一种结合拉曼光谱技术和谱峰比值法的藻种鉴别方法
【专利摘要】本发明公开了一种结合拉曼光谱技术和谱峰比值法的藻种鉴别方法，包括：取相同藻种在不同生长阶段下的多个样本，每个样本均为当前藻种的活体藻液，获取各个样本的拉曼光谱原始信息；对拉曼光谱原始信息进行预处理，得到对应的预处理谱图，然后得到胡萝卜素所对应的谱峰比值；更换藻种，获得不同藻种在各生长阶段下所对应的谱峰比值；以所有藻种的谱峰比值作为输入，以与各比值相对应的藻种分类为输出，建立BP神经网络模型；取待鉴别活体藻液，获得该待鉴别活体藻液的谱峰比值并输入BP神经网络模型，获得待鉴别活体藻液中所包含的藻种分类。本发明实现了结合拉曼光谱技术和谱峰比值法的藻种鉴别方法，大大简化了操作步骤，缩短了检测时间。
【专利说明】一种结合拉曼光谱技术和谱峰比值法的藻种鉴别方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及藻种分类检测【技术领域】，尤其涉及一种结合拉曼光谱技术和谱峰比值法的藻种鉴别方法。
【背景技术】
[0002]微藻是一类系统发生各异、个体较小、通常为单细胞或群体的、能进行光合作用(少部分为异养生长)的水生(或陆生、气生、共生)低等植物。它是能够进行光合作用的微生物，可以利用阳光、水和CO2合成自身所需要的物质。目前，对藻类的识别分类及其生化分析已经成为海洋生物学的研究热点之一。
[0003]小球藻(Chlorel Ia)是一类单细胞绿藻,属于绿藻门、绿藻纲、小球藻属，广泛分布于自然界，淡水水域中种类最多。小球藻易于培养，生长繁殖速度很快，不仅能利用光能自养，还能在异养条件下利用有机碳源进行生长、繁殖，应用价值很高。已有研究表明，小球藻含丰富的蛋白质、脂质、多糖、食用纤维、维生素、微量元素和活性代谢产物。国内外的学者对小球藻的药理作用进行了广泛的研究，发现小球藻具有防治消化性溃疡、抗肿瘤、增强免疫、抗辐射、抗病原微生物、防治贫血、降血脂和抗动脉粥样硬化等药理作用。近年来，我国也开始重视小球藻的开发利用。
[0004]等鞭金藻属于金藻门、等鞭金藻纲、等鞭藻属，细胞大小一般为6-7μπιΧ5-6μπι，细胞上有两条等长鞭毛。等鞭金藻具有繁殖速度快、没有细胞壁、易于吸收、生产成本低等优点。等鞭金藻营养丰富，富含蛋白质、多糖和类胡萝卜素等，且安全无毒、易于人体吸收，其营养研究已受到广泛的关注。同时等鞭金藻含有大量的ω-3多不饱和脂肪酸，其中DHA和C18:2的含量最为丰富。等鞭金藻还被用于研发抗肿瘤药物，以及用于重金属吸附。因此，等鞭金藻在生物质能源生产上具有广阔的应用前景。
[0005]拉曼光谱是一种散射光谱，是研究分子振动的一种光谱方法，它的原理和机制与红外光谱不同，红外光谱对极性基团有很强的检出能力，而非极性基团如c=c，C-C等则具有很强的拉曼活性。但它们提供的结构信息是类似的，都是关于分子内部各种分子振动频率及有关振动能级的情况，所以能从分子水平上反映样品化学组成和分子结构上的差异，实现分子中某些化学键和官能团的“指纹鉴别”。另外水的拉曼散射很微弱几乎不产生干扰信号，使得拉曼在研究水溶液中的活体生物的无损检测上具有其他分子光谱无法比拟的优势。
【发明内容】
[0006]本发明提供了一种结合拉曼光谱技术和谱峰比值法的藻种鉴别方法，解决了现有检测方法检出率低，操作相对繁琐、耗时、耗力的问题。
[0007]—种结合拉曼光谱技术和谱峰比值法的藻种鉴别方法，包括以下步骤:
[0008](I)取相同藻种在不同生长阶段下的多个样本，每个样本均为当前藻种的活体藻液，采用拉曼光谱仪获取各个样本的拉曼光谱原始信息；[0009](2)对步骤(1)采集的拉曼光谱原始信息进行预处理，得到对应的预处理谱图，然后计算得到胡萝卜素所在谱峰对应的拉曼强度比值，记为谱峰比值；
[0010](3)更换藻种，重复操作步骤(1)和步骤(2)，获得不同藻种在各生长阶段下的胡萝卜素所对应的谱峰比值；
[0011](4)以所有藻种的谱峰比值作为输入，以与各谱峰比值相对应的藻种分类为输出，建立BP神经网络模型；
[0012](5)取待鉴别活体藻液，通过步骤(1)和步骤(2)的处理获得该待鉴别活体藻液的谱峰比值并输入所述BP神经网络模型，获得待鉴别活体藻液中所包含的藻种分类。
[0013]人工神经网络是模仿人脑神经细胞的结构和功能的系统。目前应用较广的是一种基于误差反向传播算法的BP神经网络。由于其具有高度非线性隐射的能力，现已在各个领域得到了广泛的应用，并取得了令人满意的结果。
[0014]在所述的步骤(1)中，将样本放置在拉曼光谱仪的载物台上，利用激光强度为Imv的激光束，并通过50X的物镜聚焦到样本的表面，曝光时间ls，累计次数一次，得到所述的拉曼光谱原始信息，且整个实验过程都是在恒温(约25 °C)条件下进行的。[0015]在所述的步骤(1)中，藻种的不同生长阶段是指对数期和稳定期。
[0016]步骤(2)中，所述的预处理为依次进行去荧光背景处理和平滑处理，预处理过程都是在软件Matlab中实现。
[0017]由于原始拉曼受荧光干扰较大，荧光的产生会覆盖拉曼的信号，因此首先采用Rolling Circle filter 去除突光背景(可参见:Brandt, N.N.et al., Optimization of therolling-circle filter for Raman background subtraction.Applied Spectroscopy, 2006，60(3):288-293.)，凸显信号；最后对获得的拉曼曲线进行平滑处理，以提高信噪比。
[0018]在所述的步骤(2)中，藻体内胡萝卜素的谱峰是指1527CHT1与ΙΙΘΟαι1的强度比值。
[0019]在所述的步骤(4)中，采用预处理后的拉曼光谱曲线建立神经网络模型，当采用隐含层节点数为6时得到的模型效果最佳。
[0020]在所述的步骤(5)中，待鉴别活体藻液的谱峰比值输入BP神经网络模型中，与已知藻种的谱峰比值进行对比，获得待鉴别活体藻液中所包含的藻种分类。
[0021]与现有技术相比，本发明的有益效果为:
[0022]本发明实现了结合拉曼光谱技术和谱峰比值法的藻种鉴别方法，不需要配制任何溶液以及化学测定，大大简化了操作步骤，缩短了检测时间，也避免了由于操作人员操作不熟练或者主观因素带来的测量结果不准确等后果，其中谱峰比值法的最大优势是可以消除不同生长阶段、不同曝光时间以及色素随时间推移产生分解等对微藻拉曼信号采集的影响。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为某小球藻、葡萄球藻与等鞭金藻样本的原始拉曼谱线。
[0024]图2是某等鞭金藻同一藻体色素随时间推移产生分解下采集的拉曼信号。
[0025]图3为某葡萄球藻液样本在对数期和稳定期经上述预处理后的拉曼光谱。
[0026]图4为实施例中小球藻藻液样本、葡萄球藻液样本和等鞭金藻藻液样本的预测结果O
【具体实施方式】
[0027]下面结合具体实施例进一步阐释本发明。
[0028]在实施例中，选取的活体藻液样本为小球藻、葡萄球藻和等鞭金藻样本，拉曼光谱仪为雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪(inVia - RefleX532/XYZ)。
[0029]取不同生长阶段一定浓度的小球藻、葡萄球藻、等鞭金藻样本100ml，分别加入水0ml, 10ml, 20ml, 30ml, 40ml进行稀释,得到五种不同浓度梯度的反应液。采用雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪(inVia - RefIex532/XYZ),获取活体小球藻藻液、活体葡萄球藻、活体等鞭金藻藻液各40个样本的拉曼光谱原始信息。即将制好的藻液切片固定在显微拉曼光谱仪物镜下方载物台上，激光束通过50X的物镜聚焦到样本的表面。其中曝光时间设置为ls，激光强度为lmv，累计次数一次。整个实验过程都是在恒温(约25°C)条件下进行的，图1是某小球藻、葡萄球藻与等鞭金藻样本的原始拉曼谱线。图2是某等鞭金藻同一藻体色素随时间推移产生分解下采集的拉曼信号。
[0030]由于原始拉曼受荧光干扰较大，荧光的产生会覆盖拉曼的信号，因此首先采用Rolling Circle filter去除荧光背景，凸显信号；最后对获得的拉曼曲线进行平滑处理，以提高信噪比。这些预处理的过程都是在软件Matlab中实现的，其中图3是某葡萄球藻液样本在对数期和稳定期经上述预处理后的拉曼光谱。
[0031]对120个藻液样本进行上述预处理，然后采用神经网络建立三种藻类的判别模型，其中将小球藻藻液、葡萄球藻、等鞭金藻藻液分别标定为“1”、“2”和“3”。随机选取小球藻藻液、葡萄球藻、等鞭金藻藻液各30个样本用于建模，各10个样本用于预测。对预处理后的拉曼光谱信息计算得到其胡萝卜素所在谱峰对应的拉曼强度比值，以它们作为输入变量，并设定网络输入层、隐含层、输出层的节点数分别为1，6，1，训练集的样本数是90，预测样本集为30个样本数，得到模型的判别率为100%，拟合残差为1.549X10_5。
[0032]小球藻藻液、葡萄球藻、等鞭金藻藻液各有10个预测样本，针对每个预测样本，采用雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪获取各个样本的拉曼光谱原始信息，并对拉曼光谱原始信息依次进行Rolling Circle filter去除突光和平滑处理,得到对应的预处理谱图，然后计算胡萝卜素所在谱峰1527CHT1与lieOcnT1的拉曼强度比值，再将该预测样本所计算得到的谱峰比值输入BP神经网络模型，与已知藻种的谱峰比值进行对比，获得预测样本的结果如图4所示，图中横坐标“I”代表小球藻藻液、“2”代表葡萄球藻、“3”代表等鞭金藻藻液，从图中可以看出每个预测样本的预测结果与标准的藻液类别数值存在一定差值，只要差值在±0.5之内，即可将该预测样本划分为对应的数值类别的藻类。
【权利要求】
1.一种结合拉曼光谱技术和谱峰比值法的藻种鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)取相同藻种在不同生长阶段下的多个样本，每个样本均为当前藻种的活体藻液，采用拉曼光谱仪获取各个样本的拉曼光谱原始信息； (2)对步骤(I)采集的拉曼光谱原始信息进行预处理，得到对应的预处理谱图，然后计算得到胡萝卜素所在谱峰对应的拉曼强度比值，记为谱峰比值； (3)更换藻种，重复操作步骤(I)和步骤(2)，获得不同藻种在各生长阶段下的胡萝卜素所对应的谱峰比值； (4)以所有藻种的谱峰比值作为输入，以与各谱峰比值相对应的藻种分类为输出，建立BP神经网络模型； (5)取待鉴别活体藻液，通过步骤(I)和步骤(2)的处理获得该待鉴别活体藻液的谱峰比值并输入所述BP神经网络模型，获得待鉴别活体藻液中所包含的藻种分类。
2.如权利要求1所述的结合拉曼光谱技术和谱峰比值法的藻种鉴别方法，其特征在于，在所述的步骤(I)中，将样本放置在拉曼光谱仪的载物台上，利用激光强度为Imv的激光束，并通过50X的物镜聚焦到样本的表面，曝光时间ls，得到所述的拉曼光谱原始信息。
3.如权利要求1所述的结合拉曼光谱技术和谱峰比值法的藻种鉴别方法，其特征在于，步骤(I)中，藻种的不同生长阶段是指对数期和稳定期。
4.如权利要求1所述的结合拉曼光谱技术和谱峰比值法的藻种鉴别方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的预处理为依次进行的去荧光背景处理和平滑处理。
5.如权利要求1所述的结合拉曼光谱技术和谱峰比值法的藻种鉴别方法，其特征在于，步骤(2)中，藻体内胡萝卜素的谱峰是指1527CHT1与lieOcnT1的强度比值。
6.如权利要求1所述的结合拉曼光谱技术和谱峰比值法的藻种鉴别方法，其特征在于，在建立所述的BP神经网络模型时，设置隐含层节点数为6。
7.如权利要求1所述的结合拉曼光谱技术和谱峰比值法的藻种鉴别方法，其特征在于，在所述的步骤(5)中，待鉴别活体藻液的谱峰比值输入BP神经网络模型中，与已知藻种的谱峰比值进行对比，获得待鉴别活体藻液中所包含的藻种分类。
【文档编号】G01N1/28GK103499560SQ201310460475
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】邵咏妮, 潘健, 何勇 申请人:浙江大学