一种基于应用代谢组学对中药知柏地黄丸疗效的试验方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于应用代谢组学对中药知柏地黄丸疗效的试验方法，该方法包括：将实验动物分成对照组，糖尿病肾病模型组，糖尿病肾病给药组三组，进行注射处理并尿液、血清和肾脏组织样本；将三组大鼠的肾脏组织，用10％中性甲醛固定后石蜡包埋、切片，制片，常规苏木精-伊红染色后，在光学显微镜下观察肾脏组织病理学变化；血清样本和尿液样本化学指标的测定和组织病理学的检测；制备血清、尿液、肾脏的组织样本并获得1H?NMR谱的数据；采用统计学的方法，进行NMR数据处理与模式识别分析；对不同组大鼠的生理、生化重要指标进行对比分析。本发明通过代谢组学技术能获得机体大量的内源性代谢物的信息，筛选知柏地黄丸中有效成分引起的代谢物变化。
【专利说明】一种基于应用代谢组学对中药知柏地黄丸疗效的试验方法
【技术领域】
[0001]本发明属于药品研究【技术领域】，尤其涉及一种基于应用代谢组学对中药知柏地黄丸疗效的试验方法。
【背景技术】
[0002]知柏地黄丸(Zhibai DihuangPill，ZDP)是一种常用中成药，是由补阴经典代表方剂六味地黄丸(熟地黄，山萸肉，山药，泽泻，牡丹皮和茯苓)加上知母和黄柏炮制而成，力口强了滋肾阴清相火的作用，近年来有人报道该药可以保护实验动物因糖尿病肾病导致的肾脏损伤，临床研究也发现联合服用化学药物和知柏地黄丸的病人其治疗效果要明显好于单独用化学药物的患者，可是，由于该药的多成分及其作用的多通路和多靶点，其作用机制仍不清楚，知柏地黄丸的作用机制，理论上应该是“多成分，多靶点”，但往往缺乏有效的试验方法和技术手段加以证明，其活性成分复杂，和通过多途径和多靶点对机体发挥作用的特点，这给研究中药防治疾病的确切的分子机制带来极大的困难。
[0003]代谢组学是研究生物体内源性代谢物的整体及其受内在或外在因素影响的科学，其广泛的应用已深入到生物代谢、疾病诊断和药物整体药效毒性等研究领域，其“整体论”的哲学思想与中药作用的“多成分、多靶点”特征相一致，能从整体上评价知柏地黄丸“多成分，多靶点”的药效作用，并探讨其可能的作用机制。
[0004]以往的试验方法沿用了化学药物(西药)研发常用的“单组份单靶点”理论模型和思路，其中心思想包括首先发现活性组份，进行分离鉴定，进而对活性成份或其化学衍生物进行药理、毒理、临床等方面的研究，尽管这种方法的研究取得了相当的成就。但是，也存在一些缺点:(I)知柏地黄丸中有多种有效成分，具有多种药物效应；(2)每个活性化合物组份可能有多个作用靶点，直接影响多个生物过程；(3)各个组份之间存在协同作用、相互影响，中药配伍的思想基础就是“协同作用”，单一的化学成分和药理指标不能对知柏地黄丸的药物效应清楚的认识；此外，许多单组分化学药物，不仅可以同时对不同的器官(如肝脏和肾脏)有效应。
[0005]现有技术存在的不能对知柏地黄丸中多种有效成分进行测定和研究。
【发明内容】
[0006]本发明实施例的目的在于提供一种基于应用代谢组学对中药知柏地黄丸疗效的试验方法，旨在解决现有技术存在的不能对知柏地黄丸中多种有效成分进行测定和研究的问题。
[0007]本发明实施例是这样实现的，一和基于应用代谢组学对中药知柏地黄丸疗效的试验方法，该基于应用代谢组学对中药知柏地黄丸疗效的试验方法包括以下步骤:
[0008]步骤一，将实验动物分成对照组，糖尿病肾病模型组，糖尿病肾病给药组三组，进行注射处理并尿液、血清和肾脏组织样本；
[0009]步骤二，将三组大鼠的肾脏组织，周10%中性甲醛固定后石蜡包埋、切片，制片，常规苏木精-伊红染色后，在光学显微镜下观察肾脏组织病理学变化；
[0010]步骤三，血清样本和尿液样本化学指标的测定和组织病理学的检测；
[0011]步骤四，制备血清、尿液、肾脏的组织样本并获得1H NMR谱的数据；
[0012]步骤五，采用统计学的方法，进行NMR数据处理与模式识别分析；
[0013]步骤六，对不同组大鼠的生理、生化重要指标进行对比分析；
[0014]步骤七，对不同组大鼠进行代谢组学分析、血清样本中的代谢物分析、肾脏样本中的代谢物分析。
[0015]进一步，在步骤一中，动物处理及样品收集的具体方法为:实验动物分为三组:对照组，糖尿病肾病模型组，糖尿病肾病给药组，除对照组外，所有动物腹腔注射STZ(70mg /kg)造成糖尿病模型，一个月后尿中蛋白的升高视为早期糖尿病肾病已形成，将这些糖尿病肾病大鼠随机分为2组:糖尿病肾病组和糖尿病肾病知柏地黄丸组，每组9只，糖尿病肾病知柏地黄丸组每天灌胃给予知柏地黄丸(4g / kg)，而糖尿病肾病组和对照组灌胃给予同样体积的溶剂，在STZ造模两个月后，所有的动物依次取尿液、血清和肾脏组织样本。
[0016]进一步，在步骤二中，肾组织的组织学观察具体方法为:将三组大鼠的肾脏组织，用10%中性甲醛固定后石蜡包埋、切片，制片，常规苏木精-伊红染色后，在光学显微镜下观察肾脏组织病理学变化，半定量肾小管间质的病变，在200倍光学显微镜镜下，每张切片随机选择10个不连续视野，避开肾小球和大血管，肾间质病变由三个参数判定:肾小管扩张，间质炎症细胞浸润和间质纤维化程度。
[0017]进一步，在步骤三中，血清样本的临床化学指标包括:甘油三酯、胆固醇和血糖值，尿液样本测定的是尿蛋白，组织病理学检测方法:随机选取25片组织切片，利用HE染色检测组织细胞的病理变化。
[0018]进一步，在步骤四中，血清组织样本的制备具体方法为:将300 μ L解冻的血清与300 μ L磷酸缓冲液混合(0.2mol/LNa2HP04 / NaH2P04,pH7.4)，混合后的血清样本12000g离心lOmin，去除沉淀，随即将500 μ L上清液和含50 μ L重水转到5mmNMR管中，所有的NMR谱均在Varian Unity Inova核磁共振谱仪采集,配有三共振探头和Z轴脉冲梯度场,质子的共振频率为599.69MHz处，实验温度为25°C，针对血清样本，为减少大分子蛋白对谱宽的影响并保留小分子信号，利用一维CPMG脉冲序列采集样本的IH NMR谱。
[0019]进一步，在步骤四中，尿液组织样本的制备具体方法为:将500 μ L解冻的尿液与50 μ L磷酸缓冲液混合(1.5mol / LK2HP04/NaH2P04，pH7.4)，混合时间150ms，混合后的血清样本12000g离心IOmin,去除沉淀,然后将500 μ L上清液和含2,2’，3, 3’_deuterotrimethylsilylproprionic acid(TSP, 1.5mmol / L)的 50 μ L 重水转到 5mm NMR管中，TSP 用于化学位移定标，所有尿液样本的NMR谱均在Varian Unity Inova600NMR谱仪采集，配有三共振探头和Z轴脉冲梯度场，质子的共振频率为599.69MHz，在25°C条件下利用一维NOESY脉冲序列采集尿液样本的IH NMR谱,所周的实验参数:混合时间(mixing time) 150ms,谱宽10000Hz，弛豫延迟2s，采样时间1.64s，数据采集点数16K，累加64次，FID充零至64K后,加0.5Hz窗函数进行Fourier变换。
[0020]进一步，在步骤四中，肾脏组织的样本提取具体方法为:取冻存的部分肝组织样本称重后，在液氮条件下加冰冷的高氯酸溶液(12%，3mL / g组织)，用研钵碾至粉末状；离心去除沉淀后，用10% KOH调节pH值至中性；再次离心去除氯酸钾沉淀，将上清冻干至粉末状_80°C保存，在采集NMR谱之前，先用600 μ L含TSP和重水的磷酸缓冲液溶解粉末，离心，取500 μ L上清转移至5_ NMR样品管中，在25°C条件下周Varian Unity Inova NMR谱仪采集一维氢谱，所用的脉冲序列为presat，所用的实验参数:谱宽9612Hz，弛豫延迟2s，数据采集点数94K，累加128次，加0.5 Hz窗函数进行Fourier变换。
[0021]进一步，在步骤五中，NMR数据处理与模式识别分析，对采集的1H NMR谱进行相位校正和基线调整，将1H NMR谱从δ 10.0-0.4ppm分别按0.0lppm和0.0015ppm为单位进行自动分段积分，为了消除饱和水峰时引起的谱线扭曲，将δ 5.2-4.4ppm区域设为O积分段，为补偿样本之间浓度的差异，对每一段积分值都相对于该谱的所有积分值进行归一化，然后将以0.0lppm为区间归一化后得到的数据导入，进行多元统计分析。
[0022]进一步，在步骤六中，统计学方法，数据以平均值土标准差表示，组间的统计差异采用单因素方差分析，采用post hoc Dunnett’ s two-sided检验进行两两比较，当且仅当P值小于0.05时，结果被认为是有统计显著性差异的。
[0023]本发明提供的基于应用代谢组学对中药知柏地黄丸疗效的试验方法，通过代谢组学技术能获得机体大量的内源性代谢物的信息，并从中筛选知柏地黄丸中多种有效成分多个靶点的药物效应引起的代谢物变化，进而从整体上评价知柏地黄丸的药效作用，为评价知柏地黄丸的药效作用提供新技术。本发明研究生物体内源性代谢物的整体及其受内在或外在因素影响，能从整体上评价知柏地黄丸“多成分，多靶点”的药效作用，并探讨其可能的作用机制。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1是本发明实施例提供的基于应用代谢组学对中药知柏地黄丸疗效的试验方法流程图；
[0025]图2是本发明实 施例提供的对照组(A)，DN组⑶和DN+ZDP组(C，D)大鼠肾脏组织HE染色的示意图；
[0026]图3是本发明实施例提供的对照组(-)，DN组(▲)以及DN+ZDP组(Λ )大鼠血清㈧和肾脏组织(B)NMR谱图PCA分析得分图；
[0027]图4是本发明实施例提供的对照组，DN组和DN+ZDP组大鼠血清代谢物NMR积分值的比较示意图；
[0028]图5是本发明实施例提供的对照组，DN组和DN+ZDP组大鼠肾脏中代谢物NMR积分图；
[0029]图6是本发明实施例提供的对照组(Α)，糖尿病肾病组⑶和给药组大鼠(C)肾脏组织中的葡萄糖和甜菜碱含量相关关系图。
【具体实施方式】
[0030]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0031]图1示出了本发明提供的基于应用代谢组学对中药知柏地黄丸疗效的试验方法流程。为了便于说明，仅仅示出了与本发明相关的部分。[0032]本发明实施例的基于应用代谢组学对中转知柏地黄丸疗效的试验方法，该基于应用代谢组学对中药知柏地黄丸疗效的试验方法包括以下步骤:
[0033]步骤一，将实验动物分成对照组，糖尿病肾病模型组，糖尿病肾病给药组三组，进行注射处理并尿液、血清和肾脏组织样本；
[0034]步骤二，将三组大鼠的肾脏组织，用10%中性甲醛固定后石蜡包埋、切片，制片，常规苏木精-伊红染色后，在光学显微镜下观察肾脏组织病理学变化；
[0035]步骤三，血清样本和尿液样本化学指标的测定和组织病理学的检测；
[0036]步骤四，制备血清、尿液、肾脏的组织样本并获得1H NMR谱的数据；
[0037]步骤五，采用统计学的方法，进行NMR数据处理与模式识别分析；
[0038]步骤六，对不同组大鼠的生理、生化重要指标进行对比分析；
[0039]步骤七，对不同组大鼠进行代谢组学分析、血清样本中的代谢物分析、肾脏样本中的代谢物分析。
[0040]作为本发明实施例的一优化方案，在步骤一中，动物处理及样品收集的具体方法为:实验动物分为三组:对照组，糖尿病肾病模型组，糖尿病肾病给药组，除对照组外，所有动物腹腔注射STZ(70mg / kg)造成糖尿病模型，一个月后尿中蛋白的升高视为早期糖尿病肾病已形成，将这些糖尿病肾病大鼠随机分为2组:糖尿病肾病组和糖尿病肾病知柏地黄丸组，每组9只，糖尿病肾病知柏地黄丸组每天灌胃给予知柏地黄丸(4g / kg)，而糖尿病肾病组和对照组灌胃给予同样体积的溶剂，在STZ造模两个月后，所有的动物依次取尿液、血清和肾脏组织样本。
[0041]作为本发明实施例的一优化方案，在步骤二中，肾组织的组织学观察具体方法为:将三组大鼠的肾脏组织，用10%中性甲醛固定后石蜡包埋、切片，制片，常规苏木精-伊红染色后，在光学显微镜下观察肾脏组织病理学变化，半定量肾小管间质的病变，在200倍光学显微镜镜下，每张切片随机选择10个不连续视野，避开肾小球和大血管，肾间质病变由三个参数判定:肾小管扩张，间质炎症细胞浸润和间质纤维化程度。
[0042]作为本发明实施例的一优化方案，在步骤三中，血清样本的临床化学指标包括:甘油三酯、胆固醇和血糖值，尿液样本测定的是尿蛋白，组织病理学检测方法:随机选取25片组织切片，利用HE染色检测组织细胞的病理变化。
[0043]作为本发明实施例的一优化方案，在步骤四中，血清组织样本的制备具体方法为:将300 μ L解冻的血清与300 μ L磷酸缓冲液混合(0.2mol/LNa2HP04 / NaH2P04, ρΗ7.4)，混合后的血清样本12000g离心lOmin，去除沉淀，随即将500 μ L上清液和含50 μ L重水转到5mm NMR管中,所有的NMR谱均在Varian Unity Inova核磁共振谱仪采集,配有三共振探头和Z轴脉冲梯度场，质子的共振频率为599.69MHz处，实验温度为25°C，针对血清样本，为减少大分子蛋白对谱宽的影响并保留小分子信号，利用一维CPMG脉冲序列采集样本的IH NMR 谱。
[0044]作为本发明实施例的一优化方案，在步骤四中，尿液组织样本的制备具体方法为:将500 μ L解冻的尿液与50 μ L磷酸缓冲液混合(1.5mol / L K2HP04 / NaH2004,pH7.4),混合时间150ms，混合后的血清样本12000g离心lOmin，去除沉淀，然后将500 μ L上清液和含 22，，3, 3，-deuterotrimethylsilylproprionic acid (TSP, 1.Smmol / L)的 50 μ L 重水转到5mm NMR管中，TSP用于化学位移定标，所有尿液样本的NMR谱均在Varian UnityInova600NMR谱仪采集，配有三共振探头和Z轴脉冲梯度场，质子的共振频率为599.69MHz，在25°C条件下利用一维NOESY脉冲序列采集尿液样本的IH NMR谱，所用的实验参数:混合时间(mixing time) 150ms，谱宽10000Hz，弛豫延迟2s，采样时间1.64s，数据采集点数16K，累加64次，FID充零至64K后，加0.5Hz窗函数进行Fourier变换。
[0045]作为本发明实施例的一优化方案，在步骤四中，肾脏组织的样本提取具体方法为:取冻存的部分肝组织样本称重后，在液氮条件下加冰冷的高氯酸溶液(12%，3mL / g组织)，用研钵碾至粉末状；离心去除沉淀后，用10% KOH调节pH值至中性；再次离心去除氯酸钾沉淀，将上清冻干至粉末状_80°C保存，在采集NMR谱之前，先用600 μ L含TSP和重水的磷酸缓冲液溶解粉末，离心，取500 μ L上清转移至5mm NMR样品管中，在25°C条件下用Varian Unity Inova NMR谱仪采集一维氢谱,所用的脉冲序列为presat,所用的实验参数:谱宽9612Hz，弛豫延迟2s，数据采集点数94K，累加128次，加0.5Hz窗函数进行Fourier变换。
[0046]作为本发明实施例的一优化方案，在步骤五中，NMR数据处理与模式识别分析，对采集的1H NMR谱进行相位校正和基线调整，将1H NMR谱从δ 10.0-0.4ppm分别按
0.0lppm和0.0015ppm为单位进行自动分段积分，为了消除饱和水峰时引起的谱线扭曲，将δ 5.2-4.4ppm区域设为O积分段，为补偿样本之间浓度的差异，对每一段积分值都相对于该谱的所有积分值进行归一化，然后将以0.0lppm为区间归一化后得到的数据导入，进行多元统计分析。
[0047]作为本发明实施例的一优化方案，在步骤六中，统计学方法，数据以平均值土标准差表示，组间的统计差异采用单因素方差分析，采用post hoc Dunnett’ s two-sided检验进行两两比较，当且仅当P值小于0.05时，结果被认为是有统计显著性差异的。
[0048]下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0049]如图1所示，本发明实施例的基于应用代谢组学对中药知柏地黄丸疗效的试验方法包括以下步骤:
[0050]SlOl:将实验动物分成对照组(control)，糖尿病肾病模型组(DN)，糖尿病肾病给药组(DN+ZDP)三组，进行注射处理并尿液、血清和肾脏组织样本；
[0051]S102:将三组大鼠的肾脏组织，用10%中性甲醛固定后石蜡包埋、切片，制片，常规苏木精-伊红(HE)染色后，在光学显微镜下观察肾脏组织病理学变化；
[0052]S103:血清样本和尿液样本化学指标的测定和组织病理学的检测；
[0053]S104:制备血清、尿液、肾脏的组织样本并获得IHNMR谱的数据；
[0054]S105:进行NMR数据处理与模式识别分析，采用统计学的方法；
[0055]S106:对不同组大鼠的生理、生化等重要指标进行对比分析；
[0056]S107:对不同组大鼠进行代谢组学分析、血清样本中的代谢物分析、肾脏样本中的代谢物分析，从而完成代谢组学对中药知柏地黄丸疗效的考察。
[0057]本发明的具体步骤为:
[0058]第一步，动物处理及样品收集，实验动物分为三组:对照组(control)，糖尿病肾病模型组(DN)，糖尿病肾病给药组(DN+ZDP)，除对照组外，所有动物腹腔注射STZ(70mg /kg)造成糖尿病模型，一个月后尿中蛋白的升高视为早期糖尿病肾病已形成，将这些糖尿病肾病大鼠随机分为2组:糖尿病肾病组和糖尿病肾病知柏地黄丸组，每组9只，后者每天灌胃给予知柏地黄丸(4g / kg)，而糖尿病肾病组和对照组灌胃给予同样体积的溶剂，在STZ造模两个月后，所有的动物依次取尿液、血清和肾脏组织样本；
[0059]第二步，肾组织的组织学观察，将三组大鼠的肾脏组织，用10%中性甲醛固定后石蜡包埋、切片，制片，常规苏木精-伊红(HE)染色后，在光学显微镜下观察肾脏组织病理学变化，半定量肾小管间质的病变，在200倍光学显微镜镜下，每张切片随机选择10个不连续视野，尽量避开肾小球和大血管，肾间质病变由三个参数判定:肾小管扩张，间质炎症细胞浸润和间质纤维化程度；
[0060]第三步,血清生化检测,血清样本的临床化学指标包括:甘油三酯(triglyceride,TG)、胆固醇(total cholesterol, TC)和血糖值,尿液样本测定的是尿蛋白，这些指标的测定是在全自动生化分析仪上测定的，组织病理学检测方法:随机选取25片组织切片，利用HE染色检测组织细胞的病理变化；
[0061]第四步，组织样本的制备和1H NMR谱数据的获得，将300 μ L解冻的血清与300 μ L磷酸缓冲液混合((X2m0l / L Na2HP04 / NaH2P04, pH7.4),目的是减少因pH改变引起的化学位移差异，混合后的血清样本12000g离心lOmin，去除沉淀，随即将500 μ L上清液和含50yL重水转到5mm NMR管中，其中重水供锁场之用，所有的NMR谱均在Varian UnityInova核磁共振谱仪采集，配有三共振探头和Z轴脉冲梯度场，质于的共振频率为599.69MHz处，实验温度为25°C，针对血清样本，为减少大分子蛋白对谱宽的影响并保留小分子信号，利用一维CPMG脉冲序列采集样本的IH NMR谱，所用的实验参数:自旋-自旋弛豫间隔(spin-spin relaxation delay) 120ms,谱宽 9000Hz,弛豫延迟 4s,数据采集点数 16K,累加128次，FID充零至64K后，加窗函数进行Fourier变换；
[0062]针对尿液样本，将500 μ L解冻的尿液与50 μ L磷酸缓冲液混合(1.5mol / LK2HP04 / NaH2P04，pH7.4)，目的是减少困pH改变引起的化学位移差异，混合后的血清样本12000g 离心 IOmin,去除沉淀，然后将 500 μ L 上清液和含 2, 2’，3, 3’-deuterotrimethyl si Iylproprionic acid (TSP, 1.5mmol / L)的 50 μ L 重水转到 5mm NMR管中，TSP 用于化学位移定标，所有尿液样本的NMR谱均在Varian Unity Inova600NMR谱仪采集，配有三共振探头和Z轴脉冲梯度场，质子的共振频率为599.69MHz，在25°C条件下利用一维NOESY脉冲序列采集尿液样本的m NMR谱,所用的实验参数:混合时间(mixing time) 150ms,谱宽10000Hz,弛豫延迟2s，采样时间1.64s，数据采集点数16K，累加64次，FID充零至64K后，加0.5Hz窗函数进行Fourier变换；
[0063]肾脏组织的样本提取，取冻存的部分肝组织样本称重后，在液氮条件下加冰冷的高氯酸溶液(12%，3mL / g组织)，用研钵碾至粉末状；离心去除沉淀后，用10% KOH调节PH值至中性；再次离心去除氯酸钾沉淀，将上清冻干至粉末状-80°C保存，在采集NMR谱之前，先用600 μ L含TSP和重水的磷酸缓冲液溶解粉末，离心，取500 μ L上清转移至5mmNMR样品管中，在25°C条件下用Varian Unity Inova NMR谱仪采集一维氢谱,所用的脉冲序列为presat，所周的实验参数:谱宽9612Hz，弛豫延迟2s，数据采集点数94K，累加128次，加
0.5Hz窗函数进行Fourier变换；
[0064]第五步，NMR数据处理与模式识别分析，为了探索谱图中隐含的所有的代谢信息，对采集的1H NMR谱进行相位校正和基线调整，将1H NMR谱从δ 10.0-0.4ppm分别按
0.0lppm和0.0015ppm为单位进行自动分段积分，为了消除饱和水峰时引起的谱线扭曲，将δ 5.2-4.4ppm区域设为O积分段，为补偿样本之间浓度的差异，对每一段积分值都相对于该谱的所有积分值进行归一化，然后将以0.0lppm为区间归一化后得到的数据导入，进行多兀统计分析，偏最小二乘判别分析(partial least-squares discriminant analysis,PLS-DA)的所有的样本点都展示在第一和第二个主成分(pCl和PC2)为x、y坐标轴的二维空间中，该图中的每一个点都代表一个血清样本，R2是前两个PC所包含的总信息的百分数，表征了 PCA的区分程度，相应的PCA载荷图上，每一点代表了 NMR谱图上的一个积分区间，用来确认是哪一段积分值对组间分离有贡献，
[0065]第六步，统计学方法，进行统计分析，数据以平均值土标准差(mean土SD)表示，组间的统计差异采用单因素方差分析(ANOVA),采用post hoc Dunnett’s two-sided检验进行两两比较，当且仅当P值小于0.05时，结果被认为是有统计显著性差异的。
[0066]结合分析对本发明做进一步的说明:
[0067]生化与组织病理学
[0068]表1-1临床化学检测指标
[0069]
【权利要求】
1.一种基于应用代谢组学对中药知柏地黄丸疗效的试验方法，其特征在于，该基于应用代谢组学对中药知柏地黄丸疗效的试验方法包括以下步骤: 步骤一，将实验动物分成对照组，糖尿病肾病模型组，糖尿病肾病给药组三组，进行注射处理并尿液、血清和肾脏组织样本； 步骤二，将三组大鼠的肾脏组织，用10%中性甲醛固定后石蜡包埋、切片，制片，常规苏木精-伊红染色后，在光学显微镜下观察肾脏组织病理学变化； 步骤三，血清样本和尿液样本化学指标的测定和组织病理学的检测； 步骤四，制备血清、尿液、肾脏的组织样本并获得1H NMR谱的数据； 步骤五，采用统计学的方法，进行NMR数据处理与模式识别分析。
2.如权利要求1所述的基于应用代谢组学对中药知柏地黄丸疗效的试验方法，其特征在于，在步骤一中，动物处理及样品收集的具体方法为:实验动物分为三组:对照组，糖尿病肾病模型组，糖尿病肾病给药组，除对照组外，所有动物腹腔注射STZ (70mg / kg)造成糖尿病模型，一个月后尿中蛋白的升高视为早期糖尿病肾病已形成，将糖尿病肾病大鼠随机分为2组:糖尿病肾病组和糖尿病肾病知柏地黄丸组，每组9只，糖尿病肾病知柏地黄丸组每天灌胃给予知柏地黄丸(4g / kg)，而糖尿病肾病组和对照组灌胃给予同样体积的溶剂，在STZ造模两个月后，所有的动物依次取尿液、血清和肾脏组织样本。
3.如权利要求1所述的基于应用代谢组学对中药知柏地黄丸疗效的试验方法，其特征在于，在步骤二中，肾组织的组织学观察具体方法为:将三组大鼠的肾脏组织，用10%中性甲醛固定后石蜡包埋、切片，制片，常规苏木精-伊红染色后，在光学显微镜下观察肾脏组织病理学变化，半定量肾小管间质的病变，在200倍光学显微镜镜下，每张切片随机选择10个不连续视野，避开肾小球和大血管，肾间质病变由三个参数判定:肾小管扩张，间质炎症细胞浸润和间质纤维化程度。
4.如权利要求1所述的基于应用代谢组学对中药知柏地黄丸疗效的试验方法，其特征在于，在步骤三中，血清样本的临床化学指标包括:甘油三酯、胆固醇和血糖值，尿液样本测定的是尿蛋白，组织病理学检测方法:随机选取25片组织切片，利用HE染色检测组织细胞的病理变化。
5.如权利要求1所述的基于应用代谢组学对中药知柏地黄丸疗效的试验方法，其特征在于，在步骤四中，血清组织样本的制备具体方法为:将300 μ L解冻的血清与300 μ L磷酸缓冲液混合(0.2mol/L Na2HP04 / NaH2P04,pH7.4)，混合后的血清样本12000g离心lOmin，去除沉淀，随即将500 μ L上清液和含50 μ L重水转到5mm NMR管中，所有的NMR谱均在Varian Unity Inova核磁共振谱仪采集,配有三共振探头和Z轴脉冲梯度场,质子的共振频率为599.69MHz处，实验温度为25°C，针对血清样本，为减少大分子蛋白对谱宽的影响并保留小分子信号，利用一维CPMG脉冲序列采集样本的IH NMR谱；所用的实验参数:自旋-自旋弛豫间隔(spin-spin relaxation delay) 120ms,谱宽9000Hz,弛豫延迟4s,数据采集点数16K，累加128次，FID充零至64K后，加窗函数进行Fourier变换。
6.如权利要求1所述的基于应用代谢组学对中药知柏地黄丸疗效的试验方法，其特征在于，在步骤四中，尿液组织样本的制备具体方法为:将500 μ L解冻的尿液与50 μ L磷酸缓冲液混合(L 5mol/LK2HP04 / NaH2P04,pH7.4)，混合时间150ms，混合后的血清样本12000g离心 IOmin,去除沉淀，然后将 500 μ L 上清液和含 2, 2，，3, 3，-deuterotrimethylsiIylproprionic acid (TS P, 1.5mmol / L)的50 μ L重水转到5mm NMR管中，TSP用于化学位移定标，所有尿液样本的NMR谱均在Varian Unity Inova600NMR谱仪采集，配有三共振探头和Z轴脉冲梯度场，质子的共振频率为599.69MHz，在25°C条件下利用一维NOESY脉冲序列采集尿液样本的IH NMR谱,所用的实验参数:混合时间(mixing time) 150ms,谱宽10000Hz,弛豫延迟2s，采样时间1.64s，数据采集点数16K，累加64次，FID充零至64K后，加0.5Hz窗函数进行Fourier变换。
7.如权利要求1所述的基于应用代谢组学对中药知柏地黄丸疗效的试验方法，其特征在于，在步骤四中，肾脏组织的样本提取具体方法为:取冻存的部分肝组织样本称重后，在液氮条件下加冰冷的高氯酸溶液(12%，3mL / g组织)，用研钵碾至粉末状；离心去除沉淀后，用10% KOH调节pH值至中性；再次离心去除氯酸钾沉淀，将上清冻干至粉末状_80°C保存，在采集NMR谱之前，先用600 μ L含TSP和重水的磷酸缓冲液溶解粉末，离心，取500 μ L上清转移至5mmNMR样品管中，在25°C条件下用Varian Unity Inova NMR谱仪采集一维氢谱，所用的脉冲序列为presat，所用的实验参数:谱宽9612Hz，弛豫延迟2s，数据采集点数94K，累加128次，加0.5Hz窗函数进行Fourier变换。
8.如权利要求1所述的基于应用代谢组学对中药知柏地黄丸疗效的试验方法，其特征在于，在步骤五中，NMR数据处理与模式识别分析，对采集的1HNMR谱进行相位校正和基线调整，将1H NMR谱从δ 10.0-0.4ppm分别按0.0lppm和0.0015ppm为单位进行自动分段积分，为了消除饱和水峰时引起的谱线扭曲，将S 5.2-4.4ppm区域设为O积分段，为补偿样本之间浓度的差异，对每一段积分值都相对于该谱的所有积分值进行归一化，然后将以0.0lppm为区间归一化后得到的数据导入，进行多元统计分析。
9.如权利要求1所述的基于应用代谢组学对中药知柏地黄丸疗效的试验方法，其特征在于，在步骤六中，统计学方法，数据以平均值土标准差表示，组间的统计差异采用单因素方差分析，采用post hoc Dunnett’ s two-sided检验进行两两比较，当且仅当P值小于.0.05时，结果被认为是有统计显著性差异的。
【文档编号】G01N33/15GK103472199SQ201310413364
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月12日 优先权日:2013年9月12日
【发明者】高红昌, 赵良才 申请人:温州医科大学