应用液质-质联用仪测定淡水池塘底泥中氯霉素的方法
【专利摘要】本发明涉及一种应用液质-质联用仪测定淡水池塘底泥中氯霉素的方法，包括步骤有：(1)养殖池塘底泥样品采集；(2)样品的提取；(3)正己烷净化；(4)水饱和乙酸乙酯溶液提取；(5)氮气吹干提取液，乙腈－水(5+95)溶解得备用液；(6)固相萃取柱洗脱；(7)水饱和乙酸乙酯溶液提取，氮气吹干；(8)甲醇水(50+50)溶液溶解，涡旋后经0.22μm微孔滤膜过滤后用液质-质联用仪上机测定。本发明方法通过对淡水池塘底泥进行前处理，去除基体干扰物，提高了灵敏度，优化了前处理过程，并且样品无需衍生化，简化了操作步骤，可为污染来源排查及评价生态环境对健康养殖的影响提供可靠的检测手段。
【专利说明】应用液质-质联用仪测定淡水池塘底泥中氯霉素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分析化学、生态环境安全【技术领域】，特别是一种应用液质-质联用仪 测定淡水池塘底泥中氯霉素的方法。
【背景技术】
[0002] 氯霉素（CAP)是一种广谱抗生素，对需氧、厌氧菌以及衣原体、支原体、立克次体 等均有效。由于价格便宜且效果显著，常被作为药物用于畜禽及水产品的疾病治疗和预防。 但是，氯霉素存在严重的毒副作用，能抑制人体骨髓造血功能，容易造成再生障碍性贫血、 粒状白细胞缺乏症和灰婴综合征等。因此，为保障动物源食品安全，确保该药不对人类带来 危害，世界各国都对其做出了严格规定，严禁氯霉素在食用动物上使用，欧盟规定动物源食 品中氯霉素残留的最低要求执行限为（MRPL)O. g/kg，我国农业部235号公告中把氯霉 素列为了禁用药物。
[0003] 由于传统的水产养殖模式，导致氯霉素已经被广泛应用，尽管现在水产养殖中违 禁使用情况很少了，但其已对环境造成了严重污染，尤其是氯霉素在表层沉积物中富集，当 受污染的淡水池塘进行再次养殖生产时，底泥中的禁用药物氯霉素会不断向水体进行缓慢 释放，成为其二次污染的主要来源，因此评估养殖池塘底泥中的氯霉素药物残留状况，建立 相应的检测方法，对于水产品中氯霉素污染来源的排查具有积极的意义。
[0004] 经过中国学术期刊网络出版总库、中文科技期刊数据库、中国学术会议论文全文 数据库、中国学位论文全文数据库、国家科技成果网、中国专利数据库、中国科技项目创新 成果鉴定意见数据库、中国优秀硕士学位论文全文数据库、中国博士学位论文全文数据库、 中国重要报纸全文数据库、http://www. baidu. com等文献检索及国外的相关资料检索，目 前，淡水池塘中底泥中的氯霉素检测方法，只报道了应用气相色谱仪法测定淡水池塘中底 泥中的氯霉素，而液质-质联用仪测定淡水池塘底泥中氯霉素方法未见报道。
[0005] 液质-质联用技术（LC - MS/MS)具有快速、灵敏度高、专一性好、不受噪声干扰等 特点，尤其是通过多反应监测模式（MRM)能进一步提高检测的灵敏度和选择性，大大降低 了检测限并很大程度上减少了假阳性的出现。
[0006] 由于淡水养殖池塘底泥中的成份复杂，各种杂质多，对分析干扰大，气液相色谱仪 检测方法需要进行衍生化，对样品的净化要求较高，整个操作步骤繁琐、耗时长，气相色谱 仪器检测易形成相似峰干扰，热稳定差，不利于准确定性和定量分析，因此研制出干扰小， 稳定性高，数据准确的检测方法十分必要。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是针对检测底泥中氯霉素现有技术的不足，而提出一种对淡水池塘 底泥中氯霉素样品采集、提取、浓缩，优化了前处理过程，应用液质-质联用仪，能够快速准 确检测出淡水池塘底泥中残存的痕量氯霉素的检测方法。
[0008] 本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
[0009] -种应用液质-质联用仪测定淡水池塘底泥中氯霉素的方法，包括步骤如下：
[0010] (1)养殖池塘底泥样品采集，用采泥器取表层沉积物，放在广口瓶中在-18°C冰箱 保存；
[0011] ⑵样品的提取，称取样品5. OOg置50ml离心管中，加入2ml水润湿，加入500 ill 浓度为10. 〇ng/ml的氯霉素内标溶液、5ml乙腈及4%氯化钠溶液5ml，漩润振荡2min，超声 萃取20min后，静置IOmin,用转速为15000r/min的离心机离心IOmin,提取上清液至于另 一 50ml离心管中；
[0012] (3)重复上述步骤（2)的提取过程，合并两次提取液，在合并的提取液中加入正己 烧5ml，漩润振荡2min，用转速为5000r/min的离心机离心IOmin,弃去正己烧层溶液，重复 一次，得提取液；
[0013] (4)在上述（3)步所得提取液中加入水饱和乙酸乙酯溶液5ml，漩涡振荡2min，用 转速为5000r/min的离心机离心lOmin，上层液转移到15ml离心管中，重复提取1次，将两 次所得上层液合并；
[0014] (5)将上述（4)步所得提取液用氮气吹干，用乙腈一水（5+95)溶液3ml溶解氮气 吹干后残留物得备用液；
[0015] (6)将固相萃取柱依次用甲醇10ml，水IOml预洗，然后取上述备用液过柱，用水 5ml洗柱，用5ml甲醇水（50+50)溶液洗脱，以lml/min的速度将样品洗脱入15ml离心管 中；
[0016] (7)将上述洗脱液中加入水饱和乙酸乙酯溶液5ml，涡旋振荡2min，5000r/min，离 心5min，取上层液，重复提取1次，合并提取液氮气吹干，得吹干残留物；
[0017] (8)用ImL甲醇水（50+50)溶液溶解上步残留物，旋涡后经0. 22 m微孔滤膜过滤 后用液质-质联用仪上机测定。
[0018] 而且，所述步骤（8)中用液质-质联用仪上机测定时，检测中各项条件设定为：
[0019] ①色谱柱：Shim-Pack XR-ODS C8 色谱柱，5 u m，75mmX 2. Omm(内径），柱温 40°C， 流动相为A-水，B-甲醇，流速为0. 30mL/min，进样量5 ii L ;
[0020] ②梯度洗脱条件如表1 :
[0021] 表1梯度洗脱条件
[0022]
【权利要求】
1. 一种应用液质-质联用仪测定淡水池塘底泥中氯霉素的方法，其特征在于包括步骤 如下： (1)养殖池塘底泥样品采集，用采泥器取表层沉积物，放在广口瓶中在-18°C冰箱保 存； ⑵样品的提取，称取样品5.OOg置50ml离心管中，加入2ml水润湿，加入500yl浓 度为10.Ong/ml的氯霉素内标溶液、5ml乙腈及4%氯化钠溶液5ml，漩润振荡2min，超声萃 取20min后，静置lOmin，用转速为15000r/min的离心机离心lOmin，提取上清液至于另一 50ml离心管中； (3) 重复上述步骤（2)的提取过程，合并两次提取液，在合并的提取液中加入正己烷 5ml，漩润振荡2min，用转速为5000r/min的离心机离心10min，弃去正己烧层溶液，重复一 次，得提取液； (4) 在上述（3)步所得提取液中加入水饱和乙酸乙酯溶液5ml，漩涡振荡2min，用转速 为5000r/min的离心机离心10min，上层液转移到15ml离心管中，重复提取1次，将两次所 得上层液合并； (5) 将上述（4)步所得提取液用氮气吹干，用乙腈一水（5+95)溶液3ml溶解氮气吹干 后残留物得备用液； (6) 将固相萃取柱依次用甲醇10ml,水10ml预洗，然后取上述备用液过柱，用水5ml洗 柱，用5ml甲醇水（50+50)溶液洗脱，以lml/min的速度将样品洗脱入15ml离心管中； (7) 将上述洗脱液中加入水饱和乙酸乙酯溶液5ml，涡旋振荡2min，5000r/min，离心 5min，取上层液，重复提取1次，合并提取液氮气吹干，得吹干残留物； (8) 用lmL甲醇水（50+50)溶液溶解上步残留物，旋涡后经0. 22pm微孔滤膜过滤后用 液质-质联用仪上机测定。
2. 根据权利要求1所述的应用液质-质联用仪测定淡水池塘底泥中氯霉素的方法，其 特征在于所述步骤（8)中用液质-质联用仪上机测定时，检测中各项条件设定为： ① 色谱柱：Shim-PackXR-ODSC8 色谱柱，5ym，75mmX2. 0mm(内径），柱温 40°C，流动 相为A-水，B-甲醇，流速为0. 30mL/min，进样量5iiL; ② 梯度洗脱条件如表1 : 表1梯度洗脱条件
③ 其他各项设定：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应 监测（MRM);电喷雾电压：-4500V;气帘气：20PSI;辅助气：50PSI;去簇电压：-80V及碰撞 电压：-l〇V，离子源温度：500°C; ④ 化合物的多反应监测离子对及质谱相关参数如表2所示； 表2化合物的多反应监测离子对及质谱相关参数
其中*为定量尚子； ⑤ 梯度标准品溶液及内标质量的确定；采用不含目标待测物的基质空白溶液配制梯度 标准品溶液（〇, 〇? 5,1. 0, 2. 0,4. 0,8. 0,10.Ong/mL)加入氯霉素-D5内标质量为5.Ong; ⑥ 确定检测限为〇. 1Ug/kg，定量限为0. 3yg/kg;仪器检出限及方法定量限见表3， 表3线性范围、标准曲线方程、检出限和定量限
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【文档编号】G01N30/88GK104407085SQ201410719313
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月1日 优先权日:2014年12月1日
【发明者】张素青, 陈永平, 李春青, 叶红梅, 高丽娜, 李连庆, 时文博, 王秀芹, 王德兴, 王宝峰, 马丹, 王娟娟, 易伟, 李兆千, 张玲 申请人:农业部渔业环境及水产品质量监督检验测试中心(天津)