本申请要求2014年7月1日提交的临时申请62/019,830的优先权，其内容通过引用全文纳入本文。
引言
人们使用一批杀伤正在生长和分裂的细胞并以多种方式发挥功能的治疗剂来治疗癌症。常见的化疗剂集合已被单独或联合使用了数十年，且该常见的试剂集合已成为临床肿瘤学实践中传统且常规的癌症治疗手段。这些传统的化疗剂通过杀伤所有快速分裂的细胞来发挥作用，快速分裂是大多数癌细胞的主要特性之一。这类试剂包括直接损伤dna的烷化剂；阻止微管形成的紫杉烷；干扰dna和rna复制的抗代谢物；干扰dna复制所涉及酶的蒽环类药物(抗肿瘤抗生素)；阻止dna复制的拓扑异构酶抑制剂；阻止酶生成细胞繁殖所需蛋白质的衍生自天然产物的生物碱和其他化合物；导致dna交联以抑制dna复制和/或dna合成的基于铂的药物。这些化疗剂类别是基于其抑制癌细胞生长的基本功能原创性开发的，而对其靶向作用模式知之甚少。由于他们不是为特异性靶向和直接抑制已知蛋白质而开发的，这些试剂在历史书并未被视作“靶向”癌症治疗剂。然而，自其开发开始，这些试剂类别中的每一个的生物化学功能是熟知的且其每一个均被发现对于特定的蛋白质、酶或核酸具有“靶向”作用。这些化疗剂的“靶标”也是熟知的且因此基于某一给定癌症中是否存在这些特异性“靶标”来选择针对该癌症的最有效的化疗剂。该实施方式描述了测试患者来源的生物样品中是否存在这些化疗生物标志物的特定方法。
当一个或多个特异性靶蛋白质给出哪一种或多种化疗剂应用于治疗癌症以抑制癌生长的指标时，癌症疗法的靶向方法是最有利的。该实施方式提供了用于一种或多种srm/mrm测定的肽和肽序列，这些测定用于定量确定直接在来自癌症患者的患者来源的生物样品中表达、过表达或不表达的化疗蛋白质指标，用于改进的针对癌症疗法的治疗决定。
技术实现要素：
提供了来源于以下蛋白质的亚序列的特定肽：ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和topo2a。ent1也称为平衡型核苷转运蛋白1且在本文中称作ent1。ercc1也称为dna切除修复蛋白质ercc-1且在本文中称作ercc1。folr1也称为叶酸受体α且在本文中称作folr1。rrm1也称为核糖核苷二磷酸还原酶大亚基且在本文中称作rrm1。tubb3也称为微管蛋白β-3链蛋白质且在本文中称作tubb3。topo1也称为dna拓扑异构酶1且在本文中称作topo1。topo2a也称为dna拓扑异构酶2α且在本文中称作topo2a。
各种来源于蛋白质的肽的肽序列和碎片/过渡离子可具体用于基于质谱的选择性反应监测(srm)中，其也称为多反应监测(mrm)测定，且在后文中称作srm/mrm。描述了用于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和topo2a蛋白质及其同种型的定量srm/mrm分析的肽的用途。
可使用一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种，或五种或六种srm/mrm测定来测量来自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的一种或多种特异性肽的相对或绝对定量水平，并由此提供通过质谱测量从生物样品中获得的给定蛋白质制备物中每一种那些蛋白质的总量的方法。所有或一部分来自那些蛋白质的可用肽也可在单个srm/mrm测定中同时分析或可在单个srm/mrm测定的任意组合中分析。各肽提供了通过质谱测量获自生物样品的给定蛋白质制备物中各相应蛋白质总量的潜在方法。
更具体地，本发明所述srm/mrm测定可直接测量由从诸如福尔马林固定的癌症患者组织的患者组织样品(例如，切除的肿瘤和活检切片)取得的细胞制备的复杂蛋白质裂解物样品中的那些肽。由福尔马林固定的组织制备蛋白质样品的方法描述在美国专利第7,473,532号中，其内容通过引用全文纳入本文。该专利描述的方法可使用获自表达病理学公司(expressionpathologyinc.)(马里兰州罗克维尔)的liquidtissue试剂和方案方便地进行。
对从癌症患者处手术移出的组织进行甲醛/福尔马林固定是病理学实践中已经接受的常规方法。结果是，甲醛/福尔马林固定石蜡包埋的组织是来自那些患者的最广泛可得的组织形式。甲醛/福尔马林固定通常使用甲醛水溶液，其在本文中称作福尔马林。“100％”福尔马林由甲醛在水中的饱和溶液(约40体积％福尔马林或37重量％)组成，其含有少量用于限制氧化和聚合程度的稳定剂，通常为甲醇。保藏组织的最常用方式是将整个组织在通常称为10％中性缓冲福尔马林的甲醛水溶液中长时间(8小时至48小时)浸泡，接着在室溫下将固定的整个组织包埋在石蜡中以便长期储存。因此，分析福尔马林固定的癌症组织的分子分析方法将是用于分析癌症患者组织的最被接受且大量利用的方法。
srm/mrm测定的结果可用于关联自其中收集并保藏组织(生物样品)的患者或受试者的具体组织样品(例如癌症组织样品)内任意或所有这些蛋白质的准确且精确的定量水平，此外还可关联这些蛋白质的潜在同种型的准确且精确的定量水平。这不仅提供关于癌症的诊断信息，而且容许医师或其它医疗专业人员确定用于患者或对象的适当疗法。提供关于在患病组织或另一患者/对象样品中蛋白质表达水平的诊断和治疗重要信息的这一测定称为伴随诊断测定。例如，这一测定可设计用于诊断癌症的阶段、程度或组织学特征并确定将最有效地组织癌细胞生长从而使得患者或对象最可能应答的治疗剂。更具体地，对来自患者的癌细胞中的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种进行检测和/或定量可提供某些蛋白质，这类蛋白质可显示应遵循哪种或哪几种治疗方案。
发明详述
本发明所述的测定定量或测量来自包括ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的蛋白质的特定未修饰的肽的相对或绝对水平并且还可测量来自那些蛋白质的特定修饰的肽的相对或绝对水平。修饰的示例包括在这些肽上存在的磷酸化氨基酸残基和糖基化氨基酸残基。蛋白质和蛋白质同种型的相对定量水平可通过srm/mrm方法确定，例如通过比较srm/mrm特征峰面积(signaturepeakarea)(例如，特征峰面积或积分的片段离子强度)来确定。可在不同样品(例如，对照样品和由患者或对象组织制备的样品)中测定单个ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽的相对水平。或者，在各种肽具有其自己的特异性srm/mrm特征峰的情况下，可以比较多种一种或多种ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a特征肽的多个srm/mrm特征峰面积。通过比较峰面积，可以测定一种生物样品中或一种或多种额外或不同的生物样品中的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质和潜在蛋白质同种型含量的相对水平。以此方式，可在相同实验条件下跨越多个(例如，两个、三个、四个、五个或更多个)生物样品测定来自那些蛋白质的具体一种或多种肽的相对含量并从而测定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质及其潜在同种型的相对含量。另外，确定单一样品内来自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的一种或多种给定肽的相对定量的方法可以是通过srm/mrm方法比较该肽的特征峰面积与同一来自生物样品的蛋白质制备物中的来自不同的一种或多种蛋白质的其他和不同的一种或多种肽的特征峰面积。使用这类方法，可测定来自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的具体肽的含量，并继而测定各相应蛋白质及其潜在同种型的含量，该测定的方式是一种蛋白质相对于同一样品或不同样品中的另一种蛋白质。由于单个一种或多种肽的相对定量可相对于样品内或样品间的另外一种或多种肽的含量来进行测定，因此可以测定所存在肽的相对含量(例如通过测定一种相对于另一种的峰面积)，这与生物样品中蛋白质的绝对重量：体积或重量：重量含量无关。因此可使用来自生物样品的蛋白质制备物中的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽的含量来测定多种样品之中或之间的那些蛋白质的含量。不同样品之间单个特征峰面积的相对定量数据通常标准化至单位样品中所分析蛋白质的含量(例如，使用样品的总蛋白质浓度和所分析的体积来标准化样品)。可跨越来自单个样品中同时存在的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质和多个蛋白质的许多肽和/或跨越许多样品来进行相对定量，从而进一步了解相对蛋白质含量，即相对于其他肽/蛋白质的一种肽/蛋白质。
ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的绝对定量水平通过例如srm/mrm方法确定，通过该方法将来自在一种生物样品中的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的单个肽的srm/mrm特征峰面积与一种或多种内标物的已知含量的srm/mrm特征峰面积相比较，这些内标物以已知含量“掺入”样品中(例如，同位素标记的标准品)。在一个实施方式中，该内标物为合成形式的完全相同的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽，其含有用一种或多种重同位素标记的一个或多个氨基酸残基。合成这类同位素标记的内标物，使得通过质谱分析时产生可预测且一致的srm/mrm特征峰，其与天然ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽特征峰不同且截然不同并可用作比较峰。因此，当内标物以已知含量掺入来自生物样品的蛋白质或肽制备物中并通过质谱分析时，将天然肽的srm/mrm特征峰面积与内标肽的srm/mrm特征峰面积相比较。该数值比较允许计算来自生物样品的原始蛋白质制剂中存在的天然肽的绝对摩尔浓度和/或绝对重量，从中可测定相应蛋白质的浓度或重量。片段肽的绝对定量数据通常根据每种样品中所分析的蛋白质的含量来显示。绝对定量可跨越许多肽进行(其允许定量测定单个样品中同时存在的多种蛋白质(例如，两种、三种、四种、五种等))和/或跨越多种样品进行，从而了解单个生物样品中和/或整个单个样品的组中的绝对蛋白质含量。在一个实施方式中，可使用gyai等在美国专利7,501,286中描述的肽标准品来进行蛋白质的定量。
本文中，术语定量、量化、测量或度量指测定分析物的相对或绝对水平，该分析物是例如蛋白质、多肽、肽、标准品(例如内标物)。本发明所述的测定可用于在使用例如患者来源或对象来源的组织(如福尔马林固定的组织)时辅助确定癌症阶段。本发明所述的srm/mrm测定还可用于辅助确定哪种治疗剂将最有利地用于治疗该患者或对象。
为检测与本发明所述的癌症相关蛋白质的水平，可对经由移出部分或全部肿瘤的手术或经由为了确定疑似疾病的存在与否而进行的活检方法从患者或对象移出的疑似癌性组织或癌性组织进行分析。分析这些组织的样品以确定是否存在所怀疑的疾病。分析这些组织的样品以确定患者或对象的样品中是否存在ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质以及存在何种形式的这些蛋白质。此外，可确定这些蛋白质中一种或多种的表达水平并将其与在健康组织中发现的“正常”或参考水平相比较。在健康组织中发现的蛋白质的正常或参考水平可来源于例如没有癌症的一个或多个个体的相关组织。或者，可通过分析未受癌症影响的相关组织(例如，同一器官的一部分)来获得具有癌症的个体的正常或参考水平。
蛋白质或肽的水平或含量可定义为通过srm/mrm测定确定的蛋白质或肽的量(表示为摩尔、质量或重量)。该水平或含量可标准化至分析的裂解物中蛋白质或另一种成分的总体水平或含量(例如，表示为微摩尔/微克蛋白质或微克/微克蛋白质)或甚至标准化至单位重量基础上的dna含量(例如，微摩尔或微克/微克dna)。此外，蛋白质或肽的水平或含量可以体积基础测定，例如表示为微摩尔或纳克/微升。通过srm/mrm测定确定的蛋白质或肽的水平或含量还可标准化至所分析细胞的数目。涉及ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质以及这些蛋白质的同种型的信息可用于辅助确定癌症的阶段或等级，方法为关联或比较ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质及其同种型或片段肽的水平与正常组织中观察到的水平。一旦确定癌症的组织学阶段和/或等级和/或ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质表达特征，则可将该信息与经开发以特异性治疗癌症组织的(化学和生物)治疗剂的列表相匹配，该癌症组织的特征是例如所测定的一种或多种蛋白质(例如ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a)的异常表达。匹配来自特定个体的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质测定的信息与特异性靶向表达ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的细胞/组织的治疗剂列表代表了治疗癌症的个性化用药方法。本发明所述的测定方法使用来自患者或对象自身组织的蛋白质的分析作为诊断和治疗决定的来源，从而形成个性化用药方法的基础。
肽生成
原则上说，通过任何特异性已知的蛋白水解过程制备的来源于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的任何预测的肽均可用作替代性报告子以测定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的丰度。在一个实施方式中，使用特异性已知的一种或多种蛋白酶(例如一种或多种胰蛋白酶和/或胞内蛋白酶lys-c)消化样品。蛋白水解处理得到的一种或多种肽可在诸如基于质谱的srm/mrm测定的合适测定中用作替代性报告子来测定一种或多种ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的丰度。类似地，也可使用已知在ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和topo2a蛋白质中被修饰的位点处含有一个氨基酸残基的任何预测的肽序列来测定样品中ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和topo2a蛋白质的修饰程度。
ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a片段肽可通过多种方法来产生，包括使用在美国专利7,473，532中提供的liquidtissuetm方案。liquidtissuetm方案和试剂能够通过对组织/生物样品中的蛋白质进行蛋白水解消化来由福尔马林固定的石蜡包埋组织生成适用于质谱分析的肽样品。在liquidtissuetm方案中，将组织/生物制备物在缓冲液和升高的温度中保持延长的一段时间(例如，约80℃至约100℃，持续约10分钟至约4小时的时间)以逆转或释放蛋白质交联。所采用的缓冲液为中性缓冲液(例如，基于tris的缓冲液或含有去垢剂的缓冲液)且优选不干扰质谱分析的缓冲剂。随后，将组织/生物样品用包括但不限于胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和胞内蛋白酶lys-c的一种或多种蛋白酶处理足以破坏所述生物样品的组织和细胞结构并使所述样品液化的时间(例如，在约37℃至约65℃的温度下持续约30分钟至约24小时的时间)。加热和蛋白水解的结果为液态可溶性可稀释的生物分子裂解物。在一组实施方式中，选自胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和胞内蛋白酶lys-c的两种或更多种蛋白酶被用于生物样品的蛋白水解处理。
肽分离和测定
一旦制备好裂解物，就可对样品中的肽应用多种促进其分析和测量(定量)的技术。当通过质谱进行分析时，可使用一种或多种色谱方法以促进分析。
在一个实施方式中，在通过质谱仪器分析前通过液相色谱(lc)对肽进行分离。例如，可使用picofrit(100μmid/10μmtipid，新目标公司(newobjective))柱在nanoacquitylc系统(沃特斯公司(waters)，马萨诸塞州米尔福德)或easy-nlcii(赛默飞世尔科技公司(thermoscientific)，加利福尼亚州圣地亚哥)上分离肽，该柱使用jupiterproteo
在另一个实施方式中，通过亲和技术分离肽，例如基于免疫的纯化(如免疫亲和色谱)、离子选择性介质上的色谱，或在肽被修饰时通过使用适当介质进行分离，该介质是例如用于分离碳水化合物修饰的肽的凝集素。在另一个实施方式中，使用了siscapa方法，其在质谱分析前进行肽的免疫分离。该siscapa技术描述于例如美国专利号7,632,686。在另一个实施方式中，可在通过质谱进行分析前使用凝集素亲和方法(例如亲和纯化和/或色谱)来从裂解物中分离肽。分离肽组的方法(包括基于凝集素的方法)描述于例如geng等j.chromatographyb，752：293-306(2001)。免疫亲和色谱技术、凝集素亲和技术和其他形式的亲和分离和/或色谱(如反相、基于大小的分离、离子交换)可以合适的组合使用以促进通过质谱对肽进行分析。
令人惊讶的是，发现来自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的许多潜在肽序列并不适合在基于质谱的srm/mrm测定中使用或者在基于质谱的srm/mrm测定中使用时是失效的，其原因不明。具体而言，发现在来自福尔马林固定、石蜡包埋的组织的liquidtissuetm裂解物中无法有效检测或根本无法检测到许多来自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的胰蛋白酶肽。由于不可能预测最适合mrm/srm测定的肽，因此必须通过实验在实际的liquidtissuetm裂解物中鉴定修饰的和未修饰的肽以开发针对ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的可靠且准确的srm/mrm测定。不希望受任何理论约束，但认为一些肽可能例如难以通过质谱检测，因为它们不会良好地电离或生成与其它蛋白质不同的片段，肽也可能无法在分离(例如，液相色谱)中良好地解析，或者附着到玻璃或塑料器具上。因此，可在由福尔马林固定的组织样品制备的liquidtissuetm裂解物中检测的来自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的那些肽(例如，表1和2中的肽)是在ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质srm/mrm测定中可针对其使用srm/mrm测定的肽。在一个实施方式中，在单个样品中同时分离ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质时使用的蛋白酶将是胰蛋白酶。
在本发明所述多个实施方式中发现的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽(例如，表1和/或表2)通过胰蛋白酶消化复杂的liquidtissuetm裂解物内的所有蛋白质而来源于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质，该裂解物由从福尔马林固定的癌症组织中取得的细胞制备。除非另外指出，否则在各种情况下，该蛋白酶都为胰蛋白酶。liquidtissuetm裂解物随后通过质谱分析以确定通过质谱检测并分析的来源于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的那些肽。用于质谱分析的具体优选的肽亚组的鉴定基于：1)在liquidtissuetm裂解物的质谱分析中电离的来自蛋白质的一种或多种肽的实验确定，和2)肽在制备liquidtissuetm裂解物中使用的方案和实验条件下继续存在的能力。后一性质的范围不仅是肽的氨基酸序列，而且是肽内的修饰的氨基酸残基在样品制备期间以修饰的形式继续存在的能力。
从福尔马林(甲醛)固定的组织中直接取得的细胞的蛋白质裂解物使用liquidtissuetm试剂和方案制备，liquidtissuetm试剂和方案要求经由组织显微解剖将细胞收集到样品管中，接着在liquidtissuetm缓冲液中对细胞加热延长的一段时间。一旦负面地影响到福尔马林诱导的交联，则使用蛋白酶(例如包括但不限于胰蛋白酶)以可预测的形式消化组织/细胞至完全消化。通过用蛋白酶消化完整的多肽将各蛋白质裂解物而转化成肽的集合。分析(例如，通过离子阱质谱)各liquidtissuetm裂解物以对肽进行多重全局性蛋白组学研究，其中数据表示为来自各蛋白质裂解物中存在的所有细胞蛋白质的可通过质谱鉴定的尽可能多的肽的鉴定结果。通常采用离子阱质谱或能够进行全局性概要分析的另一形式的质谱来鉴定来自单一复杂蛋白质/肽裂解物的尽可能多的肽以用于分析。尽管可在包括maldi、离子阱或三重四极质谱的任何类型的质谱上开发并进行srm/mrm测定，但通常认为对于srm/mrm测定而言最有利的仪器平台是三重四极质谱仪器平台。
一旦在所采用的条件下在单一裂解物的单一ms分析中鉴定出尽可能多的肽，则整理肽的列表并将其用于确定在该裂解物中检测到的蛋白质。对于多种liquidtissuetm裂解物重复该过程，并将非常大的肽列表整理成单一数据集。可将该类型的数据集视为代表可在分析的生物样品类型中(蛋白酶消化之后)、特别是在生物样品的liquidtissuetm裂解物中检测到的肽，且因此包括诸如ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的具体蛋白质的肽。
在一个实施方式中，ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a胰蛋白酶肽被鉴定为可用于测定以下肽的绝对或相对含量：ent1(例如，ncbi登录号q99808、seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6、seqidno：7)，ercc1(例如，ncbi登录号p07992、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：11、seqidno：12、seqidno：13、seqidno：14、seqidno：15、seqidno：16)，folr1(例如，ncbi登录号p15328、seqidno：17、seqidno：18、seqidno：19、seqidno：20)，rrm1(例如，ncbi登录号p23921、seqidno：21、seqidno：22、seqidno：23、seqidno：24、seqidno：25、seqidno：26、seqidno：27、seqidno：28、seqidno：29、seqidno：30、seqidno：31、seqidno：32、seqidno：33、seqidno：34、seqidno：35、seqidno：36、seqidno：37)，topo1(例如，ncbi登录号p11387、seqidno：38、seqidno：39、seqidno：40、seqidno：41、seqidno：42、seqidno：43、seqidno：44、seqidno：45、seqidno：46、seqidno：47、seqidno：48seqidno：49、seqidno：50、seqidno：51、seqidno：52、seqidno：53、seqidno：54、seqidno：55、seqidno：56、seqidno：57、seqidno：58)，topo2a(例如，ncbi登录号p11388、seqidno：59、seqidno：60、seqidno：61、seqidno：62、seqidno：63、seqidno：64、seqidno：65、seqidno：66、seqidno：67、seqidno：68、seqidno：69、seqidno：70、seqidno：71、seqidno：72、seqidno：73、seqidno：74、seqidno：75、seqidno：76、seqidno：77、seqidno：78.seqidno：79、seqidno：80、seqidno：81、seqidno：82、seqidno：83、seqidno：84、seqidno：85、seqidno：86、seqidno：87、seqidno：88、seqidno：89、seqidno：90、seqidno：91、seqidno：92、seqidno：93、seqidno：94、seqidno：95、seqidno：96、seqidno：97、seqidno：98、seqidno：99、seqidno：100、seqidno：101)和/或tubb3(例如，ncbi登录号q13509、seqidno：102、seqidno：103)，其各自列于表1。那些肽各自在由福尔马林固定、石蜡包埋的组织制备的liquidtissuetm裂解物中通过质谱检测。因此，表1中的各肽或那些肽的任意组合(例如，一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种，或十种或更多种表1中那些肽)是用于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的定量srm/mrm测定的候选物，包括直接在福尔马林固定的患者或对象组织中进行测定。
表1
表1中列出的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a胰蛋白酶肽包括从包括前列腺、结肠和乳腺的不同人类器官的多种不同福尔马林固定的组织的多种liquidtissuetm裂解物中检测到的那些。那些肽各自被视为可用于福尔马林固定的组织中的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的定量srm/mrm测定。这些实验的进一步数据分析表明，并没有优先观察到来自任何特定器官位点的任何特定肽。因此，这些肽中的每一种都被认为是适合对来自来源于任何生物样品或体内的任何器官位点的任何福尔马林固定的组织的liquidtissuetm裂解物进行ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的srm/mrm测定。
在另一个实施方式中，srm/mrm测定使用topo2a和topo1各自的一种或两种肽(例如，来自表1中列举的肽)。在另一个实施方式中，srm/mrm测定使用ent1、ercc1、folr1、rrm1和/或tubb3各自的一种或两种肽(例如，来自表1中列举的肽)。
在其他实施方式中，使用srm/mrm测定测量ent1和ercc1蛋白质之一或全部两种并测定folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质中的一种、两种、三种或四种。在这类实施方式的一个实施例中，通过srm/mrm测定测量folr1、rrm1蛋白质之一或全部两种的至少一种肽或至少两种肽(例如表1中列举的folr1、rrm1肽)；且测定ent1、ercc1、tubb3、topo1和/或topo2a中任意一种、两种、三种或四种的至少一种肽或至少两种肽(例如，表1中列举的肽)。在这类实施方式的另一个实施例中，通过srm/mrm测定测量ent和rrm1蛋白质之一或全部两种的至少一种或至少两种肽(例如表1中列举的肽)；且测定ercc1、folr1、tubb3、topo1和/或topo2a中任一种的至少一种或至少两种肽(例如，表1中列举的肽)。本发明提供了包含肽的组合物，这些肽经同位素标记但其他均与本发明提供的这些实施方式中任一种所示的一种或多种肽相同，且下文描述了其制备物应用，特别是用作质谱标准品。
在一个实施方式中，通过不依赖质谱的方法测定一种或多种表1中的肽或那些肽的任意组合(例如，一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种)，该方法包括但不限于免疫方法(例如western印记或elisa)。在一个实施方式中，使用福尔马林固定的组织进行测定。无论如何获得涉及肽(绝对或相对)含量的信息，该信息均可用于本发明所述任意方法，包括显示(诊断)患者或对象中癌症的存在、确定癌症的阶段/等级/状态、提供预后，或确定针对患者或对象的治疗剂或治疗方案。
在其他实施方式中，通过不依赖质谱的方法测定ent1和ercc1蛋白质之一或全部两种，并测定folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质中的一种、两种、三种或四种，该方法包括但不限于免疫方法(例如western印记或elisa)。在这类实施方式的一个实施例中，测定了ent1和ercc1蛋白质之一或全部两种的至少一种或至少两种肽(例如，表1中列举的ent1和ercc1肽)；且测定了folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质中的任意一种、两种、三种或四种的至少一种或至少两种肽(例如，表1中列举的肽)。在这类实施方式的另一个实施例中，测定了folr1和rrm1蛋白质之一或全部两种的至少一种或至少两种肽(例如，表1中列举的folr1和rrm1肽)；且测定了ent1、ercc1、tubb3、topo1和topo2a蛋白质中任一种的至少一种或至少两种肽(例如，表1中列举的肽)。
在进行srm/mrm测定时一个重要的考虑因素为可用于肽分析的仪器的类型。尽管可在包括maldi、离子阱或三重四极质谱仪的任何类型的质谱仪上开发并进行srm/mrm测定，但目前用于srm/mrm测定的最有利的仪器平台通常被认为是三重四极仪器平台。该类型的质谱常被视作最适用于分析可由来自细胞内含有的所有蛋白质的数万至数百万个单个肽组成的很复杂的蛋白质裂解物内的单个分离的靶标肽。
为了对来源于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的各种肽最有效地实施srm/mrm测定，需要在分析中利用除了肽序列之外的信息。该额外信息可用于引导并指导质谱(例如，三重四极质谱)对特异性靶标肽进行正确且集中的分析，从而可有效地进行测定。
关于靶标肽总体和关于特定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽的额外信息可包括各肽的单同位素质量、其前体电荷状态、前体m/z值、m/z过渡离子和各过渡离子的离子类型中的一种、两种、三种、四种或更多种。可用于开发针对ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的srm/mrm测定的额外肽信息示于表2中，其针对表1中列举的十二(12)种ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽。可制备、获得针对表2中显示的肽进行描述的该额外信息并将其应用到来自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的任意其它肽的分析中，包括通过其他蛋白酶或蛋白酶组合(例如胰蛋白酶和/或lysc)生成的那些肽。
表2
在一些实施方式中，适用于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的测定的肽(例如表1所示和sedidno.1-103所示的肽)可含有肽序列内部的额外蛋白水解位点，其在被切割时将生成子肽(sub-peptide)。这类子肽可通过评估针对所需蛋白酶的蛋白水解切割位点的经鉴定肽的序列来识别。在一个实施方式中，胰蛋白酶肽可包括额外的内部胰蛋白酶切割位点，其可在由胰蛋白酶进行进一步切割后生成子肽。
在另一个实施方式中，胰蛋白酶肽可含有蛋白酶的内部位点，该蛋白酶包括但不限于胰蛋白酶、gluc、aspn、胰凝乳蛋白酶和/或lysc，其可导致在由胰蛋白酶、gluc、aspn、胰凝乳蛋白酶和/或lysc中的任意一种、两种或更多种切割后形成子肽。在另一个实施方式中，lysc肽可含有其他蛋白酶的内部位点，该其他蛋白酶是例如gluc、aspn、胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶，其可导致在由gluc、aspn、胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶中的任意一种、两种或更多种切割后形成子肽。应理解，这类子肽，且具体而言是seqidno.1-103所示肽中任意一种或多种的胰蛋白酶、gluc、aspn、胰凝乳蛋白酶和/或lysc切割片段，列入且包含在本发明的范围内。
本发明所列实施方式包括组合物，其包含一种或多种表1和2中的肽且可任选地包含经同位素标记但其他方面与一种或多种表1和2中的肽相同的肽。在一些实施方式中，这些组合物包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种，或全部一百零三(103)种表1和2中的肽。这类组合物可任选地包括肽、多肽或蛋白质，其氨基酸序列包含经同位素标记但其他方面与一种或多种表1和表2中的肽相同的肽。使用包含一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种表1和2中肽的经同位素标记的合成或天然肽、多肽或蛋白质时，蛋白酶处理释放经同位素标记但其他方面与表1和2中的肽相同的肽。
例如，可使用同位素标记的氨基酸在程序化的细胞裂解物或组织培养物中制备这类同位素标记的生物或生物合成肽。各同位素标记的肽可使用一种或多种同位素标记，这些同位素独立地选自18o、17o、34s、15n、13c、2h或其组合。无论是否经同位素标记，包含来自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的肽的组合物均无需含有所有来自该蛋白质的肽(例如完整的胰蛋白酶肽组)。在一些实施方式中，这些组合物不含有来自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的组合形式的所有肽，且具体而言不含有所有表1和表2中出现的肽。包含肽的组合物可以是干燥或冻干的材料、液体(如水性)溶液或悬浮液、阵列或印记的形式。
在一个实施方式中，涉及特定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽的额外信息包括以下一种或多种、两种或更多种，或三种或更多种：各肽的单同位素质量、其前体电荷状态、前体m/z值、m/z过渡离子，以及ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的lysc蛋白水解所得肽的各过渡离子的离子类型。
在另一个实施方式中，涉及特定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽的额外信息包括以下一种或多种、两种或更多种，或三种或更多种：各肽的单同位素质量、其前体电荷状态、前体m/z值、m/z过渡离子，以及ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的胰蛋白酶蛋白水解所得肽的各过渡离子的离子类型。
在另一个实施方式中，涉及特定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽的额外信息包括以下一种或多种、两种或更多种，或三种或更多种：各肽的单同位素质量、其前体电荷状态、前体m/z值、m/z过渡离子，以及ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的胰蛋白酶和/或lysc蛋白水解所得肽的各过渡离子的离子类型。在一个实施方式中，来自各ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的单个胰蛋白酶和/或lysc蛋白水解肽以及相关额外信息被用于诊断确定(diagnosticdetermination)。
具体实施方式
本发明的具体实施方式如下。
1.一种测量生物样品中ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的水平的方法，包括使用质谱检测和/或定量由所述生物样品制备的蛋白质消化物中一种或多种修饰的和/或未修饰的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质片段肽的含量；并计算所述样品中修饰的或未修饰的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的水平；且所述含量是相对含量或绝对含量。
2.实施方式1的方法，还包括在检测和/或定量一种或多种修饰的或未修饰的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质片段肽的含量前对所述蛋白质消化物进行分级的步骤。
3.实施方式2的方法，其中所述分级步骤选自凝胶电泳、液相色谱、毛细管电泳、纳米反向液相色谱、高效液相色谱或反向高效液相色谱。
4.实施方式1-3中任一项的方法，其中所述生物样品的所述蛋白质裂解物通过liquidtissuetm方案制备。
5.实施方式1-3中任一项的方法，其中所述蛋白质消化物包括蛋白酶消化物。
6.实施方式5的方法，其中所述蛋白质消化物包括胰蛋白酶和/或lysc消化物。
7.实施方式1-6中任一项的方法，其中所述质谱包括串联质谱、离子阱质谱、三重四极质谱、maldi-tof质谱、maldi质谱和/或飞行时间质谱。
8.实施方式7的方法，其中使用的质谱模式是选择反应监测(srm)、多反应监测(mrm)和/或多选择反应监测(msrm)，或其任意组合。
9.实施方式1-8中任一项的方法，其中ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质片段肽包含seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：11、seqidno：12、seqidno：13、seqidno：14、seqidno：15、seqidno：16、seqidno：17、seqidno：18、seqidno：19、seqidno：20、seqidno：21、seqidno：22、seqidno：23、seqidno：24、seqidno：25、seqidno：26、seqidno：27、seqidno：28、seqidno：29、seqidno：30、seqidno：31、seqidno：32、seqidno：33、seqidno：34、seqidno：35、seqidno：36、seqidno：37、seqidno：38、seqidno：39、seqidno：40、seqidno：41、seqidno：42、seqidno：43、seqidno：44、seqidno：45、seqidno：46、seqidno：47、seqidno：48seqidno：49、seqidno：50、seqidno：51、seqidno：52、seqidno：53、seqidno：54、seqidno：55、seqidno：56.seqidno：57、seqidno：58、seqidno：59、seqidno：60、seqidno：61、seqidno：62、seqidno：63、seqidno：64、seqidno：65、seqidno：66、seqidno：67、seqidno：68、seqidno：69、seqidno：70seqidno：71、seqidno：72、seqidno：73、seqidno：74、seqidno：75、seqidno：76、seqidno：77、seqidno：78.seqidno：79、seqidno：80、seqidno：81、seqidno：82、seqidno：83、seqidno：84、seqidno：85、seqidno：86、seqidno：87、seqidno：88、seqidno：89、seqidno：90、seqidno：91、seqidno：92、seqidno：93、seqidno：94、seqidno：95、seqidno：96、seqidno：97、seqidno：98、seqidno：99、seqidno：100、seqidno：101、seqidno：102和seqidno：103所示的氨基酸序列。
10.实施方式1-9中任一项的方法，其中该生物样品是血液样品、尿样品、血清样品、腹水样品、疲液样品、淋巴液、唾液样品、细胞或实体组织。
11.实施方式1-10中任一项的方法，其中该生物样品是福尔马林固定的组织。
12.实施方式1-11中任一项的方法，其中该生物样品是石蜡包埋的组织。
13.实施方式1-12中任一项的方法，其中该生物样品是获自肿瘤的组织。
14.实施方式13的方法，其中该肿瘤是原发性肿瘤。
15.实施方式13的方法，其中该肿瘤是继发性肿瘤。
16.实施方式1-15中任一项的方法，还包括定量修饰的和/或未修饰的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质片段肽。
17(a).实施方式1-16中任一项的方法，其中定量ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质片段肽包括比较一种生物样品中包含ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的约8至约45各氨基酸残基的氨基酸序列的一种或多种ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质片段肽的含量与不同和单独的样品或生物样品中相同ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质片段肽的含量。
17(b).实施方式1-16中任一项的方法，其中定量ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质片段肽包括比较一种生物样品中包含ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的约8至约45个氨基酸残基的氨基酸序列的一种或多种ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质片段肽的含量与不同和单独的样品或生物样品中相同ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质片段肽的含量，所述片段肽示于seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：11、seqidno：12、seqidno：13、seqidno：14、seqidno：15、seqidno：16、seqidno：17、seqidno：18、seqidno：19、seqidno：20、seqidno：21、seqidno：22、seqidno：23、seqidno：24、seqidno：25、seqidno：26、seqidno：27、seqidno：28、seqidno：29、seqidno：30、seqidno：31、seqidno：32、seqidno：33、seqidno：34、seqidno：35、seqidno：36、seqidno：37、seqidno：38、seqidno：39、seqidno：40、seqidno：41、seqidno：42、seqidno：43、seqidno：44、seqidno：45、seqidno：46、seqidno：47、seqidno：48、seqidno：49、seqidno：50、seqidno：51、seqidno：52、seqidno：53、seqidno：54、seqidno：55、seqidno：56.seqidno：57、seqidno：58、seqidno：59、seqidno：60、seqidno：61、seqidno：62、seqidno：63、seqidno：64、seqidno：65、seqidno：66、seqidno：67、seqidno：68、seqidno：69、seqidno：70seqidno：71、seqidno：72、seqidno：73、seqidno：74、seqidno：75、seqidno：76、seqidno：77、seqidno：78.seqidno：79、seqidno：80、seqidno：81、seqidno：82、seqidno：83、seqidno：84、seqidno：85、seqidno：86、seqidno：87、seqidno：88、seqidno：89、seqidno：90、seqidno：91、seqidno：92、seqidno：93、seqidno：94、seqidno：95、seqidno：96、seqidno：97、seqidno：98、seqidno：99、seqidno：100、seqidno：101、seqidno：102和seqidno：103。
18.实施方式17(a)或17(b)的方法，其中定量一种或多种ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质片段肽包括通过与添加的已知含量的内标肽比较来测定生物样品中ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质片段肽中每一种的含量，其中该生物样品中的各ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质片段肽与具有相同氨基酸序列的添加的内标肽相比较。
19.实施方式18的方法，其中该内标肽是同位素标记的肽。
20.实施方式19的方法，其中该同位素标记的内标肽包含选自18o、17o、34s、15n、13c、2h或其组合的一种或多种重稳定同位素。
21.实施方式1-20中任一项的方法，其中检测和/或定量该蛋白质消化物中一种或多种修饰的或未修饰的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质片段肽的含量表示存在修饰的和/或未修饰的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质以及与患者或对象中癌症的相关性。
22.实施方式21的方法，还包括关联所述检测和/或定量该蛋白质消化物中一种或多种修饰的和/或未修饰的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质片段肽的含量或所述ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的含量的结果与癌症的诊断阶段/等级/状态。
23.实施方式22的方法，其中关联所述检测和/或定量该蛋白质消化物中一种或多种修饰的或未修饰的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质片段肽的含量或所述ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的含量的结果与癌症的诊断阶段/等级/状态与检测和/或定量其他蛋白质或来自其他蛋白质的肽的含量以多重方式联用，从而提供关于癌症的诊断阶段/等级/状态的额外信息。
24.实施方式1-23中任一项的方法，还包括针对患者或对象选择治疗，所述生物样品获自所述患者或对象，所述治疗基于一种或多种ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质片段肽的存在、不存在或含量或者ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的含量。
25.实施方式1-24中任一项的方法，还包括向患者或对象给予治疗有效量的治疗剂，所述生物样品获自所述患者或对象，其中给予的治疗剂和/或治疗剂的含量基于一种或多种修饰的或未修饰的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质片段肽的含量或ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的含量。
26.实施方式24和25的方法，其中该治疗或该治疗剂针对表达ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的癌细胞。
27.实施方式1-27的方法，其中该生物样品是经处理的福尔马林固定的肿瘤组织，所述处理用于使用liquidtissuetm方案和试剂定量一种或多种修饰的或未修饰的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质片段肽的含量。
28.实施方式1-28中任一项的方法，其中所述一种或多种修饰的或未修饰的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质片段肽是一种或多种表1中的肽。
29.一种组合物，其包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种，或十种或更多种表1中的肽和/或其抗体。
30.实施方式30的组合物，其包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种，或十种或更多种表2中的肽和/或其抗体。
示例性srm/mrm测定方法
下文所述的方法用于：1)鉴定可用于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的基于质谱的srm/mrm测定的来自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的候选肽，2)针对来自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的靶标肽开发单个srm/mrm测定或多种srm/mrm测定，和3)将定量测定应用于癌症诊断和/或最佳疗法的选择。
1.ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的srm/mrm候选片段肽的鉴定：
a.使用一种或多种蛋白酶(可能包括或可能不包括胰蛋白酶)消化蛋白质，从而由福尔马林固定的生物样品制备liquidtissuetm蛋白质裂解物
b.在离子阱串联质谱上分析liquidtissuetm裂解物中的所有蛋白质片段并鉴定来自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的所有片段肽，其中单个片段肽不含任何诸如磷酸化或糖基化的肽修饰
c.在离子阱串联质谱上分析liquidtissuetm裂解物中的所有蛋白质片段并鉴定来自带有诸如磷酸化或糖基化残基的肽修饰的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的所有片段肽
d.可测量由完整的全长ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质通过具体消化方法可能产生的所有肽，但用于开发srm/mrm测定的优选肽为在由福尔马林固定的生物样品制备的复杂liquidtissuetm蛋白质裂解物中通过质谱直接鉴定的那些
e.在分析来自福尔马林固定的生物样品的liquidtissuetm裂解物时将在患者或对象组织中特异性修饰(磷酸化、糖基化等)并在质谱中电离化且因此可被检测的肽鉴定为用于测定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的肽修饰的候选肽
2.来自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的片段肽的质谱测定
a.将针对liquidtissuetm裂解物中鉴定的单个片段肽的三重四极质谱上的srm/mrm测定应用于来自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的肽
i.针对包括但不限于以下实验的最佳色谱条件确定片段肽的最佳保留时间：凝胶电泳、液相色谱、毛细管电泳、纳米反向液相色谱、高效液相色谱或反向高效液相色谱
ii.确定肽的单同位素质量、各肽的前体电荷状态、各肽的前体m/z值、各肽的m/z过渡离子和各片段肽的各过渡离子的离子类型以开发用于各肽的srm/mrm测定。
iii.随后可使用来自(i)和(ii)的信息在三重四极质谱上进行srm/mrm测定，其中各肽均具有特征性且独特的srm/mrm特征峰，该特征峰精确地限定在三重四极质谱上进行的独特的srm/mrm测定
b.进行srm/mrm分析使得来自srm/mrm质谱分析的独特srm/mrm特征峰面积的函数形式的所检测的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的片段肽的含量可指示特定蛋白质裂解物中ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的相对含量和绝对含量。
iv.相对定量可通过以下实现：
1.通过比较以下数值来确定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的增加或减少的存在量：来自一种福尔马林固定的生物样品的liquidtissuetm裂解物中检测到的给定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽的srm/mrm特征峰面积与来自至少第二、第三、第四或更多的福尔马林固定的生物样品的至少第二、第三、第四或更多的liquidtissue裂解物中相同ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a片段肽的相同srm/mrm特征峰面积
2.通过比较以下数值来确定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的增加或减少的存在量：来自一种福尔马林固定的生物样品的liquidtissue裂解物中检测到的给定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽的srm/mrm特征峰面积与由来源于不同且单独的生物来源的其它样品中的其它蛋白质的片段肽发展的srm/mrm特征峰面积，其中针对肽片段的两种样品之间的srm/mrm特征峰面积的比较标准化至各样品中分析的蛋白质的含量。
3.通过比较以下数值来确定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的增加或减少的存在量：给定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽的srm/mrm特征峰面积与来自福尔马林固定的生物样品的相同liquidtissue裂解物内的不同蛋白质来源的其它片段肽的srm/mrm特征峰面积，从而将ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的变化水平标准化至多种细胞条件下都不改变其表达水平的其它蛋白质的水平。
4.这些测定可应用于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的未修饰的片段肽和修饰的片段肽，其中修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化，且其中以与确定未修饰的肽的相对含量相同的方式确定修饰的肽的相对水平。
v.给定肽的绝对定量可通过比较以下数值来实现：来自单个生物样品中的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的给定片段肽的srm/mrm特征峰面积与掺入来自生物样品的蛋白质裂解物中的内部片段肽标准物的srm/mrm特征峰面积
1.内标物为测量中的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的片段肽的经标记的合成形式。将该标准物以已知量掺入样品中，并可单独地确定生物样品中的天然肽片段和内部片段肽标准物的srm/mrm特征峰面积，接着比较两个峰面积
2.这可应用于未修饰的片段肽和修饰的片段肽，其中这些修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化，且其中可以与确定未修饰的肽的绝对水平相同的方式来确定修饰的肽的绝对水平。
3.将片段肽定量应用于癌症诊断和治疗
a.进行ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的片段肽水平的相对和/或绝对定量并说明证实了患者或对象肿瘤组织中的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质表达与阶段/等级/状况的先前确定的关联性，如同在癌症领域中充分理解的那样
b.进行ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的片段肽水平的相对和/或绝对定量并说明与来自不同治疗策略的临床结果的关联性，其中该关联性已经在该领域中说明或可在将来说明(通过针对患者或对象群或来自那些患者或对象的组织的关联性研究)。一旦通过该测定证实了先前确立的关联性或将来得出的关联性，则该测定方法可用于确定最佳治疗策略
内标物可以是来自正被测量的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的片段肽的经标记合成形式(或包含蛋白水解后释放的片段肽的经标记合成形式的蛋白质或多肽)。该标准物以已知含量掺入样品中，且可单独确定生物样品中内部片段肽标准物和天然片段肽的srm/mrm特征峰面积，随后比较这两个峰面积。这可应用于未修饰的片段肽和修饰的片段肽，其中修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化，且可以与测定未修饰肽的绝对水平相同的方式测定修饰的肽的绝对水平。
通过在离子阱和三重四极质谱上分析所有肽来开发特定肽相关的特定且独特的特性。该信息包括该肽的单同位素质量、其前体电荷状态、前体m/z值、该前体的过渡m/z值和各鉴定的过渡离子的离子类型。该信息必须针对在来自福尔马林固定的样品/组织的liquidtissue裂解物中直接存在的每个和每一个候选srm/mrm肽通过实验进行测定；原因在于，有趣的是，并非所有来自蛋白质的肽都可使用本发明所述的srm/mrm在这类裂解物中检测，表明未检测的肽无法被视为开发用于定量来自福尔马林固定的样品/组织的liquidtissue裂解物中直接存在的肽/蛋白质的srm/mrm测定的候选肽。
在三重四极质谱上进行特定肽的具体srm/mrm测定。通过具体的srm/mrm测定分析的实验样品是例如从福尔马林固定和石蜡包埋的组织中制备的liquidtissue蛋白质裂解物。来自这类测定的数据显示存在针对福尔马林固定的样品中该肽的独特srm/mrm特征峰。
该肽的特定过渡离子特性被用于定量测量福尔马林固定的生物样品中具体的肽。这些数据显示该肽的绝对含量，显示为每微克所分析蛋白质裂解物中肽的摩尔含量的函数形式。
基于福尔马林固定的患者来源或对象来源组织的分析进行的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质水平的评估可提供涉及具体患者或对象的诊断、预后和治疗上相关的信息。本发明描述了一种测量生物样品中ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质水平的方法，包括使用质谱检测和/或定量由所述生物样品制备的蛋白质消化物中一种或多种修饰的或未修饰的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质片段肽的含量；和计算所述样品中修饰的或未修饰的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的水平；且其中所述水平是相对水平或绝对水平。在相关的实施方式中，定量一种或多种ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质片段肽包括通过与添加的已知含量的内标肽相比较来测定生物样品中各ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质片段肽的含量，其中该生物样品中各ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质片段肽与具有相同氨基酸序列的内标肽相比较。在一些实施方式中，该内标物是同位素标记的内标肽，其包含一种或多种选自18o、17o、34s、15n、13c、2h或其组合的重稳定同位素。
本发明所述的测定生物样品中ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质(或作为其替代物的片段肽)的水平的方法可用作患者或对象中癌症的诊断学指示物。在一个实施方式中，ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质水平的测量结果可用于确定癌症的诊断阶段/等级/状态，方法为关联(如比较)组织中发现的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的水平与正常和/或癌性或癌前组织中发现的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的水平。
仅有的正在使用的检测福尔马林固定的患者样品中特定蛋白质水平的方法是免疫组化(ihc)。该方法在来自患者肿瘤组织样品的单个组织切片上一次仅分析一种蛋白质。因此，为分析多种蛋白质样品，必须同时测量多个组织切片，这费时且费力。ihc使用抗体检测靶蛋白质的存在，且任何ihc实验中都因为抗体与蛋白质非特异性结合的潜在可能性而存在巨大的固有潜在信号背景。此外，ihc充其量不过是半定量的。由于这些问题，ihc无法同时提供多种蛋白质的客观定量分析。当前的实施方式能够使用单个患者组织样品切片以100％测定特异性同时提供ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的客观定量，在节约大量时间和金钱的同时提供更富有价值的涉及ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质表达的数据。
该多重srm/mrm测定还可包括在ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质以外同时分析其他额外蛋白质，包括药物靶蛋白质如egfr、igf-1r和cmet。这是有价值的，因为额外蛋白质的分析还显示哪些额外蛋白质可用于治疗具体癌症。基于额外示例性药物靶蛋白质分析的额外蛋白质的示例包括靶向egfr受体的爱必妥(erbitux)、靶向igf-1r的figitumumab，以及靶向c-met和血管内皮生长因子受体2(vegfr-2)的foretinib。
因为核酸和蛋白质两者都可由相同的liquidtissuetm生物分子制备物分析，所以可以由用于蛋白质分析的相同样品中的核酸生成关于疾病诊断和药物治疗决定的额外信息。例如，如果ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质由某些细胞以增加的水平表达，当通过srm测定时，数据可提供关于细胞的状态及其不受控制地生长的潜在性、潜在的抗药性和癌症发展的信息。同时，可从相同的liquidtissuetm生物分子制备物中存在的核酸中获得关于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a基因和/或核酸及其编码的蛋白质的状况的信息(例如，mrna分子及其表达水平或剪接变化)，可在ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的srm分析的同时对其进行评价。可在ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质的srm分析的同时对不来自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a且存在于相同生物分子制备物中的任何基因和/或核酸进行评价。在一个实施方式中，关于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白质和/或一种、两种、三种、四种或更多种额外的蛋白质的信息可通过检查编码那些蛋白质的核酸来评价。那些核酸可例如通过以下方法中的一种或多种、两种或更多种或三种或更多种检查：测序方法、聚合酶链式反应方法、限制性片段多态性分析、插入、缺失的鉴定，和/或是否存在突变的确定，包括但不限于单碱基对多态性、转换、颠换或其组合。
上述说明书以及方法和组合物的示例性实施方式说明了本发明的范围。然而，由于变化对于本领域技术人员而言是明显的，本发明不限于上文所述的具体实施方式。
序列表
<110>爱科谱迅病理研究公司(expressionpathologyinc)
<120>针对化疗靶标的srm测定
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