利用暗场显微镜同时进行指纹识别与分析物检测的方法
【专利摘要】本发明涉及利用暗场显微镜同时进行指纹识别与分析物检测的方法，包括如下步骤：利用纳米等离子体激元材料和核酸适体制备纳米等离子体激元探针；处理基底并利用该基底获取潜指纹；将所述纳米等离子体激元探针滴加于已获取潜指纹的基底上，使得所述潜指纹与所述纳米等离子体激元探针结合；利用暗场显微镜进行检测。本发明提供的指纹分析方法不仅能够对潜指纹进行成像，而且能够同时检测指纹中所携带的化学分析物。结果表明，本发明提供的是一种简单快速的方法，可以对指纹样品进行直接的无损分析。
【专利说明】利用暗场显微镜同时进行指纹识别与分析物检测的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及指纹分析检测【技术领域】，具体涉及利用暗场显微镜同时进行指纹识别与分析物检测的方法。
【背景技术】
[0002]指纹分析技术已广泛应用于个体识别和法医调查等领域中。但迄今为止，在实际应用中，由于潜指纹不易被肉眼所见，但却是在犯罪现场留下的极为重要、有效的证据，因而在法医调查中具有重要意义。但到目前为止，指纹分析技术仅仅局限于以指纹特征来确认个人身份这一环节。而由于对潜指纹的处理程序复杂而条件严苛，所需仪器体积庞大且价值贵重，直接检测人的潜指纹中所携带的爆炸物、麻醉药品等化学分析物还停留在实验室研究阶段。因此，发展一种简单的、快速的、直接的、无损的、便携的、廉价的方法，能够同时进行指纹成像并且检测指纹中所携带的分析物，显得尤为重要。
[0003]现在潜指纹成像的方法众多，目前发展起来并被法医研究领域所采用的指纹成像技术主要包括:光学成像法、粉末法、茚三酮法、碘熏法、502胶熏法和真空金属沉积法等，它们分别适用于不同的指纹性质与检测条件，并且各有缺点。
[0004]光学检测法基本上不用对指纹进行处理，不会造成指纹的破坏，是多种方法中的首选。但是该方法对潜指纹显现的增强能力有限，并且所需仪器设备较为庞大且结构复杂昂贵，无法广泛普及，并且不适合现场检测。粉末法因操作简单、成本低廉、适用范围广而成为较为成熟的一种显现方法，但是容易对指纹纹线造成破坏，而且粉末颗粒悬浮于空气中，容易进入呼吸道对工作者造成较大的毒副作用。茚三酮法操作简单，并且能较好的显现纸张表面的潜指纹，也是鉴定工作者目前广泛采用的方法。但是该方法在指纹中氨基酸含量较少时显现效果较差，需要进一步后续处理。碘熏法是一种无损显现方法，可重复多次显现，尤其适合油脂类潜指纹。但该方法显色浅淡易受背景色干扰，拍照提取时困难。而且碘易升华，对人体也有一定毒害作用。502胶熏染法是处理非多孔表面上的潜指纹的有效方法。但该方法处理后指纹与背景的对比度是一个问题，所以还需要一些后处理。真空金属沉积法是处理非多孔表面上的潜指纹的另一种重要技术。但是仪器较为昂贵，操作繁琐，给现场检测带来很大障碍。
[0005]在已商业化并广泛应用的技术之外，近些年发展起来的技术还有:荧光法，以稀土材料、量子点或荧光染料结合到指纹上，借助荧光显微镜观察，但是所需材料对操作者有毒害作用。电化学法，主要有扫描电化学显微镜法、电化学发光法和电化学-表面等离子体共振法，有些方法能够检测指纹中的分析物，但需要贵重的大型仪器才能实现。质谱法，能够检测指纹中微量的分析物，但需要将指纹样品溶解或提取，是一种对指纹有完全破坏性的方法，而且需要大型的质谱仪。振动光谱法，主要指红外光谱和拉曼光谱，也能够检测出指纹中的分析物，缺点也是需要购置大型仪器，而且需要长时间操作。目前这些方法有很多可以做到检测指纹中携带的分析物，但各自的弱势也很明显。
[0006] 总之，现有的已被法医领域采用的技术中分别有其缺点，而且最重要的是不能在成像之外检测其中的化学分析物；近些年发展的先进技术有些能够检测分析物，但是不能实现无损分析，而且需要复杂贵重的大型仪器，不利于广泛普及与现场检测；另外，将暗场显微镜用于指纹分析领域的研究与应用还未见报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种利用暗场显微镜同时进行指纹识别与分析物检测的方法，首次将暗场显微镜应用于指纹分析的同时，对化学分析物进行检测。
[0008]本发明所述的利用暗场显微镜同时进行指纹识别与分析物检测的方法，包括如下步骤:S1，利用纳米等离子体激元材料和核酸适体制备纳米等离子体激元探针；S2，处理基底并利用该基底获取潜指纹；S3，将所述纳米等离子体激元探针滴加于已获取潜指纹的基底上，使得所述潜指纹与所述纳米等离子体激元探针结合；S4，利用暗场显微镜进行检测。本发明提供了一种新型的基于核酸适体的纳米等离子体激元探针在暗场显微镜下对潜指纹成像，并同时检测指纹中携带的化学分析物的通用方法。其中，核酸适体指的是经体外筛选技术筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段，是一类单链核酸分子的总称。纳米等离子体激元探针是指用尺寸在纳米级的等离子体激元材料做成的探针。
[0009]优选地，所述纳米等离子体激元材料为纳米金。由于纳米金本身具有良好的生物相容性，使得本发明所提供的纳米等离子体激元探针具有良好的生物相容性，从而使得本发明所提供的探针对操作者没有任何毒害作用。其中，所谓等离子体激元是常规概念，指的是光和纳米金属表面电子相互作用引起的电磁波模式，具有这种性质的纳米材料称为纳米等离子体激元材料。纳米金的制备可以根据现有技术中的已知的方法进行。
[0010]优选地,所述纳米金为直径40~60nm的球形金纳米颗粒,或边长40~60nm的立方体形金纳米颗粒。实际上，该纳米金可以是任何尺寸、形状的金纳米颗粒，上述40~60nm的数值仅作为优选实施例示出。
[0011]优选地，所述核酸适体是可卡因、溶菌酶、三磷酸腺苷、可天宁、吗啡或大麻酚的核酸适体。应该理解，本发明提供的方法具有普适性，只需要按照本发明的精神首先选择与分析物相应的核酸适体即可。当所述核酸适体是可卡因核酸适体时，可卡因的最低检测限优选为在约1.5~2cm2的指纹面积上的90ng可卡因。
[0012]优选地，所述步骤SI包括首先将核酸适体切割为两条单链DNA，从而使得所述纳米等离子体激元探针具有两种类型。采用两种类型的探针的原因在于:在没有分析物的时候，这两种类型的探针不会结合在一起，是单颗粒的分散状态，在显微镜下显绿色；当存在分析物的时候，这两种类型的探针能够结合在一起，是数个颗粒的聚集状态，在显微镜下显橙色或红色。更优选地，该两条单链DNA的3’端或5’端分别添加若干T碱基，例如10个。同时，该两条单链DNA分别被3’端巯基修饰或5’端巯基修饰。
[0013]优选地，每种所述纳米等离子体激元探针上结合有不与所述潜指纹结合的无关序列。在将两条单链DNA分别组装到纳米等离子体激元材料上时，还包括将一条无关序列的单链DNA同时组装到纳米等离子体激元材料上。从理论上讲，碱基数小于10的任何单链DNA都可以用来作为无关序列DNA，该无关序列DNA的作用是合理控制该两条DNA的组装密度。在两种类型的纳米等离子体激元探针上组装的分别是一条DNA单链与该无关序列以及另一条DNA单链与该无关序列。当单链DNA的3’端或5’端添加有若干T喊基并疏基修饰时，该无关序列为该若干T喊基疏基修饰的DNA,例如该无关序列为3’端疏基修饰的10个T碱基。
[0014]优选地，所述基底是用于暗场显微镜观察的载玻片或氧化铟锡导电玻璃片。事实上，在本发明使用氧化铟锡导电玻璃片的原因之一是为了用于扫描电子显微镜观察确认金纳米颗粒的聚集。进一步地，该基底还可以是硬塑料板、有机玻璃等平整透明的材料。
[0015]优选地，所述步骤S2包括将封闭剂覆盖到已获取潜指纹的基底上。封闭剂溶液被滴到玻片表面，因此封闭剂可以将玻片表面完全包裹，探针要么吸附在指纹上，要么就与封闭剂直接接触，而不能与玻片接触。探针与封闭剂接触，不会吸附到封闭剂上。如果探针与玻片接触，会吸附到玻片上，无法与吸附到指纹上的探针区分，就无法成像。该封闭剂可以降低背景，提高信噪比，从而提高成像与检测的灵敏度及特异性。所述步骤S2中对基底的处理包括利用肥皂水、丙酮、乙醇和去离子水对基底进行清洗，以除去玻片表面的灰尘和有机物，及其他影响观察及成像效果的杂质。
[0016]优选地，所述封闭剂是含有与所述纳米等离子体激元探针无任何非特异性结合的蛋白溶液。
[0017]优选地，所述封闭剂为酪蛋白溶液。该酪蛋白溶液的浓度优选0.1%~2%(w/v，质量体积比),更加优选为1%。
[0018]优选地，所述步骤S3包括利用磷酸盐缓冲液和去离子水冲洗，以除去未结合的所述纳米等离子体激元探针。所述步骤S3还包括在基底上滴加同浓度的两种探针。优选地，两种探针的浓度优选为均为0.1~0.5nM，更优选为0.2nM。 [0019]优选地，所述步骤S4包括利用倒置显微镜装配上暗场聚光镜进行观察。更优选地，本发明所述的暗场显微镜是采用倒置显微镜装配上暗场聚光镜(其数值孔径(NA)的范围为0.8<NA<0.95)以及不同放大倍数(60倍及4倍(NA=0.8))的物镜，并采用卤素灯(100W)作为白光光源，采用彩色电荷耦合元件(CCD)为成像元件，转接到计算机上显示，并用软件控制与处理成像。
[0020]实际上，目前还没有任何利用暗场显微镜进行指纹成像的报道，暗场显微镜一般用来观察布朗运动。其中应当注意的是，由于布朗运动的被观测物是动态的，而本发明目的在于对指纹进行成像，这就要求被观测物不能随意移动。本发明利用指纹中的分析物与纳米等离子体激元探针(修饰了具有特异性识别功能的核酸适体的金纳米颗粒)之间的相互作用，使探针固定在基底上，从而达到成像与检测的目的。此外，考虑到探针与基底分别的电荷性质，非特异性的静电吸附不可避免，而这会严重影响成像效果与检测灵敏度及特异性。所以，这是本发明操作过程中无法回避的难点，本发明提供的方法——在基底表面覆盖一层封闭剂层成功地解决了这一难题。最后，本发明相比于其他借助荧光显微镜观察的光致发光的潜指纹成像方法的优势在于探针的发光强度高且光学性质稳定，并且对操作者没有毒害作用。
[0021 ] 本发明提供的指纹分析方法不仅能够对潜指纹进行成像，而且能够同时检测指纹中所携带的化学分析物。结果表明，本发明提供的是一种简单快速的方法，可以对指纹样品进行直接的、无损的分析。本发明中主要使用的金纳米颗粒具有良好的生物相容性，其他所需化学、生物材料也均无人体毒害性。本发明所需试剂药品以及仪器设备相对廉价便携，易于标准化、商业化及大量推广。因此本发明为潜指纹的成像与分析物的检测及其实际应用提供了一种新的思路及技术支撑。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1是实施例1中潜指纹成像的低倍率暗场显微镜照片结果；
[0023]图2是实施例1中以高倍率暗场显微镜观察指纹中携带不同质量的可卡因时指纹成像的定性结果；
[0024]图3是实施例1中高倍率暗场显微镜观察指纹成像光点以半定量检测指纹中携带不同质量可卡因的结果；
[0025]图4是实施例1中以高倍率暗场显微镜观察指纹中携带可卡因的特异性检测时指纹成像的定性结果；
[0026]图5是实施例1中以高倍率暗场显微镜观察指纹中携带可卡因的特异性检测时指纹成像光点的半定量结果。
【具体实施方式】
[0027]下面结合附图，给出本发明的较佳实施例，并予以详细描述。
[0028]实施例1:基于核酸适体的纳米等离子体激元探针在暗场显微镜下对显微镜载玻片上的潜指纹成像并同时检测指纹中携带的可卡因
[0029](I)纳米等离子体激元探针的制备:150mL柠檬酸三钠水溶液(2.2mM)加热至沸15min,加入ImL氯金 酸水溶液(25mM)反应15min。降温至95°C,加入ImL氯金酸水溶液(25mM)反应30min，重复两次。而后取出55mL样品，并补加53mL水与2mL柠檬酸三钠水溶液(60mM)。重复加入ImL氯金酸水溶液(25mM)反应长大的步骤6次,得到直径50nm的球形金纳米颗粒Au NPs (该方法还可以制备直径40~60nm的球形金纳米颗粒,只需改变最后一步加入ImL氯金酸水溶液(25mM)反应长大步骤的重复次数)。将5 μ L的浓度为100 μ M的单链 DNAl (ss-DNAl，序列为 5’ -GTTCTTCAATGAAGTGGGACGACATTTTTTTTTT-SH-3’)或单链DNA2 (ss-DNA2，序列为 5’ -GGGAGTCAAGAACTTTTTTTTTT-SH-3’)与 5 μ L 的浓度为 100 μ M的单链DNA3 (ss-DNA3，序列为5’ -TTTTTTTTTT-SH-3’ )加入到400 μ L上述的金纳米颗粒溶液(0.2ηΜ)中室温孵育(其中ss-DNAl和ss-DNA2是可卡因的核酸适体被切割后的两条DNA, ss-DNA3是一条无关序列的DNA)。加入磷酸缓冲液(PB)至10mM，氯化钠(NaCl)溶液至0.1Μ，ρΗ7.0，孵育40小时。在4°C下于12000转离心20min，弃去上清，洗涤3次后分散于400 μ L磷酸钠盐缓冲液(PBS)中。
[0030](2)指纹基底的处理及潜指纹的获取:将暗场显微镜的载玻片分别在肥皂水、丙酮、乙醇、去离子水中超声清洗30min，N2吹干。玻片以酪蛋白封闭，将200 μ L溶于PBS中的酪蛋白(1%，w/v)滴加到玻片上，在37°C下孵育2小时，并在4°C下孵育12小时，而后水洗吹干。手指洗干净后负载不同质量的可卡因，而后轻轻地在玻片上按压采集指纹。
[0031](3)指纹处理过程:分别在玻片上滴加45 μ L两种不同的纳米等离子体激元探针(Au NPs - DNAl和Au NPs - DNA2，两种探针的浓度均为0.2ηΜ,，室温下孵育30min。用PBS和去离子水冲洗并吹干，以除去未结合的探针。
[0032](4)暗场显微镜检测:倒置显微镜装配上暗场聚光镜(其数值孔径(NA)的范围为0.8<NA<0.95)以及60倍及4倍的物镜(ΝΑ=0.8)，白光光源为100W的卤素灯，成像元件为彩色(XD，并转接显示到计算机上。
[0033]采用暗场显微镜上4倍物镜观察潜指纹的暗场彩色照片结果见附图1。事实上，由于指纹的尺寸远大于聚光镜产生的暗场视野，此照片来自于多张不同指纹区域的暗场彩色照片拼接的结果。本图表明在明亮的指纹凸起与黑暗的基底之间对比，此结果提供了一个清晰可辨的指纹轮廓。并且除了指纹凸起的花样(指纹的第一层次的分辨)之外，还可以清楚地识别出指纹第二层次(包括末端、交叉、双叉和岛等)以及第三层次(汗孔)。这表明本发明提供的方法能给出轮廓清晰、分辨率高、对比度高的成像结果。其中，红圈表示指纹第二层次(包括末端、交叉、双叉和岛等)，绿圈表示指纹第三层次(汗孔)。
[0034]负载有不同质量的可卡因的指纹在高分辨率的暗场显微镜下观察得到的暗场彩色照片如附图2ο从a至Ij h,可卡因的负载量分别为Ong, 150ng, 300ng, 750ng, 1.5 μ g, 3 μ g,15μg和30μg。结果显示随着可卡因的负载量的增加，高分辨率图像整体上逐渐从绿色向红色变化，也就是说绿色的光点逐渐减少而橙红色的光点逐渐增多。我们已经证明橙色、红色的光点来自于可卡因诱导的金纳米颗粒聚集，因此，我们随机选取了指纹凸起的区域中300个光点，统计了其中橙色和红色的光点所占的百分比，结果见附图3。可以看到此百分比与可卡因质量的对数之间有很好的线性关系。计算(空白样品的信号值加上3倍的空白样品的标准差为最低检测限)得出可卡因负载量的最低检测限为90ng。
[0035]采用此种分析 方法对可卡因的两种代谢产物苯甲酰爱康宁(benzoyl ecgonine,BE)与爱康宁甲基酯(ecgonine methyl ester, ΕΜΕ)进行检测。这两种物质与可卡因化学结构极为相似，我们以此作为可卡因的类似物证明可卡因检测特异性。负载有相同质量的可卡因及其类似物的指纹在高分辨率的暗场显微镜下观察得到的暗场彩色照片如附图4，从a到d分别为空白组、BE组、EME组和可卡因组。以我们的半定量方法得到的特异性检测结果如附图5。两种类似物得到的结果与可卡因得到的结果之间有巨大差别，几乎相当于空白样本。以上结果表明，本发明中基于核酸适体的纳米等离子体激元探针在暗场显微镜下检测指纹中携带的可卡因的灵敏性及特异性方面均表现出更好的检测性能。
[0036]实施例2:基于核酸适体的纳米等离子体激元探针在暗场显微镜下对显微镜载玻片上的潜指纹成像并同时检测指纹中携带的可卡因
[0037](I)纳米等离子体激元探针的制备:将氯金酸加入到IOmL的十六烷基三甲基氯化铵水溶液(0.1M)中，至其浓度为0.25mM。加入0.45mL的硼氢化钠水溶液(20mM)，30°C反应I小时，作为种子溶液。配置两瓶生长液:将320mg十六烷基三甲基氯化铵加入9.605mL去离子水中，依次加入0.25mL氯金酸水溶液(IOmM), 0.01mL溴化钠水溶液(10mM)，0.09mL抗坏血酸水溶液(40mM)。反应30min，重复两次。而后取出55mL样品，并补加53mL水与2mL柠檬酸三钠水溶液(60mM)。一瓶生长液中加入0.45mL上述种子溶液并振荡5秒，然后从中取出0.45mL转入另一瓶生长液。充分混合10秒，于30°C反应15分钟，离心浓缩至lmL，得到边长45nm的立方体形金纳米颗粒(Au NPs)(该方法还可以制备直径40~60nm的立方体形金纳米颗粒，只需改变最后一步加入种子溶液的体积)。将5 μ L的浓度为100 μ M的单链 DNAl (ss-DNAl，序列为 5’-GTTCTTCAATGAAGTGGGACGACATTTTTTTTTT-SH-3’)或单链 DNA2(ss-DNA2，序列为 5’ -GGGAGTCAAGAACTTTTTTTTTT-SH-3’)与 5 μ L 的浓度为 100 μ M 的单链DNA3 (ss-DNA3，序列为5’-TTTTTTTTTT-SH_3’)加入到400 μ L上述的金纳米颗粒溶液中室温孵育(其中ss-DNAl和SS-DNA2是可卡因的核酸适体被合理的切割后的两条DNA，ss-DNA3是一条无关序列的DNA)。加入磷酸缓冲液(PB)至IOmM,氯化钠(NaCl)溶液至0.1Μ,ρΗ7.0,孵育40小时。在4°C下于12000转离心20min，弃去上清，洗涤3次后分散于400 μ L磷酸钠盐缓冲液(PBS)中。
[0038](2)指纹基底的处理及潜指纹的获取:将暗场显微镜的载玻片分别在肥皂水、丙酮、乙醇、去离子水中超声清洗30min，N2吹干。玻片以酪蛋白封闭，将200 μ L溶于PBS中的酪蛋白(1%，w/v)滴加到玻片上，在37°C下孵育2小时，并在4°C下孵育12小时，而后水洗吹干。手指洗干净后负载不同质量的可卡因，而后轻轻地在玻片上按压采集指纹。
[0039](3)指纹处理过程:分别在玻片上滴加45 μ L两种不同的纳米等离子体激元探针(Au NPs - DNAl和Au NPs - DNA2，浓度均为0.2ηΜ,优选范围为0.1~0.5ηΜ),室温下孵育30min。用PBS和去离子水冲洗并吹干。
[0040](4)暗场显微镜检测:倒置显微镜装配上暗场聚光镜(其数值孔径(NA)的范围为
0.8<NA<0.95)以及60倍及4倍的物镜(NA=0.8)，白光光源为100W的卤素灯，成像元件为彩色(XD，并转接显示到计算机上。
[0041]实施例3:基于核酸适体的纳米等离子体激元探针在暗场显微镜下对显微镜载玻片上的潜指纹成像并同时检测指纹中携带的三磷酸腺苷[0042](I)纳米等离子体激元探针的制备:150mL柠檬酸三钠水溶液(2.2mM)加热至沸15min,加入ImL氯金酸水溶液(25mM)反应15min。降温至95°C,加入ImL氯金酸水溶液(25mM)反应30min，重复两次。而后取出55mL样品，并补加53mL水与2mL柠檬酸三钠水溶液(60mM)。重复加入ImL氯金酸水溶液(25mM)反应长大的步骤6次，得到直径50nm的球形金纳米颗粒(Au NPs)(该方法还可以制备直径40~60nm的球形金纳米颗粒,只需改变最后一步加入ImL氯金酸水溶液(25mM)反应长大步骤的重复次数)。将5μ L的浓度为100 μ M 的单链 DNAI’ (ss-DNAl’，序列为 5’ -HS-TTTTTTTTTTACCTGGGGGAGTAT-3’)或单链DNA2’ (ss-DNA2’，序列为 5’ -HS-TTTTTTTTTTTGCGGAGGAAGGT-3’)与 5 μ L 的浓度为 100 μ M的单链DNA3’(ss-DNA3’，序列为5’ -TTTTTTTTTT-SH-3’)加入到400 μ L上述的金纳米颗粒溶液(0.2ηΜ)中室温孵育(其中ss-DNAl’和ss_DNA2’是三磷酸腺苷的核酸适体被合理的切割后的两条DNA，SS-DNA3’是一条无关序列的DNA)。加入磷酸缓冲液(PB)至10禮，氯化钠(NaCl)溶液至0.1Μ，ρΗ7.0，孵育40小时。在4°C下于12000转离心20min，弃去上清，洗涤3次后分散于400 μ L磷酸钠盐缓冲液(PBS)中。
[0043](2)指纹基底的处理及潜指纹的获取:将暗场显微镜的载玻片分别在肥皂水、丙酮、乙醇、去离子水中超声清洗30min，N2吹干。玻片以酪蛋白封闭，将200 μ L溶于PBS中的酪蛋白(1%，w/v)滴加到玻片上，在37°C下孵育2小时，并在4°C下孵育12小时，而后水洗吹干。手指洗干净后负载不同质量的三磷酸腺苷，而后轻轻地在玻片上按压采集指纹。
[0044](3)指纹处理过程:分别在玻片上滴加45 μ L两种不同的纳米等离子体激元探针(Au NPs - DNAl和Au NPs - DNA2，浓度均为0.2ηΜ,优选范围为0.1~0.5ηΜ),室温下孵育30min。用PBS和去离子水冲洗并吹干。
[0045](4)暗场显微镜检测:倒置显微镜装配上暗场聚光镜(其数值孔径(NA)的范围为
0.8<NA<0.95)以及60倍及4倍的物镜(NA=0.8)，白光光源为IOOW的卤素灯，成像元件为彩色(XD，并转接显示到计算机上。[0046]实施例4:基于核酸适体的纳米等离子体激元探针在暗场显微镜下对氧化铟锡导电玻璃上的潜指纹成像并同时检测指纹中携带的可卡因
[0047](1)纳米等离子体激元探针的制备:150mL柠檬酸三钠水溶液(2.2mM)加热至沸15min,加入ImL氯金酸水溶液(25mM)反应15min。降温至95°C,加入ImL氯金酸水溶液(25mM)反应30min，重复两次。而后取出55mL样品，并补加53mL水与2mL柠檬酸三钠水溶液(60mM)。重复加入ImL氯金酸水溶液(25mM)反应长大的步骤6次，得到直径50nm的球形金纳米颗粒(Au NPs)(该方法还可以制备直径40~60nm的球形金纳米颗粒,只需改变最后一步加入ImL氯金酸水溶液(25mM)反应长大步骤的重复次数)。将5μ L的浓度为100 μ M 的单链 DNAl (ss-DNAl，序列为 5’-GTTCTTCAATGAAGTGGGACGACATTTTTTTTTT-SH-3’ )或单链 DNA2 (ss-DNA2，序列为 5’ -GGGAGTCAAGAACTTTTTTTTTT-SH-3’)与 5 μ L 的浓度为100 μ M 的单链 DNA3 (ss-DNA3，序列为 5’ -TTTTTTTTTT-SH-3’ )加入到 400 μ L 上述的金纳米颗粒溶液中室温孵育(其中ss-DNAl和ss-DNA2是可卡因的核酸适体被合理的切割后的两条DNA, ss-DNA3是一条无关序列的DNA)。加入磷酸缓冲液(PB)至IOmM,氯化钠(NaCl)溶液至0.1Μ，ρΗ7.0，孵育40小时。在4°C下于12000转离心20min，弃去上清，洗涤3次后分散于400 μ L磷酸钠盐缓冲液(PBS)中。
[0048](2)指纹基底的处理及潜指纹的获取:将氧化铟锡导电玻璃片分别在肥皂水、丙酮、乙醇、去离子水中超声清洗30min，N2吹干。玻片以酪蛋白封闭，将200 μ L溶于PBS中的酪蛋白(1%，w/v)滴加到玻片上，在37°C下孵育2小时，并在4°C下孵育12小时，而后水洗吹干。手指洗干净后负载不同质量的可卡因，而后轻轻地在玻片上按压采集指纹。
[0049](3)指纹处理过程:分别在玻片上滴加45 μ L两种不同的纳米等离子体激元探针(Au NPs - DNAl和Au NPs - DNA2，浓度均为0.2ηΜ,优选范围为0.1~0.5ηΜ),室温下孵育30min。用PBS和去离子水冲 洗并吹干。
[0050](4)暗场显微镜检测:倒置显微镜装配上暗场聚光镜(其数值孔径(NA)的范围为
0.8<NA<0.95)以及60倍及4倍的物镜(NA=0.8)，白光光源为100W的卤素灯，成像元件为彩色(XD，并转接显示到计算机上。
[0051]以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。
【权利要求】
1.利用暗场显微镜同时进行指纹识别与分析物检测的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: Si，利用纳米等离子体激元材料和核酸适体制备纳米等离子体激元探针； S2，处理基底并利用该基底获取潜指纹； S3，将所述纳米等离子体激元探针滴加于已获取潜指纹的基底上，使得所述潜指纹与所述纳米等离子体激元探针结合； S4，利用暗场显微镜进行检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳米等离子体激元材料为纳米金。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述纳米金为直径40~60nm的球形金纳米颗粒,或边长40~60nm的立方体形金纳米颗粒。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸适体是可卡因、溶菌酶、三磷酸腺苷、可天宁、吗啡或大麻酚的核酸适体。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤SI包括首先将核酸适体切割为两条单链DNA，从而使得所述纳米等离子体激元探针具有两种类型。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，每种所述纳米等离子体激元探针上结合有不与所述潜指纹结合的无关序列。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基底是用于暗场显微镜观察的载玻片或氧化铟锡导电玻璃片。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2包括将封闭剂覆盖到已获取潜指纹的基底上。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述封闭剂是含有与所述纳米等离子体激元探针无任何非特异性结合的蛋白溶液。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述封闭剂是酪蛋白溶液。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3包括利用磷酸盐缓冲液和去离子水冲洗，以除去未结合的所述纳米等离子体激元探针。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S4包括利用倒置显微镜装配上暗场聚光镜进行观察。
【文档编号】G01N33/543GK103735271SQ201310633293
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月2日 优先权日:2013年12月2日
【发明者】樊春海, 李迪, 李昆 申请人:中国科学院上海应用物理研究所