一种基于差分的光片照明显微方法和装置制造方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于差分的光片照明显微方法，包括以下步骤：1）照明光束经扩束后转换为平行偏振光和垂直偏振光；2）单独采用平行偏振光，以光斑为实心的平行偏振光为第一照明光，该第一照明光转换为第一圆偏照明光后，经聚焦模块聚焦到荧光样品表面，并采集荧光样品发出的荧光，得到第一幅图；3）单独采用垂直偏振光，对该垂直偏振光进行调制，调制为具有空心光斑的第二照明光，第二照明光转换为第二圆偏照明光后，经聚焦模块聚焦到荧光样品表面，并采集荧光样品发出的荧光，得到第二幅图；4）计算机对步骤2）和步骤3）中的两幅图进行差分处理，完成对样品的一次扫描。本发明还公开了一种基于差分的光片照明显微装置。
【专利说明】—种基于差分的光片照明显微方法和装置
【技术领域】
[0001]本发明属于光片照明显微领域，特别涉及一种基于差分的光片照明显微方法和装置。
【背景技术】
[0002]光片照明显微镜使用一层光束从侧面激发荧光样品，并在入射照明光路的垂直方向通过探测器接收荧光，实现成像。通过移动样品使入射光路激发不同的平面，且激发光束可以从左右两个方向入射到样品上，光束的角度可以改变，使用光片照明技术，无需对样品切片，我们可以很容易得到整个组织的3D图像。由于样品受激发的平面就是成像平面，所以可以将光漂白和光学损伤降低到最低。因此光片照明显微镜在分析细胞组织结构等领域得到了广泛的应用。
[0003]传统的光片照明显微装置如图1所示，包括沿光路依次布置的激光器1、扩束透镜组、聚焦模块、样品、荧光收集模块和计算机；其中，扩束透镜组包括第一透镜2和第二透镜3，聚焦模块包括沿光路依次布置的狭缝4、柱面镜5和第一物镜6，荧光收集模块包括沿样品荧光光路依次布置的第一物镜9、第三透镜10和探测器11。该装置的具体工作过程如下:样品7放置在纳米平移台8上，激光器I发出的光束经第一透镜2和第二透镜3扩束后，经狭缝4入射至柱面镜5，由柱面镜5出射的光束经第一物镜6聚焦到样品7表面，样品发出的光依次通过第二物镜9和第三透镜10进入探测器11内，探测器11将采集到的图像传输至计算机12进行分析处理。
[0004]但是由于显微镜的分辨能力和物镜的数值孔径有关，数值孔径越大，聚焦在样品面的光斑就越小，显微镜的分辨能力也就越高，同时成像深度又和数值孔径成反比，数值孔径越大，成像深度越小，因此传统的光片照明显微镜只能在亚细胞水平观察动植物活体动态，无法在保证成像深度的同时实现超分辨显微成像。
【发明内容】
[0005]本发明提出了一种基于差分的光片照明显微方法和装置，首先利用偏振分光镜(PBS)将照明光束分成两束光，并用位相板对其中一束光进行调制，分别利用这两束光对样品进行照明，再对所得的两幅图进行差分处理，在保证成像深度的同时实现超分辨效果。
[0006]一种基于差分的光片照明显微方法，针对荧光样品包括以下步骤:
[0007]I)照明光束经扩束后转换为平行偏振光和垂直偏振光；
[0008]2)单独采用平行偏振光，以光斑(如图4所示)为实心的平行偏振光为第一照明光，该第一照明光转换为第一圆偏照明光后，经聚焦模块聚焦到突光样品表面，并米集突光样品发出的荧光，得到第一幅图；
[0009]3)单独采用垂直偏振光，对该垂直偏振光进行调制，调制为具有空心光斑(如图5所示)的第二照明光，第二照明光转换为第二圆偏照明光后，经聚焦模块聚焦到荧光样品表面，并采集荧光样品发出的荧光，得到第二幅图；[0010]4)计算机对步骤2)和步骤3)中的两幅图进行差分处理，完成对样品的一次扫描。
[0011]在步骤I)中，照明光束经偏振分光镜分成两束正交的平行偏振光和垂直偏振光，扩束后的照明光束经过偏振分光镜得到透射光束与反射光束，其中，透射光束为平行偏振光(P光)，反射光束为垂直偏振光(S光)。
[0012]在步骤2)和步骤3)中，利用快门控制平行偏振光和垂直偏振光的通过。快门控制平行偏振光和垂直偏振光所处光路的通断，实现单独采用平行偏振光和垂直偏振光对样品的照明。
[0013]在步骤I)中，利用液晶光阀将将扩束后的照明光束变成平行偏振光和垂直偏振光，本发明还可以采用液晶光阀将照明光束转变换为平行偏振光和垂直偏振光，其中，平行偏振光经偏振分光镜透射，垂直偏振光经偏振分光镜反射，并利用快门控制偏振分光镜反射和透射的光路通断。
[0014]进一步，荧光样品放置在纳米平台上，利用计算机控制纳米平台移动，完成对荧光样品的二维扫描。
[0015]本发明还提供了一种基于差分的光片照明显微装置，包括沿光路依次布置的激光器、扩束透镜组、聚焦模块、荧光收集模块和计算机，且所述的扩束透镜组和聚焦模块之间设有:
[0016]分光组件，用于将扩束透镜组出射的照明光束分为平行偏振光和垂直偏振光；
[0017]位相板,将垂直偏振光的光斑调制为空心光斑。
[0018]其中，所述的分光组件为第一偏振分光镜，第一偏振分光镜将扩束透镜组出射的光路分为平行偏振光光路和垂直偏振光光路，所述的位相板位于垂直偏振光光路上。
[0019]其中，所述的平行偏振光光路和垂直偏振光光路分别设有控制光路通断的快门。
[0020]优选的，所述的分光组件还可以为液晶光阀，所述液晶光阀出射的平行偏振光和垂直偏振光经第二偏振分光镜分为平行偏振光光路和垂直偏振光光路，所述的位相板位于垂直偏振光光路上。
[0021 ] 同时,还设有将平行偏振光光路和垂直偏振光光路转换为同轴光路的第三偏振分光镜，经第三偏振分光镜出射的平行偏振光和垂直偏振光具有同轴的光路，且入射至聚焦模块，用于对荧光样品进行照明。
[0022]本发明原理如下:
[0023]在基于差分的光片照明显微镜中，首先利用一个偏振分光镜，将激光发出的照明光束分为两个正交的线性偏振分量，其中垂直偏振光(s光)以90°反射,而平行偏振光(P光)则透射而出，平行偏振光光斑如图4所示。全部透射而出的平行偏振光(P光)经过一个偏振分光镜全部透射，然后再经过一个四分之一波片，变成第一圆偏光，第一圆偏光经狭缝和柱面镜后变成第一线光斑，再经物镜聚焦到样品表面，激发样品发出荧光，同时在垂直方向被另一物镜收集并被探测器接收得到第一幅图像。另一束被90°全部反射的垂直偏振光(s光)被一个反射镜反射后，经位相板对s光进行调制，得到如图5所示的光斑，再经反射镜和另一个偏振分光镜全部反射后，最后经四分之一波片，变成第二圆偏光，第二圆偏光经狭缝和柱面镜后变成第二线光斑，再经物镜聚焦到样品表面，激发样品发出荧光，并在垂直方向被另一物镜收集并被探测器接收得到第二幅图像。其中可以通过相应的快门或液晶光阀对两束光进行时序控制。如图6所示，通过对收集到的两幅图像进行差分处理，可以得到暗斑的图像，显然暗斑部分的宽度Z2比原有的光斑宽度Z1更小，因此能够在保证成像深度的同时实现超分辨成像，获得衍射极限之下的图像。完成单点扫描后，接着计算机控制纳米平移台使样品完成二维扫描成像，同原有的光片照明显微镜相比，本发明在保证成像深度的同时，能够实现超分辨成像，克服了传统光片照明显微镜成像深度和分辨率之间的矛盾。
[0024]与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果:
[0025](I)相对于原有的光片照明显微镜，能够在保证成像深度的同时实现超分辨成像；
[0026](2)装置结构简单，数据处理方便。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1为传统的光片照明显微装置示意图；
[0028]图2为由快门控制的光片显微装置示意图；
[0029]图3为由液晶光阀控制的光片显微装置示意图；
[0030]图4为平行偏振光(P光)光斑不意图；
[0031]图5为垂直偏振光(s光)经位相板调制后的光斑示意图；
[0032]图6为样品面上两束光斑差分的示意图。
【具体实施方式】
[0033]下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不限于此。
[0034]实施例1
[0035]如图2所示，一种针对荧光样品的由快门控制的基于差分的光片照明显微装置，包括激光器I，第一透镜2,第二透镜3,第一偏振分光镜13,第一,决门14,第二偏振分光镜15，四分之一波片20，狭缝4，柱面镜5，第一物镜6，第一反射镜16，位相板17，第二快门18，第二反射镜19，样品7，纳米平移台8，第二物镜9，第三透镜10，探测器11和计算机12。
[0036]采用图2所示的装置实现针对样品的基于差分的光片照明显微方法，其过程如下:
[0037](I)激光器I发出照明光，经第一透镜2和第二透镜3扩束；
[0038](2)扩束后的照明光经第一偏振分光镜13分成两束正交的线偏光,其中垂直偏振光(s光)以90°反射，而平行偏振光(P光)则透射而出；
[0039](3)第一快门14打开，使平行偏振光(P光)通过，平行偏振光(P光)的光斑如图4所不(在第一偏振分光镜13和第一,决门14之间虚线处),再经第二偏振分光镜15全部透射后，经四分之一波片20变成圆偏光，最后形成的圆偏光经狭缝4和柱面镜5变成线光斑，线光斑经第一物镜6聚焦到样品7表面，对样品7照明，同时在垂直照明光光轴方向由第二物镜9收集样品发出的光，并由第三透镜10聚焦到探测器11，得到第一幅图；
[0040](4)被90°反射的垂直偏振光(s光)经第一反射镜16反射,再经过位相板17,通过相应的调制，形成如图5所示的光斑(相位板17和第二快门18之间的虚线处)，在得到第一幅图后，立刻关闭第一开关14，并打开第二快门18，使得经过调制的光再经第二反射镜19反射，再经第二偏振分光镜15反射，最后经四分之一波片20变成圆偏光，经狭缝4和柱面镜5变成线光斑，线光斑经第一物镜6聚焦到样品7表面，对样品7照明，同时在垂直照明光光轴方向由第二物镜9收集样品发出的光，并由第三透镜10聚焦到探测器11，得到第二幅图；
[0041](5)计算机12将对得到的两幅图进行差分处理，完成第一次扫描；
[0042](6)样品7所在的纳米平台8与计算机12相连，通过计算机12来控制纳米平移台8使样品7移动完成二维扫描成像。
[0043]实施例2
[0044]如图3所示，一种针对荧光样品的由液晶光阀控制的基于差分的光片照明显微装置，包括激光器I，第一透镜2,第二透镜3,液晶光阀21,第一偏振分光镜13,第二偏振分光镜15,四分之一波片20,狭缝4,柱面镜5,第一物镜6,第一反射镜16,位相板17,第二反射镜19，样品7，纳米平移台8，第二物镜9，第三透镜10，探测器11和计算机12。
[0045]采用图3所示的装置实现针对样品的基于差分的光片照明显微方法，其过程如下:
[0046](I)激光器I发出照明光，经第一透镜2和第二透镜3扩束；
[0047](2)首先利用液晶光阀21将扩束后的照明光变成平行偏振光(P光)，平行偏振光(P光)的光斑如图4所不(在第一偏振分光镜13和第二偏振分光镜15之间虚线处)；
[0048](3)平行偏振光(P光)经第一偏振分光镜13和第二偏振分光镜15全部透射后,经四分之一波片20变成圆偏光，最后形成的圆偏光经狭缝4和柱面镜5变成线光斑，线光斑经第一物镜6聚焦到样品7表面，对样品7照明，同时在垂直照明光光轴方向由第二物镜9收集样品发出的光，并由第三透镜10聚焦到探测器11，得到第一幅图；
[0049](4)得到第一幅图以后,利用液晶光阀21将照明光变成垂直偏振光(s光),垂直偏振光(s光)被第一偏振分光镜13反射后,经第一反射镜13反射,再经过位相板17,通过相应的调制，形成如图5所示的光斑(相位板17和第二反射镜19之间的虚线处)，经过调制的光再经第二反射镜19反射，再经第二偏振分光镜15反射，最后经四分之一波片20变成圆偏光，最后形成的圆偏光经狭缝4和柱面镜5变成线光斑，线光斑经第一物镜6聚焦到样品7表面,对样品7照明，同时在垂直照明光光轴方向由第二物镜9收集样品发出的光，并由第三透镜10聚焦到探测器11，得到第二幅图；
[0050](5)计算机12对得到的两幅图进行差分处理，完成第一次扫描；
[0051](6)样品7所在的纳米平台8与计算机12相连，通过计算机12来控制纳米平移台8使样品7移动完成二维扫描成像。
[0052]在上述的两个实施例中，如图6所示，计算机通过对收集到的两幅图像进行差分处理，可以得到暗斑的图像，显然暗斑部分的宽度Z2比原有的光斑宽度Z1更小，因此能够在保证成像深度的同时实现超分辨成像，获得衍射极限之下的图像，完成单点扫描后，接着计算机控制纳米平移台使样品完成二维扫描成像，同原有的光片照明显微镜相比，本发明在保证成像深度的同时，能够实现超分辨成像，克服了传统光片照明显微镜成像深度和分辨率之间的矛盾。
【权利要求】
1.一种基于差分的光片照明显微方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)照明光束经扩束后转换为平行偏振光和垂直偏振光； 2)单独采用平行偏振光，以光斑为实心的平行偏振光为第一照明光，该第一照明光转换为第一圆偏照明光后，经聚焦模块聚焦到荧光样品表面，并采集荧光样品发出的荧光，得到第一幅图； 3)单独采用垂直偏振光，对该垂直偏振光进行调制，调制为具有空心光斑的第二照明光，第二照明光转换为第二圆偏照明光后，经聚焦模块聚焦到荧光样品表面，并采集荧光样品发出的荧光，得到第二幅图； 4)计算机对步骤2)和步骤3)中的两幅图进行差分处理，完成对样品的一次扫描。
2.如权利要求1所述的基于差分的光片照明显微方法，其特征在于，在步骤I)中，照明光束经偏振分光镜分成两束正交的平行偏振光和垂直偏振光。
3.如权利要求1所述的基于差分的光片照明显微方法，其特征在于，在步骤2)和步骤3)中，利用快门控制平行偏振光和垂直偏振光的通过。
4.如权利要求1所述的基于差分的光片照明显微方法，其特征在于，在步骤I)中，利用液晶光阀将将扩束后的照明光束变成平行偏振光和垂直偏振光。
5.如权利要求1所述的基于差分的光片照明显微方法，其特征在于，荧光样品放置在纳米平台上，利用计算机控制纳米平台移动，完成对荧光样品的二维扫描。
6.一种基于差分的光片照明显微装置，包括沿光路依次布置的激光器、扩束透镜组、聚焦模块、荧光收集模块和计算机，其特征在于，所述的扩束透镜组和聚焦模块之间设有: 分光组件，用于将扩束透镜组出射的照明光束分为平行偏振光和垂直偏振光； 位相板，将垂直偏振光的光斑调制为空心光斑。
7.如权利要求6所述的基于差分的光片照明显微装置，其特征在于，所述的分光组件为第一偏振分光镜，第一偏振分光镜将扩束透镜组出射的光路分为平行偏振光光路和垂直偏振光光路，所述的位相板位于垂直偏振光光路上。
8.如权利要求7所述的基于差分的光片照明显微装置，其特征在于，所述的平行偏振光光路和垂直偏振光光路分别设有控制光路通断的快门。
9.如权利要求6所述的基于差分的光片照明显微装置，其特征在于，所述的分光组件为液晶光阀，所述液晶光阀出射的平行偏振光和垂直偏振光经第二偏振分光镜分为平行偏振光光路和垂直偏振光光路，所述的位相板位于垂直偏振光光路上。
10.如权利要求7和9所述的基于差分的光片照明显微装置，其特征在于，还设有将平行偏振光光路和垂直偏振光光路转换为同轴光路的第三偏振分光镜。
【文档编号】G01N21/64GK103837513SQ201410057269
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年2月20日 优先权日:2014年2月20日
【发明者】刘旭, 蔡欢庆, 葛剑虹, 匡翠方 申请人:浙江大学