本发明涉及一种结合1H-NMR和CRAFT技术检测天麻中有效成分的方法，属于药品分析检测的技术领域。
背景技术：
天麻(Gastrodia elataBl.)是兰科天麻属多年生草本植物，主产于我国云南、贵州、四川等地。天麻味甘，性平，微辛，主入肝经，有平肝息风等功能，其根茎入药用以治疗头晕目眩、肢体麻木、小儿惊风等症，是名贵中药，贵州产天麻与灵芝、杜仲并称为“贵州三宝”，是一种道地药材。
天麻的化学成分主要含酚类及其甙、甾醇类、有机酸类、氨基酸等，还含有具有增强免疫作用的天麻多糖以及多种微量元素。天麻含量较高的主要有效成分是天麻甙 (gastrodin)，也称天麻素，其化学组成为对-羟基苯-β-D-吡喃葡萄糖甙(p- hydroxymethylphenyl-β-D-glucopyranoside)。天麻具有镇痛作用，临床有效率高达90％，利用天麻素治疗神经衰弱和神经衰弱综合症病人，有效率均高达85％以上，具有明显的镇静作用，天麻还能治疗高血压，尚有明目和显著增强记忆力的作用等。天麻临床效果明显，天麻注射液、天麻胶囊、天麻酒等一系列天麻中药制剂被逐一开发出来，但其药源紧张，而其药材本身及其中成药未有统一而健全的质量控制标准，以次充好、以假乱真的现象层出不穷，严重影响其用药安全和临床药效。中药指纹图谱是国际上公认的控制天然药物或中草药的最有效的一种手段，可用来鉴别中药的真假，评价中药的品质，具有整体性与模糊性的特点。氢核磁共振(1H-NMR)指纹图谱是中药指纹图谱中一种鉴定和控制植物中药质量的新方法，较最常用的HPLC具有样品预处理简单，色谱分离不会损失样品中的组分；样品的结构和性质不会受到破坏；对样品中所有成分的灵敏度一致的优点，且不需要对照品和对照试验。1H-NMR指纹图谱具有单一性、全面性、易辨性、定量性的特点。所测样品中每个基团上的氢在1H-NMR谱中都有相关的谱峰，且是一一对应的关系，通过化合物结构的研究可归属图谱上的每一个信号，其信号强弱反映样品各个基团上氢的数目比例。通过1H-NMR可获得化合物各个质子的化学位移、偶合常数、峰裂分情况以及峰面积等的大量结构信息。对于中药复杂的化学成分，1H-NMR方法客观而全面地反映了其化学特征和整体化学组成，但是信号的重叠也使图谱变得十分复杂，且受基线校正和相位校正的影响，应用于中药成分的鉴定和含量测定困难。
技术实现要素：
本发明的目的在于，提供一种结合1H-NMR和CRAFT技术检测天麻中有效成分的方法。所述方法能快速准确地对天麻中天麻素和对羟基苯甲醇进行定性和定量分析。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案实现：
一种结合1H-NMR和CRAFT技术定性和定量分析天麻中有效成分的方法，包括如下步骤：
步骤一：供试品、对照品和内标溶液的制备
取天麻，按常规方法制成总提物浸膏；准确称取总提物浸膏，用DMSO-d6溶解于核磁管中，得供试品溶液；
称取天麻素TMS和对羟基苯甲醇O-TM标准品，以DMSO-d6溶解，制成TMS标准品溶液和O-TM标准品溶液；
准确称取间苯三酚标准品，以DMSO-d6溶解，制得间苯三酚标准溶液，以作为定量核磁共振的内标；
步骤二：1HNMR指纹图谱的测定及优化
采用Varian 400MHz核磁共振波谱仪，测试天麻供试品溶液的1HNMR指纹图谱，得天麻1HNMR谱图；运用CPMG技术优化图谱；
步骤三：CRAFT定性分析
导入天麻CPMGT2谱图，进入CRAFT分析软件，对天麻素和对羟基苯甲醇特征峰进行下采样，执行CRAFT计算，导入天麻素和对羟基苯甲醇指纹表，提取频率振幅表，所得频率F、振幅A和CRAFT模型用于定性分析，特征峰频率F所对应的振幅A之比等于其质子数之比，从而鉴定天麻中天麻素和对羟基苯甲醇；
步骤四：CRAFT定量分析
线性关系考察：制备5个不同浓度比的天麻提取物和内标物间苯三酚混合待测样品，振荡摇匀后测定其CPMGT2谱图，对每个样品中天麻素、对羟基苯甲醇和间苯三酚的定量峰进行5次CRAFT计算提取其振幅值，求其平均值，分别以天麻素、对羟基苯甲醇与间苯三酚定量峰的振幅比对天麻总提取物与间苯三酚的质量比(x，Ws/Wr)进行线性回归；
精密度考察和定量分析：选取同一批天麻样品，制备5份天麻总提物和内标物间苯三酚的混合样品，测定其CPMGT2谱图，进行精密度的测定，对样品中天麻素、对羟基苯甲醇和间苯三酚的定量峰进行5次CRAFT分析提取其振幅A值，求其平均值，计算天麻中天麻素和对羟基苯甲醇的含量。
具体地说，所述步骤一中，供试品溶液这样制备：取天麻，蒸50～60min蒸透后切成薄片，烘干，粉碎过三号筛，取天麻粉末，加入25倍量50％稀乙醇超声30min，超声条件：150w，40KHz；静置，用水系微孔滤膜经注射器挤压过滤，取滤液回收溶剂，在50℃烘箱中挥干，得总提物浸膏；准确称取总提物浸膏，以0.03倍量的DMSO-d6溶解于核磁管中，得供试品溶液。
具体地说，所述步骤一中，对照品溶液这样制备：称取天麻素TMS和对羟基苯甲醇 O-TM标准品，以DMSO-d6溶解，制成含量为5.15mg/mL TMS标准品溶液和2.65mg/mL O-TM标准品溶液。
具体地说，所述步骤一中，内标溶液这样制备：准确称取间苯三酚标准品，以DMSO- d6溶解，制得含量为10.4mg/mL的间苯三酚标准溶液，以作为定量核磁共振的内标。
具体地说，所述步骤二为：采用Varian 400MHz核磁共振波谱仪，测试天麻供试品溶液的1HNMR指纹图谱，测定温度为25.0℃，增益为20，延迟时间10s，采样次数为4次，线性加宽因子为1Hz，得天麻1HNMR谱图；运用CPMG技术优化图谱，测定温度为25.0℃，增益为20，延迟时间10s，采样次数为4次，线性加宽因子为1Hz，自旋回波循环时间tau为0.001s，自旋回波循环总时间bigtau依次为0.001s、0.01、0.025s、0.03s、0.05s、0.1s；当bigtau＝0.1s (即100ms)时，大分子信号滤干净了而小分子信号仍在，从而优化了谱图。
具体地说，所述步骤三为：导入天麻CPMGT2谱图，进入CRAFT分析软件，对天麻素和对羟基苯甲醇特征峰进行下采样，下采样因素为32，线展宽为1，CRAFT最大线宽为20，执行 CRAFT计算，导入天麻素和对羟基苯甲醇指纹表，提取频率振幅表，所得频率F、振幅A和 CRAFT模型用于定性分析，特征峰频率F所对应的振幅A之比等于其质子数之比，从而鉴定天麻中天麻素和对羟基苯甲醇。
本发明通过核磁CPMGT2和CRAFT技术的结合来实现对天麻混合物中主要化合物天麻素和对羟基苯甲醇进行定性和定量分析。其特征是利用了CRAFT(Complete Reduction to Amplitude Frequency Table)技术。CRAFT是核磁共振混合物分析的新方法，应用于天麻有效成分的定性和定量分析，是直接对核磁共振FID信号拟合，全自动化分析一个或者一系列FID，获得复杂混合物谱图中所有信号或感兴趣的特征吸收峰的化学位移，振幅和线宽，消除了由于相位校正，基线校正的积分误差，不需要对照品和对照试验，使用内标法计算混合物中化合物的含量大小。以下是天麻素和对羟基苯甲醇的结构式：
CRAFT-NMR是混合物分析的一种新方法。运用CRAFT技术对天麻总提物进行定性分析，结果表明化合物特征峰的振幅比等于其对应的质子数之比，为混合物中化合物特征峰的归属提供了一个新的识别方法；CRAFT分析方法对天麻总提物中天麻素和对羟基苯甲醇的含量测定线性关系良好，精密度较高，其定量分析实验结果(天麻素含量为0.4608％，对羟基苯甲醇含量为0.1132％)与HPLC定量分析结果(天麻素含量为0.4625％，对羟基苯甲醇含量为0.1142％)基本一致，在无需天麻素和对羟基苯甲醇对照品的情况下，CRAFT可以用于检测天麻中主要成分的含量。
文中特征在于使用了DMSO-d6为溶剂，间苯三酚为内标，溶剂和内标不干扰样品峰，运用CPMGT2技术对谱图进行简化，CPMGT2谱图测试温度为25℃，采集次数为4次，扫描时间短；CRAFT技术定性和定量分析消除了由于基线和相位校正的积分误差的影响，不需要对照品和对照试验。
与现有技术相比，本发明所述方法是先测试天麻的1HNMR指纹图谱，通过CPMG技术对其进行简化，利用CRAFT技术对天麻CPMGT2图谱进行定性和定量分析。本发明样品的制备方法简单，溶剂峰和内标峰不干扰样品峰；CPMGT2扫描时间短；CRAFT对天麻中天麻素和对羟基苯甲醇定性和定量分析快速简便，重现性好，精密度高。该方法是核磁CPMGT2技术和 CRAFT技术的有机结合，快速有效的实现了对天麻中天麻素和对羟基苯甲醇定性和定量分析，且不需要对照品和对照试验，消除了由于相位校正，基线校正的积分误差，达到了发明目的。
发明人进行了大量的实验，具体如下：
实验例一、
步骤1、供试品、对照品和内标溶液的制备
取贵州凤凰山天麻A1708.02g，蒸50～60min蒸透后切成薄片，烘干后得156.20g，粉碎过三号筛(50目)，取A1粉末2.00g，加入50％稀乙醇50mL超声(150w，40KHz)30min，静置，用水系微孔滤膜经注射器挤压过滤，取滤液回收溶剂，在50℃烘箱中挥干，得232.5mg总提物浸膏。准确称取A120.2mg，以0.6mL DMSO-d6溶解于核磁管中，得供试品TM-A1溶液。
称取10.3mg天麻素(TMS)和5.3mg对羟基苯甲醇(O-TM)标准品，以2mL DMSO-d6溶解，即得含量为5.15mg/mL TMS标准品溶液和2.65mg/mL O-TM标准品溶液。
准确称取20.8mg间苯三酚(C6H6O3·2H2O)标准品，以2.0mL DMSO-d6溶解制得含量为10.4mg/mL的间苯三酚标准溶液，以作为核磁共振定量的内标。
步骤2、1H-NMR指纹图谱的测定及谱图的优化
滴加20μL间苯三酚溶液到天麻供试品TM-A1溶液中，测定其1H-NMR指纹图谱。天麻的主要化学成分是酚类化合物及其甙等，大多为小分子化合物，但由于天麻中含有天麻多糖等大分子化合物，可看出在1H-NMR谱4.0～5.5ppm之间信号重叠严重，为提高谱图辨识度，运用CPMG技术对谱图进行了优化(图1)。
1H-NMR测试条件：测定温度T＝25.0℃；谱宽sw＝4422.33Hz；观察道偏执tof＝- 211.1Hz；增益gain＝20；延迟时间d1＝10s；采样次数nt＝4，线性加宽因子lb＝1Hz；脉冲宽度pw＝12.8μs；采集时间at＝2.561s。
CPMGT2测试条件：测定温度T＝25.0℃；谱宽sw＝4422.33Hz；观察道偏执tof＝- 211.1Hz；增益gain＝20；延迟时间d1＝10s；采样次数nt＝4，线性加宽因子lb＝1Hz；采集时间at＝2.561s；脉冲宽度pw＝12.8μs；自旋回波循环时间tau＝0.001s，自旋回波循环总时间分别为bigtau＝0.1s。
实验中，当自旋回波循环总时间bigtau＝0.001s时，CPMGT2谱图与1H-NMR谱图一致，随着bigtau逐渐增大，大分子信号逐渐衰减，当bigtau＝0.1s(即100ms)时，大分子信号滤干净了而小分子信号仍在，从而优化了谱图，提高了天麻混合物中指标性成分天麻素和对羟基苯甲醇特征峰信号的信噪比。
本发明所使用的仪器和材料：长沙宏卫-LK系列手提式粉碎机；上海爱朗OSB-2100 型旋水浴锅、N-1100型旋转蒸发仪；巩义SHZ-D型循环水式真空泵；成都一科WGLL-230BE型电热鼓风干燥箱；梅特勒-托利多AL104型电子天平；上海科导SK7200型超声波清洗仪器；美国Varian INOVA400MHz核磁共振波谱仪；样品预处理所用的有机溶剂均为工业级，使用前重蒸处理；核磁共振用氘代试剂均为美国剑桥同位素实验室产品。内标：间苯三酚(湖南湘中精细化学品，分析纯)。
步骤3、天麻素和对羟基苯甲醇的CRAFT定性分析
将TM-A1-1溶液的CPMGT2谱图进行CRAFT分析，CRAFT的工作流程(图2)是运用两步法分析采集得到的FID信号，第一步是通过数字滤波和下采样的方式将采集到的FID数据分解成多个子FID信号，第二步是导入特征化合物特征峰的指纹表，通过贝叶斯解卷积 (Bayesian Deconvolution)提取混合物中特征化合物信号的频率，振幅和线宽，指纹表要求只含有化合物的化学位移信息和CRAFT的线宽，是化合物的独特的化学位移表，不必包含谱图所有峰，具有专有性。将TMS和O-TM的指纹表导入CRAFT分析报告提取谱图的相对的频率振幅表，结果见表1。
表1天麻中TMS和O-TM的频率振幅表
从表中数据可以看出，振幅之比等于对应的质子数之比，且裂分的d峰的振幅值约为1:1，根据振幅和频率确定了混合物中化合物的特征峰的归属(图3)。本发明还考察了 CRAFT定性分析方法的重复性，选取同一批天麻样品，制备5份天麻总提物和内标物间苯三酚的混合样品，测定其1H-NMR和CPMGT2谱图，进行分析方法的精密度的测定。利用CRAFT中cluster程序将测得的一组5支CPMGT2谱图叠加，然后进行CRAFT计算，对样品中天麻素、对羟基苯甲醇的特征峰进行5次CRAFT分析提取其振幅A值，求其平均值。天麻素的特征峰H-2 (H-6)、H-3(H-5)和H-7对应的振幅值比为：1.12:1:1.03，对羟基苯甲醇特征峰H-2(H-6)、H- 3(H-5)和H-7对应的振幅值比为：1.01:1:0.97，振幅比等于对应的质子数之比，从而鉴定了天麻总提物中的天麻素和对羟基苯甲醇。
步骤四：滴定和STOCSY技术的应用
滴定：以TMS、O-TM对照品溶液为参照物，分别滴不同体积的对照品溶液到TM-A1-1 溶液中，分别测定其CPMGT2谱。滴定结果(图4)显示出，随着天麻素和对羟基苯甲醇的浓度的增加，天麻提取物TM-A1中天麻素和对羟基苯甲醇苯环上两组质子的dd峰峰面积增大，从而直观归属了天麻中天麻素和对羟基苯甲醇特征峰。
STOCSY：STOCSY即统计全相关谱，是运用统计分析的方法计算一维谱图数据，得到核磁峰数据中化合物的相关性，同一化合物的不同基团之间具有高度相关性。文中运用 STOCSY找到化合物体系中基团与基团之间的相关性，进一步归属了特征化合物特征峰的信号，进行核磁谱峰的解析。
在核磁管中分别装入100μL TMS和O-TM对照品溶液，加入0.4mL DMSO-d6稀释制成含TMS 0.858mg/mL、O-TM 0.442mg/mL的混合对照品溶液，测定其CPMGT2谱图，并采用 MestReNova程序处理，同滴定的核磁图谱，经定标、相位调整、基线校正后进行图谱叠加，积分区间为0～10ppm，积分宽度为0.003ppm，对每个积分区域进行分段积分后总面积归一化处理，数据导入Excel中，进行后续STOCSY分析。
利用软件MATLAB，以空白未滴定TM-A1-1溶液的CPMGT2图谱为1，以TMS与O-TM混合对照品溶液的CPMGT2图谱为参考并选择其中的一个特征化学位移值为参考(具体数值为 Excel中数据)，从而找到天麻中TMS和O-TM的相关性。测定结果见图5。
通过MATLAB软件对混合物中化合物进行相关性分析，右侧一栏颜色由蓝色－红色，数值由-1－1，颜色越红，数值越大，代表相关性越好。通过STOCSY分析可知，因为TM-A1- 1的CPMGT2谱图将混合物中大分子的信号滤干净了，使得在天麻总提物中无天麻素中的β- D-吡喃葡萄糖部分的相关信息；对羟基苯甲醇上δ9.212处的酚羟基信号在混合物体系中消失不见而没有相关性；天麻素和对羟基苯甲醇中苯环上的两组质子与Ar-CH2-OH中的亚甲基质子的相关性很好，从而准确的归属了天麻中TMS和O-TM的特征峰。STOCSY的应用为中药材中特征化合物的识别提供了一种新的识别方法，也使得天麻素和对羟基苯甲醇CRAFT定性分析结果更具有说服力。
步骤五：天麻样品的CRAFT定量分析
取TM-A1-1测试CPMGT2谱图，以间苯三酚为内标，用2015版药典绝对定量公式计算待测组分的重量(国家药典委员会,2015)：
Ws＝Wr×(As/Ar)×(Es/Er)
式中：Wr为内标物的重量，As和Ar分别为供试品特征峰和内标峰的振幅值，Es和Er 分别为供试品和内标物的质子当量重量(以分子量除以特征峰的质子数计算得到)，根据Ws 和称样量计算组分在样品中的含量。
(1)定量峰的确认
取天麻样品TM-A1-1的CPMGT2谱图(图6A)，与混合对照品CPMGT2图谱比较(图6C)，天麻素H-7的d峰和对羟基苯甲醇H-7'的d峰在混合物中为孤立的单峰，选择H-74.40(s,2H) (图6B中1号峰)为天麻素定量峰；对羟基苯甲醇的定量峰为4.34(s,2H,H-7')(图6B中2号峰)；内标信号峰为H-2,4,6(5.64,s,3H)(图6B中IS)。
(2)线性关系
准确称取40.4mg天麻，以1.0mL DMSO-d6超声加热溶解后转移至2.0mL容量瓶中定容，配制成5个不同浓度比的天麻提取物和内标物间苯三酚混合待测样品，振荡摇匀后测定其1H-NMR和CPMGT2谱图。对每个样品中天麻素、对羟基苯甲醇和间苯三酚的定量峰进行5次 CRAFT计算提取其振幅值，求其平均值，结果见表2。
表2天麻素、对羟基苯甲醇与间苯三酚的质量比及振幅比
分别以天麻素、对羟基苯甲醇与间苯三酚定量峰的振幅比(y，As/Ar)对天麻与间苯三酚的质量比(x，Ws/Wr)进行线性回归，天麻素的线性方程为y＝0.3822x，r＝1；对羟基苯甲醇的线性方程为y＝0.8707x+1E-16，r＝1。天麻素理论计算线性曲线的斜率为0.3776，对羟基苯甲醇理论计算线性曲线的斜率为0.8707，两者基本一致，可用绝对定量模式测定天麻中天麻素和对羟基苯甲醇的含量。
(3)重复性实验与定量结果
选取同一批天麻样品，制备5份天麻总提物和内标物间苯三酚的混合样品，测定其 CPMGT2谱图，进行精密度的测定。对样品中天麻素、对羟基苯甲醇和间苯三酚的定量峰进行 5次CRAFT分析提取其振幅A值，求其平均值。测得天麻素的含量为0.4608％，RSD值为 3.45％；对羟基苯甲醇的含量为0.1132％，RSD为1.02％。详见表3。
表3方法精密度测定结果
结果显示：CRAFT-NMR是分析混合物中化合物的一种新方法。运用CRAFT技术对天麻总提物进行定性分析，结果表明化合物特征峰的振幅比等于其对应的质子数之比，为混合物中化合物特征峰的归属提供了一个新的识别方法；CRAFT分析方法对天麻总提物中天麻素和对羟基苯甲醇的含量测定线性关系良好，精密度较高，其定量分析实验结果(天麻素含量为0.4608％，对羟基苯甲醇含量为0.1132％)与HPLC定量分析结果(天麻素含量为 0.4625％，对羟基苯甲醇含量为0.1142％)基本一致，在无需天麻素和对羟基苯甲醇对照品的情况下，CRAFT可以用于检测天麻中主要成分的含量。
步骤6：天麻HPLC定量分析
①供试品的制备
取天麻总提物浸膏28.9mg，以乙腈-水(3:97)混合溶液溶解，转移至10mL容量瓶中，以乙腈-水(3:97)混合溶液稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
②标准品的制备
取天麻素对照品3.4mg和对羟基苯甲醇对照品1.6mg，用乙腈-水(3:97)混合溶液溶解，转移至2mL容量瓶中定容，过滤即得。
③色谱条件
色谱柱syncronis C18(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：以0.1％磷酸水为A相，甲醇为 B相，洗脱梯度：0～10min 97％A，10～20min 97％～95％A，20～25min 95％～80％A，25～ 45min 80％～75％A。检测波长：220nm；流速1mL·min-1；柱温：30℃，进样量均为10μL。
天麻素和对羟基苯甲醇混合对照品和天麻样品的HPLC色谱图见图7。
④标准曲线的制备
分别精密吸取天麻素对照品溶液(0.3452μg/μL)1，2，3，5，7μL进样，记录色谱图，以峰面积A(y)和对照品量C(x，μg/μL)为横坐标，计算回归方程为：y＝2419.8x-2.1885，r＝1；同法计算对羟基苯甲醇(0.1571μg/μL)的线性回归方程为：y＝4130.5x+18.077，r＝1。结果表明天麻素在0.3452～2.2064μg范围内线性关系良好，对羟基苯甲醇在0.1571～1.0997 μg范围内线性良好。
⑤重复性实验及精密度测定
按供试品溶液制备方法处理同一批样品各5份，分别精密吸取10μL进样，记录峰面积，计算得TM-A1中天麻素的平均含量为0.4625％，RSD为0.15％；对羟基苯甲醇的平均含量为0.1142％，RSD为1.83％。
实验结果证实：CRAFT分析方法对天麻总提物中天麻素和对羟基苯甲醇的含量测定线性关系良好，精密度较高，其定量分析实验结果(天麻素含量为0.4608％，对羟基苯甲醇含量为0.1132％)与HPLC定量分析结果(天麻素含量为0.4625％，对羟基苯甲醇含量为 0.1142％)基本一致。表明在无需天麻素和对羟基苯甲醇对照品的情况下，CRAFT可以用于检测天麻中主要成分的含量，简单快速，且消除了由于相位校正和基线校正的积分误差的影响。
附图说明：
图1为TM-A1滴加了20μL间苯三酚溶液的TM-A1-1的1H-NMR谱和CPMGT2谱图
图2为CRAFT流程图
图3为天麻中特征化合物苯环上特征峰CRAFT分离模型
图4为天麻TMS和O-TM滴定TM-A1-1的CPMGT2叠加图谱
图5天麻、天麻素和对羟基苯甲醇混合对照品的STOCSY分析图
图6为天麻样品和混合对照品的CPMGT2谱图
(A)样品TM-A1-1的CPMGT2谱图；(B)(A)图中δ4.1-7.5区间段放大图；(C)天麻素，对羟基苯甲醇混合物CPMGT2谱图δ4.1-7.5区间段放大图。
图7为TM-A1和混合对照品HPLC图
具体实施方式
实施例1：
步骤一：供试品、对照品和内标溶液的制备
取天麻A1708.02g，蒸50～60min蒸透后切成薄片，烘干后得156.20g，粉碎过三号筛(50目)，取A1粉末2g，加入50％稀乙醇50mL超声(150w，40KHz)30min，静置，用水系微孔滤膜经注射器挤压过滤，取滤液回收溶剂，在50℃烘箱中挥干，得232.5mg总提物浸膏。准确称取A120.2mg，以0.6mL DMSO-d6溶解于核磁管中，得供试品TM-A1溶液。
称取10.3mg天麻素(TMS)和5.3mg对羟基苯甲醇(O-TM)标准品，以2mL DMSO-d6溶解，即得含量为5.15mg/mL TMS标准品溶液和2.65mg/mL O-TM标准品溶液。
准确称取20.8mg间苯三酚(C6H6O3·2H2O)标准品，以2.0mL DMSO-d6溶解制得含量为10.4mg/mL的间苯三酚标准溶液，以作为定量核磁共振的内标。
步骤二：1HNMR指纹图谱的测定及优化
采用Varian 400MHz核磁共振波谱仪，测试天麻供试品溶液的1HNMR指纹图谱，测定温度为25.0℃，增益为20，延迟时间10s，采样次数为4次，线性加宽因子为1Hz，得天麻1HNMR谱图；运用CPMG技术优化图谱，测定温度为25.0℃，增益为20，延迟时间10s，采样次数为4次，线性加宽因子为1Hz，自旋回波循环时间tau为0.001s，自旋回波循环总时间bigtau 依次为0.001s、0.01、0.025s、0.03s、0.05s、0.1s；当bigtau＝0.1s时，大分子信号滤干净了而小分子信号仍在，从而优化了谱图；
步骤三：CRAFT定性分析
导入天麻CPMGT2谱图，进入CRAFT分析软件，对天麻素和对羟基苯甲醇特征峰进行下采样，下采样因素为32，线展宽为1，CRAFT最大线宽为20，执行CRAFT计算，导入天麻素和对羟基苯甲醇指纹表，提取频率振幅表，所得频率F、振幅A和CRAFT模型用于定性分析，特征峰频率F所对应的振幅A之比等于其质子数之比，从而鉴定了天麻中天麻素和对羟基苯甲醇；
步骤四：CRAFT定量分析
线性关系考察：制备5个不同浓度比的天麻提取物和内标物间苯三酚混合待测样品，振荡摇匀后测定其CPMGT2谱图，对每个样品中天麻素、对羟基苯甲醇和间苯三酚的定量峰进行5次CRAFT计算提取其振幅值，求其平均值，分别以天麻素、对羟基苯甲醇与间苯三酚定量峰的振幅比(y，As/Ar)对天麻总提取物与间苯三酚的质量比(x，Ws/Wr)进行线性回归。
精密度考察和定量分析：选取同一批天麻样品，制备5份天麻总提物和内标物间苯三酚的混合样品，测定其CPMGT2谱图，进行精密度的测定。对样品中天麻素、对羟基苯甲醇和间苯三酚的定量峰进行5次CRAFT分析提取其振幅A值，求其平均值，计算天麻中天麻素和对羟基苯甲醇的含量。