番红-固绿对染过程中分色蓝化透明的方法
【专利摘要】本发明公开了一种番红-固绿对染过程中分色蓝化透明的方法，其过程为：(1)将经番红染色后的材料置于含2mL浓HCl的100mL50％乙醇溶液中5s；(2)置于含2mL氨水的100mL 95％乙醇溶液中1s；(3)置于100mL无水乙醇溶液中3s；(4)将2mL固绿染色液滴在材料的上方1s；(5)置于50mL二甲苯+50mL无水乙醇+6mL丁香油的混合液中1s；(6)置于50mL二甲苯+50mL无水乙醇的混合液中30s；(7)置于100mL二甲苯溶液30s；(8)置于100mL二甲苯溶液30s。本方法确定了披碱草属植物石蜡切片法番红-固绿对染过程中分色、蓝化、固绿复染、清洁、透明的具体时间。
【专利说明】番红-固绿对染过程中分色蓝化透明的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及观察披碱草属植物胚胎发育过程中番红-固绿对染法，特别指适用于披碱草属植物胚胎发育的番红-固绿对染过程中分色蓝化透明的方法。
【背景技术】
[0002]披碱草属(Elymus L.)是小麦族(Triticeae)内种类最多、分布最广的一个属,是分布于北半球寒温带比较古老的野生草种。老芒麦(Elymus sibiricus)是披碱草属模式种，是牛、马、羊均喜食的优等饲用禾草，也是我国北方地区优良的多年生栽培牧草，被广泛用于人工草地建植和天然草地改良，同时作为麦类作物的近缘属，是麦类作物遗传改良的重要优异基因来源。
[0003]种子是生产建设优质、高产人工草地和饲草料的遗传物质，也是发展草地畜牧业、治理国土和保护生态环境的物质基础。研究发现，披碱草属植物结实率低的原因是其交配系统为兼性自交，种群开花期较长且不集中，使异花授粉的花粉不充分；柱头不伸出稃片夕卜，稃片张开时间较短而引起花粉落在柱头上的几率变小。通过胚胎发育过程的研究可有效了解种子形成的过程，对提高种子产量的研究具有重要意义。但关于披碱草属植物胚胎发育过程研究的报道较少，石蜡切片法是胚胎学研究中常用的方法，尽管该方法制作过程繁琐、不易操作，但石蜡切片具有连续性，对了解生物器官和细胞的位置或排列具有重要意义。一张染色切片的质量好坏不仅取决于染液的质量、染色时间、染色温度，在很大程度上还取决于染色过程中分色液、蓝化液的性质和类型的选择及分色、蓝化的时间。关于披碱草属植物石蜡切片的过程可参考相关报道，但是针对其分色蓝化透明的具体处理未见报道。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种番红-固绿对染过程中分色蓝化透明的方法，这种方法在常规石蜡切片法的基础上，进一步完善番红-固绿对染法在披碱草属植物中的应用，提出了进行番红-固绿对染时分色蓝化透明的具体处理时间，帮助研究人员在显微镜下清晰观察到披碱草属植物胚胎发育的过程。
[0005]本发明要解决的技术问题由如下方案来实现:番红-固绿对染过程中分色蓝化透明的方法，其步骤特征在于:
[0006](I)将经番红染色后的材料置于含2mL浓HCl的10mL 50%乙醇溶液中5s ；
[0007](2)将经步骤(I)处理的材料置于含2mL氨水的10mL 95%乙醇溶液中Is ；
[0008](3)将经步骤⑵处理的材料置于10mL无水乙醇溶液中3s ；
[0009](4)将2mL固绿染色液滴在步骤(3)处理的材料的上方Is ；
[0010](5)将经步骤(4)处理的材料置于50mL 二甲苯+50mL无水乙醇+6mL 丁香油的混合液中Is ；
[0011](6)将经步骤(5)处理的材料置于50mL 二甲苯+50mL无水乙醇的混合液中30s ；
[0012](7)将经步骤(6)处理的材料置于10mL 二甲苯溶液中30s ；
[0013](8)将经步骤(7)处理的材料置于10mL 二甲苯溶液中30s。
[0014]本发明番红-固绿对染过程中分色蓝化透明的方法至少包括如下优点:
[0015]1、确定了披碱草属植物石蜡切片法番红-固绿对染过程中分色的时间；
[0016]2、确定了披碱草属植物石蜡切片法番红-固绿对染过程中蓝化的时间；
[0017]3、确定了披碱草属植物石蜡切片法番红-固绿对染过程中固绿复染的时间；
[0018]4、确定了披碱草属植物石蜡切片法番红-固绿对染过程中清洁与透明时间。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1是本发明老芒麦胚发育过程观察。
[0020]图2是本发明老芒麦胚乳发育过程观察。
[0021]图1包括六张图片，即A.椭圆形原胚；B.棒状胚；C.分化胚I ;D.分化胚II ；E.分化胚III ；F.成熟胚。
[0022]在图片F.成熟胚中，包含有a.盾片；b.胚芽；c.胚芽鞘；d.胚轴；e.胚根；f.胚根鞘；g.外胚叶。
[0023]图2包括六张图片，即A.椭圆形原胚时期的胚乳；B.棒状胚时期的胚乳；C.分化胚I时期的胚乳；D.分化胚II时期的胚乳；E.分化胚III时期的胚乳；F.成熟胚时期的胚乳。
[0024]在图片B.棒状胚时期的胚乳中，包含有h.角质层；1.种皮；j.糊粉层。
【具体实施方式】
[0025]下面结合附图对本发明做进一步的描述。
[0026]如图1至2所示，老芒麦在开花后6d，形成32-细胞椭圆形原胚(如图1-A)。原胚细胞进一步分化，花后7d形成棒状胚，此时胚发育已进入分化胚阶段。棒状胚具有明显的胚柄(如图1-B)。花后8d时，形成一个凹陷，这凹陷为生长点，在生长点的上部开始分化出胚芽鞘的上半部分及盾片，并盾片和胚芽鞘部分开始分离，此阶段称为分化胚I (如图1-C)。花后9d左右，在生长点下部出现一个凹陷，此时盾片和胚芽鞘分离，胚芽鞘将生长点包围，而生长点进一步分化形成第一叶原基，为分化胚II (如图1-D)。花后1d时，第一叶原基下方的凹陷分化为胚根和胚根鞘，此时期为分化胚III (如图1-E)。花后Ild已完成胚器官的发育，此时的胚具有盾片、胚芽鞘、胚芽、胚轴、胚根、胚根鞘以及外胚叶(如图1-F)，为成熟胚，此时胚柄完全退化。
[0027]虽然胚乳与胚之间没有维管连接，但是胚乳对于胚起着供给营养的作用。在胚生长之前胚乳已经生长，它是消化内部珠心组织生长的。发育的胚又消化胚乳而生长。在老芒麦椭圆形原胚时期(即开花后6d)，其胚乳游离核之间形成细胞壁，基本完成胚乳细胞化。胚乳细胞较大，细胞间有较大的间隙，接近种皮的I?2层细胞比胚乳细胞小(图2-A)。在棒状胚时期(开花后7d)，胚乳细胞变大，种皮外有较厚的角质层，并胚乳最外的I层细胞开始分化为糊粉层，糊粉层细胞体积较小，细胞核较大，细胞排列规则而紧密(图2-B)。从分化胚至成熟胚(开花后8d至Ild)，胚乳细胞形状不规则，体积比糊粉层细胞的大，有较大的细胞间隙(图2-C，D，E，F)。
[0028]1.市售石蜡清洁法
[0029]将用于包埋的56_58°C熔点的石蜡放入干净的烧杯中加热至冒白烟，除去水分和挥发杂质，稍冷却后用4层纱布过滤至另一烧杯中备用。
[0030]2.制片步骤
[0031](I)取材:以老芒麦为研究对象，在盛花期，标记同时开花的穗，并从开花第一天开始每天取一个穗，刨开颖，取出雌蕊，切下柱头，放入F.A.A固定液(50%乙醇配制)中保存。
[0032](2)脱水:完全除去材料中的水分，便于透明剂透入材料。最常用的脱水剂为乙醇。由于F.A.A固定液用50%乙醇配制的，应从50%乙醇开始脱水。
[0033]固定液处理至少1.5h后一50 %乙醇(1.5h) — 50 %乙醇(Ih) — 70 %乙醇(Ih) — 85%乙醇(1.5h) — 95%乙醇(挑入少量番红染色，以便包埋时辨认，Ih) — 100%乙醇(Ih) — 100%乙醇lh。
[0034](3)透明:目的是取代脱水剂，便于包埋剂石蜡浸入；增加材料折光度，便于镜检。二甲苯为应用最广的一种透明剂。步骤如下:
[0035]①10mT,无水乙醇 +20mL 二甲苯，30min
[0036]②1mL 无水乙醇+1mL 二甲苯，30min
[0037]③20mL无水乙醇+1mL 二甲苯，Ih
[0038]④30mL 二甲苯，Ih
[0039]⑤30mL 二甲苯，Ih
[0040](4)浸蜡:目的为了逐渐以石蜡代替透明剂；切片时避免因挤压而破坏材料。
[0041]本实验采用碎蜡法，具体步骤如下:
[0042]①将恒温箱温度调至36 °C，另一恒温箱调至58°C左右。
[0043]②将盛有材料的指管中的二甲苯倒出约一半，用一条硫酸纸将材料隔开，防止石蜡与材料接触，否则会使材料收缩。在硫酸纸的另一面加入50-52°C熔点的碎蜡，放入36°C恒温箱中(从脱水到这一步必须一天内完成)。
[0044]③碎蜡在二甲苯作用下融化，不断加蜡，指管内液体要溢出时倒掉一部分，逐步提高石蜡溶解量，使之达饱和。当指管内的液体处于半溶半凝状态时已达到饱和态。这时打开指管塞，放入58°C左右恒温箱中，使二甲苯充分挥发，至少5h以上。
[0045]④待二甲苯充分挥发后，将材料移至盛有50_52°C熔点石蜡的小烧杯(即纯蜡I)中放6h ;再放入含干净石腊的纯腊II中放直6h ;最后倒入纯腊III中6h后开始包埋。
[0046](5)包埋:目的使为石蜡所渗透的材料包埋于能与材料完全溶合的溶剂中(即同熔点的石蜡)，以备切片。
[0047]①褶纸船:用硬而不透水的硬纸，根据研究目的决定纸船的大小和材料排队次序。
[0048]②迅速倾倒干净而56_58°C熔点的石蜡于纸船内，倒入石蜡后在隔热的玻璃板上轻轻来回挥动，使其底部形成乳白一层，这时要戴口罩，不能对其吹气。
[0049]③用在酒精灯上微热的镊子取材料横放于蜡内排队，动作要快，但又不伤及材料。(做纵切时将材料横放于纸船内)
[0050]④冷却:对着纸船吹气使纸船上结蜡被，轻轻将纸船移入冷水中，防尘土落入，I小时后取出晾干即可贴切片。
[0051](6)切片
[0052]①切片前磨刀。
[0053]②对蜡块进行分割、修整，修整好的样品装入已编号的纸袋备用。
[0054]③将蜡块固着在小金属盘上，进一步修整呈梯形。
[0055]④固定切片刀，调节刀的角度到15°，调节切片厚度，一般为8-12μπι，调节刀片与蜡块的距离、蜡块的位置后开始切片。
[0056](7)贴片
[0057]梅氏粘片剂的配制:新鲜鸡蛋白25mL，甘油25mL，水杨酸钠少量，配制时取新鲜鸡蛋一个，两端各打破一个小孔，在10mL量筒上待蛋清完全流出后加入甘油和防腐剂，用力摇荡；上浮泡沫，下沉杂质，用4层纱布过滤即可。
[0058]①在载玻片上涂粘片剂于其偏右侧，然后用小手指涂抹均勾，不可涂抹太多，多余的应拭去，滴数滴蒸馏水于载玻片上。
[0059]②将蜡带置于有水的载玻片上，并在酒精灯上通过2?3次，以不烫手为宜。
[0060]③以吸水纸吸取多余的水分，晾干即可进行下一步。
[0061](8)染色
[0062]番红染剂配制:取5g番红，溶于500mL 50%乙醇中，完全溶解后用4层纱布过滤。
[0063]固绿染色液配制:取0.5g固绿溶于25mL无水乙醇中，在过滤中加25mL 丁香油轻轻摇匀即可。
[0064]将经贴片后的载玻片入10mL 二甲苯5min ;再入10mL 二甲苯Imin ;入50mL 二甲苯+50mL无水乙醇混合溶液中Imin ;入10mL 95%乙醇溶液中Imin ;入10mL 70%乙醇Imin ;入10mL番红染剂24h
[0065]分色、蓝化透明时间设计梯度，以选择最佳时间。
[0066]①将5个经番红染色后的材料置于含2mL浓HCl的10mL 50%乙醇溶液中，分别处理3s、5s、10s、15s和20s，优选地是5s。
[0067]②将4个经步骤①优选时间处理的材料置于含2mL氨水的100mL95%乙醇溶液中，分别处理Is、2s、3s和4s,优选地是Is。
[0068]③将4个经步骤②优选时间处理的材料置于10mL无水乙醇溶液中清洗，分别处理5s、10s、15s和20s，结果表明，5s效果较好，于是，又将4个经步骤②优选时间处理的材料置于10mL无水乙醇溶液中清洗，分别处理ls、2s、3s和4s，优选地是3s。
[0069]④将2mL固绿染色液滴在4个经步骤③优选时间处理的材料的上方，分别处理为Is、2s、3s和4s,优选地是Is。
[0070]⑤将4个经步骤④优选时间处理的材料置于50mL 二甲苯+50mL无水乙醇+6mL 丁香油的混合液中，分别处理ls、2s、3s和4s，优选地是Is。
[0071]⑥将5个经步骤⑤优选时间处理的材料置于50mL 二甲苯+50mL无水乙醇的混合液中，分别处理15s、30s、45s、60s和75s，优选地是30s。
[0072]⑦将5个经步骤⑥优选时间处理的材料置于10mL 二甲苯溶液中处理I次，分别处理 15s、30s、45s、60s 和 75s，优选地是 30s。
[0073]⑧将5个经步骤⑦优选时间处理的材料置于10mL 二甲苯溶液中处理I次，分别处理 15s、30s、45s、60s 和 75s，优选地是 30s。
[0074]整体染色步骤如下:
[0075]贴片后的载玻片入10mL 二甲苯
[0076]I (5min)
[0077]10mL 二甲苯
[0078]I (Imin)
[0079]5OmL 二甲苯 +50mL 乙醇
[0080]I (Imin)
[0081]10mL 95% 乙醇
[0082]I (Imin)
[0083]10mL 70% 乙醇
[0084]I (Imin)
[0085]10mL番红染剂
[0086]I (24h)
[0087]2mL 浓 HCl 的 100mL50 % 乙醇溶液
[0088]丨(5s)
[0089]2mL氨水的10mL 95%乙醇溶液
[0090]丨(Is)
[0091]10mL无水乙醇
[0092]丨(3s)
[0093]2mL固绿染色液
[0094]丨(Is)
[0095]5OmL 二甲苯+50mL无水乙醇+6mL 丁香油的混合液
[0096]丨(Is)
[0097]5OmL 二甲苯+50mL无水乙醇
[0098]丨(30s)
[0099]10mL 二甲苯
[0100]I (30s)
[0101]10mL 二甲苯
[0102]I (30s)
[0103]封片
[0104](9)封片
[0105]加拿大树胶用二甲苯配制:10mL 二甲苯+20mL树胶,搅勻、置凉、暗处。
[0106]①在桌上放一张白纸，将载玻片由二甲苯中取出后，以清洁布块迅速擦去材料以外的二甲苯，平置纸上，当材料上二甲苯尚未挥发时加I滴树胶于材料上。
[0107]②用右手执镊子夹住盖玻片右侧，将它放在树胶的左边，左手以食指抵住盖玻片的左边，右手将镊子逐渐下降，待盖玻片接触树胶后再慢慢抽出镊子，这时树胶就均匀布满盖玻片，材料同时被覆盖。如果胶量过少，盖片速度太快，就会在盖玻片下留有气泡，影响效果，可将封片后的载玻片置于酒精灯火焰上来回摆动2-3次，以除去气泡。将封片后的载玻片放在实验室实验台上晾干。
[0108](10)镜检
[0109]使用4倍显微镜找到所述材料的观察目标范围，然后使用10-40倍显微镜寻找胚胎不同发育时期，拍摄图片。
[0110]以上所述的实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细的说明，以上仅为本发明的实施例而已，并不用于限定本发明，凡是在本发明原则之内，所作出的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.番红-固绿对染过程中分色蓝化透明的方法，其步骤特征在于: (1)将经番红染色后的材料置于含的100此50%乙醇溶液中58； (2)将经步骤⑴处理的材料置于含2此氨水的100此95%乙醇溶液中18； (3)将经步骤⑵处理的材料置于100此无水乙醇溶液中38； (4)将2此固绿染色液滴在步骤⑶处理的材料的上方18； (5)将经步骤⑷处理的材料置于501111二甲苯+501111无水乙醇+61111 丁香油的混合液中18 ； (6)将经步骤(5)处理的材料置于50此二甲苯+5011^无水乙醇的混合液中308； (7)将经步骤(6)处理的材料置于10001二甲苯溶液中308 ； (8)将经步骤⑵处理的材料置于100此二甲苯溶液中308。
【文档编号】G01N1/30GK104458387SQ201410719550
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月24日 优先权日:2014年11月24日
【发明者】德英, 赵来喜, 穆怀彬, 高凤芹, 解继红, 王照兰, 徐春波 申请人:中国农业科学院草原研究所