降低邻苯二甲醛荧光法测铵氮的试剂空白的方法
【专利摘要】本发明的降低邻苯二甲醛荧光法测铵氮的试剂空白的方法，包括：1）采用煮沸法去除碱性介质溶液和络合剂-碱性介质缓冲溶液中的铵氮；2）采用HLB小柱固相萃取法去除邻苯二甲醛或其衍生物和Na2SO3的混合溶液中的铵氮。本发明为降低方法的空白，提出降低邻苯二甲醛荧光法测铵氮的试剂空白，通过这样的方法来降低该法检测限。当邻苯二甲醛荧光法测铵氮的各种试剂均采用相应方法去除铵氮时，对应空白的荧光值相对于未处理的降低了87.65%，去除效果非常显著，且不影响各试剂与铵氮的反应性能。
【专利说明】降低邻苯二甲醛荧光法测铵氮的试剂空白的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及铵氮测定，具体是邻苯二甲醛荧光法测铵氮，更具体是降低邻苯二甲 醛荧光法测铵氮的试剂空白的方法。
【背景技术】
[0002] 铵氮是水体中浮游植物可直接利用的无机氮形态[Harrison, W.G., Harris, L. R. , Irwin, B.D. , 1996. The kinetics of nitrogen utilization in the oceanic mixed layer: Nitrate and ammonium interactions at nanomolar concentrations. Limnology and 0ceanography41，16-32·]。水体中铵氮以游离氨（NH3)或铵根离子 (nh4+)的形式存在。铵氮是指游离氨和铵根离子的总称。在内陆水体和近岸海域，水体 中铵氮含量较高，甚至可导致水体富营养化[Painting, S.J·，Devlin, M J·，Malcolm, S. J. , et al，2007. Assessing the impact of nutrient enrichment in estuaries: Susceptibility to eutrophication. Marine Pollution Bulletin 5，74-90]。然而，在 一些大洋表层海水中，铵氮含量通常低于1 Wn〇l/L，甚至低至nmol/L级别[Johnson，M.T.， Liss，P. S. , Bell, T. G. , et al，2008. Field observations of the ocean-atmosphere exchange of ammonia: Fundamental importance of temperature as revealed by a comparison of high and low latitudes. Global Biogeochemical Cycles 22， 1-15]〇 测定海水中低浓度的铵氮浓度，目前广泛采用的方法为邻苯二甲醒（〇-phthaldialdehyde， 简称0ΡΑ)荧光法，该法基于的原理为：在碱性介质中，亚硫酸钠存在下，0ΡΑ与铵氮发生荧 光反应，生成具有荧光强度的异吲哚化合物。采用该法测定实际水样时，有时会加入EDTA 络合剂掩蔽金属离子。该法具有选择性好、灵敏度高等优点，但由于受方法空白的影响，检 测限仍然无法满足nmol/L级别海水的测定要求。
【发明内容】
[0003] 为了克服邻苯二甲醛荧光法受方法空白的影响，降低检测限，本发明提供一种降 低邻苯二甲醛荧光法测铵氮的试剂空白的方法。
[0004] 方法空白的可能来源有仪器、试剂、实验室空气环境等，其中，试剂是方法空白的 最主要来源。因此，本发明为降低方法的空白，提出降低邻苯二甲醛荧光法测铵氮的试剂空 白，通过这样的方法来降低该法检测限。
[0005] 本发明的降低邻苯二甲醛荧光法测铵氮的试剂空白的方法，包括： 1) 采用煮沸法去除碱性介质溶液和络合剂-碱性介质缓冲溶液中的铵氮； 2) 采用HLB小柱固相萃取法去除邻苯二甲醛或其衍生物和Na2S03的混合溶液中的铵 氮。
[0006] 进一步，所述1)的具体过程为：取待处理液加至事先放有沸石的三角烧瓶中，然 后加入70%量待处理液的超纯水，加热煮沸，至溶液最终体积为待处理液原体积时，停止加 热，用冰浴冷却溶液至常温，倒入洁净的试剂瓶中，盖紧、密封保存。
[0007] 较佳地，密封保存采用双层聚乙烯塑料袋密封保存。
[0008] 上述方法中，为了方便计量，溶液最终体积采取称量的方法确定，其中，溶液密度 视为 1. 〇 g/mL。
[0009] 所述2)的具体过程为：混合溶液室温放置8小时以上，使混合溶液以每分钟不超 过60滴的速度通过HLB小柱固相萃取装置中的HLB小柱流至棕色玻璃瓶中，于棕色玻璃瓶 中密封冷藏。
[0010] HLB小柱固相萃取装置中的小柱选自：0asis HLB小柱或C18填料小柱。
[0011] 本发明涉及的碱性介质为：NaOH ;络合剂包括：EDTA及其盐、柠檬酸及其盐；邻苯 二甲醛衍生物包括：4, 5-二甲氧基邻苯二甲醛、4-甲氧基邻苯二甲醛。
[0012] 实验证明，本发明的方法当氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠-氢氧化钠缓冲溶液以 及邻苯二甲醛和Na 2S03的混合溶液均采用相应方法去除铵氮时，对应空白的荧光值相对于 未处理的降低了 87. 65%，去除效果非常显著，且不影响各试剂与铵氮的反应性能。
[0013] 基于同样的原理，本发明的方法也适应发展了的测定方法中的试剂中铵氮的去 除，如CN201210370600和CN201210519924所述的乙二胺四乙酸四钠溶液、柠檬酸溶液、4， 5-二甲氧基邻苯二甲醛和4-甲氧基邻苯二甲醛溶液。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合如下的实验对本发明进行更加详细的说明。
[0015] 主要仪器与试剂： (1)RF-5301 PC型荧光分光光度计（日本岛津公司）：配有1 cm石英测定池。
[0016] (2)10. 6g/L邻苯二甲醛（0ΡΑ)溶液：称取2. 65 g邻苯二甲醛（A. R.，阿拉丁）固 体，溶于50mL甲醇溶液中，震荡溶解，待其溶解完全后再加入200 mL超纯水，即配得10. 6 g/L 0ΡΑ溶液。使用前冷藏保存，可稳定1个月。
[0017] (3) 2. 50g/L 亚硫酸钠（Na2S03)溶液：称取 1. 25 g Na2S03 固体（A. R.，阿拉丁)， 溶于500mL超纯水中，待其溶解后再加入0. 2mL甲醛溶液（A. R.，阿拉丁)，即配得2. 50g/L Na2S03溶液。使用前冷藏保存，可稳定1个月。
[0018] (4)0. 1 mol/L氢氧化钠（NaOH)溶液：称取0. 8 g氢氧化钠固体（A. R.，阿拉丁)， 溶于200 mL超纯水中。
[0019] (5)乙二胺四乙酸二钠-氢氧化钠缓冲溶液（EDTA-NaOH缓冲溶液，其中EDTA的浓 度为186. 5 g/L):称取37. 3 g乙二胺四乙酸二钠及7.0 g氢氧化钠，溶于200 mL超纯水 中，该溶液的pH为12.8。
[0020] (6) 1000 mg/L铵氮标准储备液：购于阿拉丁试剂网 (7) 20 mmol/L铵氮中间标准储备液：由1000 mg/L铵氮标准储备液稀释而得 (8) 0. 1 mmol/L铵氮标准使用液：由20mmol/L铵氮中间标准储备液稀释而得。铵氮标 准使用液需要当天使用当天配制。
[0021] 试剂空白去除方法： 试剂空白通常因试剂中含有极少量的目标物（即铵氮）而产生，因此，要降低邻苯二甲 醒（o-phthaldialdehyde，简称0ΡΑ)突光法测定铵氮的试剂空白，需采取办法去除该法所 用试剂溶液中的铵氮。0ΡΑ荧光法测定铵氮的所需试剂包括：NaOH溶液、0ΡΑ溶液、亚硫酸 钠溶液、EDTA-NaOH缓冲溶液。以下分别叙述去除每种试剂溶液中铵氮的方法 1)采用煮沸法去除NaOH溶液、EDTA-NaOH缓冲溶液中的铵氮： 当溶液pH值大于9时，铵氮主要以氨态氮形式存在，在煮沸过程中，铵氮以氨气的形式 随水蒸气蒸出，从而去除试剂溶液中的铵氮。NaOH溶液、EDTA-NaOH缓冲溶液的pH均大于 9,因此，这两种溶液均以煮沸的方法去除试剂中的铵氮。
[0022] NaOH溶液中铵氮的去除方法：取200 mL 0. 1 mol/L NaOH溶液加至事先放有沸石 的500 mL三角烧瓶中，然后加入约150 mL超纯水，将三角烧瓶置于电热板上加热煮沸，至 溶液最终体积为200 mL时，停止加热，迅速用冰浴冷却溶液至常温，立即将溶液倒入洁净的 试剂瓶中，盖紧瓶盖，双层聚乙烯塑料袋密封保存。
[0023] EDTA-NaOH缓冲溶液中的铵氮的去除方法：取200 mL EDTA-NaOH缓冲溶液加至事 先放有沸石的500 mL三角烧瓶中，然后加入约150 mL超纯水，将三角烧瓶置于电热板上加 热煮沸，溶液中铵氮以氨气的形式随水蒸气蒸出。当溶液最终体积为200 mL时，停止加热， 迅速用冰浴冷却溶液至常温，立即将溶液倒入洁净的试剂瓶中，盖紧瓶盖，双层聚乙烯塑料 袋密封保存。
[0024] 溶液最终体积采取称量的方法确定，溶液密度视为1. 0 g/mL，首先，准确称量沸石 和三角烧瓶的质量，记为叫，停止加热后准确称量三角烧瓶+沸石+溶液的总质量，记为m2， 当叫-1^=200 g时，溶液最终体积即为200 mL。
[0025] 2)采用HLB小柱固相萃取法去除0ΡΑ和Na2S03溶液中的铵氮： 0ΡΑ、Na2S03与铵氮可生成荧光异吲哚化合物，异吲哚化合物可被HLB小柱固相萃取， 基于此原理。将配置好的10.6 g/L 0ΡΑ溶液与2. 50 g/L Na2S03溶液按1:1的体积比混 合，室温放置8小时，使试剂溶液中的铵氮与0ΡΑ、Na 2S03充分反应生成异吲哚化合物，然 后将0PA-Na2S0 3混合溶液加入到!〇小柱固相萃取装置的瓶口分液器，使(^-似2503混合 溶液以每分钟60滴的速度通过HLB小柱至棕色玻璃瓶中。HLB小柱为Oasis HLB小柱。 0PA-Na2S03混合溶液中的铵氮因生成了异吲哚化合物而被HLB小柱萃取截留，流出HLB小 柱的溶液为去除了铵氮的〇PA-Na 2S03混合溶液，用棕色玻璃瓶密封冷藏保存，可稳定3天。 [0026] 试剂空白测定方法： 移取20. 00 mL超纯水至50 mL聚丙烯塑料试样瓶中，依次加入3. 0 mL 0PA-Na2S(V混 合溶液、1. 〇 mL EDTA-NaOH溶液，用0. 1 mol/LNaOH溶液调节溶液pH为11. 3-11. 5范围内， 摇勻；反应1小时后，设置突光分光光度计激发波长为361 nm，突光波长为423 nm，激发和 发射狭缝宽度分别为5 nm和3 nm (以下无特别说明情况下采用此狭缝设置)，测定溶液的 荧光值IF，即为试剂空白。
[0027] 去除试剂空白的效果考察： 按表1所示，设置4组实验，按上述测定方法测定相应的试剂空白，采用单因素方法考 察各试剂中铵氮的去除效果，即当考察煮沸方法去除NaOH溶液中铵氮的效果时，除使用的 NaOH溶液不同外，需控制对照实验和考察实验的实验条件相同，其它试剂相同。
[0028] 表1 :考察去除试剂空白效果的实验设计
【权利要求】
1. 降低邻苯二甲醛荧光法测铵氮的试剂空白的方法，包括： 1) 采用煮沸法去除碱性介质溶液和络合剂-碱性介质缓冲溶液中的铵氮； 2) 采用HLB小柱固相萃取法去除邻苯二甲醛或其衍生物和Na2S03的混合溶液中的铵 氮。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述1)的具体过程为：取待处理液加至 事先放有沸石的三角烧瓶中，然后加入70%量待处理液的超纯水，加热煮沸，至溶液最终体 积为待处理液原体积时，停止加热，用冰浴冷却溶液至常温，倒入洁净的试剂瓶中，盖紧、密 封保存。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：溶液最终体积采取称量的方法确定，其 中，溶液密度视为1.0 g/mL。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：用双层聚乙烯塑料袋密封保存。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述2)的具体过程为：混合溶液室温放 置8小时以上，使混合溶液以每分钟不超过60滴的速度通过HLB小柱固相萃取装置中的 HLB小柱流至棕色玻璃瓶中，于棕色玻璃瓶中密封冷藏。
6. 根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于：固相萃取装置中的小柱选自：C18填 料小柱或Oasis HLB小柱。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于： 碱性介质为：NaOH 络合剂包括：EDTA及其盐、柠檬酸及其盐； 邻苯二甲醛衍生物包括：4, 5-二甲氧基邻苯二甲醛、4-甲氧基邻苯二甲醛。
【文档编号】G01N21/76GK104111245SQ201410365089
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年7月29日 优先权日:2014年7月29日
【发明者】梁英, 秦月香, 严春梅 申请人:桂林电子科技大学