曲 线，iIKF(t)是指仪器响应函数，?表示卷积运算。理想衰减曲线的单指数模型可表示为：1。 = A*exp(-t/T)，A表示系数，T表示突光寿命，t表示时间。对上述参考染料的时间分辨 荧光光谱数据Isig(t)用单指数迭代卷积重构进行拟合。
[0038] 通过上述的拟合公式进行拟合，得到荧光的寿命为17ps。这里，由于荧光寿命 (17ps)远大于测量仪器的仪器响应函数的半高全宽（300fs)，因此，上述拟合方式拟合得到 的突光寿命是可靠准确的。
[0039] 通过上述的测量可知，参考染料的寿命为17ps，比现有技术中碘化物淬灭的罗丹 明6G的荧光寿命50ps，淬灭的赤藓红B的荧光寿命25ps以及淬灭的LDS798的荧光寿命 24ps还要小，因此，利用本发明的参考染料可获得更精确的仪器响应函数。
[0040] 仪器响应函数的获得及骀证
[0041] 下面是利用上述配制的参考染料在黄绿光波段测量时间分辨荧光的仪器响应函 数的具体例子。
[0042] 以上述方式配制的NaI-荧光素钠为参考染料利用TCSPC (时间分辨单光子计数） 装置进行时间分辨荧光测量，其中碘离子的终浓度为12. 1M,荧光素钠的终浓度为510 ii M, 体系的pH为10。通过测量，获得上述参考染料的时间分辨荧光光谱。如图2所示，其半高 全宽为190ps。该时间分辨荧光光谱即可作为该测量仪器TCSPC的仪器响应函数。
[0043] 上述例子中采用TCSPC装置测量时间分辨荧光从而获得仪器响应函数，本领域的 技术人员熟知，也可以采用其它测量仪器，例如频率上转换时间分辨荧光装置等。
[0044] 接下来，利用通过本发明的方法获得的仪器响应函数对下述三种材料的时间分辨 荧光的寿命进行拟合，以验证本发明方法获得的仪器响应函数的准确性。拟合的误差用拟
【权利要求】
1. 一种在黄绿波段测量时间分辨英光仪器响应函数的方法，其特征在于，该方法包括 W下步骤： a. 使用浑灭的英光素轴作为参考染料，其中W英光素轴作为英光染料；W楓离子（0 作为浑灭剂； b. 通过测量仪器获得所述参考染料的时间分辨英光光谱；W及 C. W所述时间分辨英光光谱作为所述测量仪器的仪器响应函数。
2. 根据权利要求1所述的在黄绿波段测量时间分辨英光的仪器响应函数的方法，其特 征在于，所述参考染料中，所述英光素轴的终浓度为200-800 y M，所述楓离子（n的终浓度 为8-12. 2M，所述参考染料的抑值为抑> 9。
3. 根据权利要求2所述的在黄绿波段测量时间分辨英光仪器响应函数的方法，其特征 在于，所述参考染料的制备包括W下步骤： al.配制高浓度或饱和的楓化物溶液，称取一定质量的楓化物溶液并将其溶于所需抑 值的抑缓冲液中，配制成高浓度或饱和的楓化物碱性溶液； a2.配制高浓度或饱和的英光素轴溶液，称取一定质量的英光素轴溶液并将其溶于所 需抑值的抑缓冲液中，配制成高浓度或饱和英光素轴碱性溶液；W及 a3.将所述楓化物碱性溶液和所述英光素轴碱性溶液按一定比例混合，使其满足所述 楓离子终浓度和所述英光素轴终浓度，W构成所述参考染料。
4. 根据权利要求3所述的在黄绿波段测量时间分辨英光仪器响应函数的方法，其特征 在于，所述的楓化物为楓化轴或楓化钟。
5. 根据权利要求4所述的在黄绿波段测量时间分辨英光仪器响应函数的方法，其特征 在于，所述抑缓冲液为磯酸氨二轴-氨氧化轴缓冲液、甘氨酸-氨氧化轴缓冲液、测砂-氨 氧化轴缓冲液W及碳酸轴-氨氧化轴缓冲液中的任何一种。
6. 根据权利要求1-5中任一项所述的在黄绿波段测量时间分辨英光仪器响应函数的 方法，其特征在于，所述测量仪器为频率上转换时间分辨英光装置。
7. 根据权利要求1-5中的任一项所述的在黄绿波段测量时间分辨英光仪器响应函数 的方法，其特征在于，所述测量仪器为时间分辨单光子计数装置。
【文档编号】G01N21/64GK104345050SQ201310338275
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年8月5日 优先权日:2013年8月5日
【发明者】潘海峰, 贾梦辉, 刘梦薇, 李磊, 赵力涛, 常孟方, 张三军, 徐建华 申请人:华东师范大学