一种肉眼可辨的水胺硫磷快速比色检测方法与流程

本发明属于农产品中有机磷农药残留检测领域，尤其涉及在水相缓冲液体系中，运用比色法测定检测体系在450 nm处的特征吸收峰变化，并通过肉眼判定水胺硫磷农药的检测方法。

背景技术：

水胺硫磷是一种速效广谱的有机磷农药，对蛛形纲中的螨类、昆虫纲中的鳞翅目、同翅目昆虫具有很好的防治作用。但水胺硫磷属于高毒农药，能通过食道、皮肤和呼吸道引起中毒。相关法律中《农药管理条例》第二十七条和《农药管理条例实施办法》第二十九条都明文规定剧毒、高毒农药不得用于防治卫生害虫，不得用于瓜类、蔬菜、果树、茶叶、中草药材等，水胺硫磷已经被列为禁用农药。然而近年来水胺硫磷引起的食品安全问题如海南毒豆角事件，说明其依然被滥用，引发各界对食品安全的高度重视。因此，有必要采取措施有效监测农产品中水胺硫磷含量。

目前有机磷农药的检测方法主要有仪器分析方法、酶抑制法、免疫分析法、生物传感器法、化学发光技术、比色法等。仪器分析方法主要包括气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、离子色谱法及色谱-质谱联用等，仪器分析方法不足之处在于所需仪器设备价格昂贵，需要有专业人员操作，不适合在现场快速检测。酶抑制法的不足之处在于其敏感度和可重复性有待提高，灵敏度不如仪器法。免疫分析法的不足之处在于易产生假阳性。生物传感器法的不足之处在于目前许多生物传感器技术的稳定性不高，导致实践中存在使用寿命较短等问题。化学发光技术的不足之处在于只能检测一种有机磷，无法做到检测出有机磷农药的总量。传统的比色法包括目视比色法和光电比色法，其中目视比色法常用的是标准系列法，但缺陷在于眼睛观察存在主观误差，准确度比较低；光电比色法相比于目视比色法虽然消除了主观误差，提高了准确度，但不足之处在于光电比色计无论在测量的准确度、灵敏度和应用范围上都不如紫外-可见分光光度计。近年来采用的酶抑制法比色检测有机磷农药，其灵敏度有待进一步的提高，且成本较高。因此，需要研究一种更加灵敏、稳定、低成本且肉眼可辨的快速比色检测有机磷农药的方法。

技术实现要素：

本发明目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种肉眼可辨的水胺硫磷比色检测方法，具有肉眼可辨、灵敏度高、特异性强、操作便捷，检测快速等优势，可广泛应用于农产品中水胺硫磷残留的快速检测。

本发明的技术方案为：一种肉眼可辨的水胺硫磷快速比色检测方法，包括以下步骤：

(1) 将随机ssDNA序列与Hemin混匀孵育，制备出待测样液；

(2) 将待测样液与含有水胺硫磷的样品混匀孵育，之后加入NaH₂PO₄缓冲液混匀，最后再加入H₂O₂和TMB混合液混匀，通过测定混合溶液在450 nm处的吸光值变化来判定水胺硫磷的含量。

上述步骤(1)中，随机ssDNA序列的使用浓度为20 nM，其碱基组成和序列长度没有特殊要求，Hemin的使用浓度为14 μM。

上述步骤(2)中，H₂O₂的使用浓度为40 mM，TMB的使用浓度为0.1 mM。

所述的肉眼可辨的水胺硫磷快速比色检测方法，具体检测步骤：

(1) 制备已知水胺硫磷浓度的检测体系：取11支刻度离心管，分别加入随机ssDNA序列母液和 Hemin母液，充分混匀后置于30℃条件下孵育，之后加入水胺硫磷标准液，使得整个检测体系中的水胺硫磷含量维持在2-100 ppb，充分混匀后继续孵育，再加入NaH₂PO₄缓冲液，最后再加入H₂O₂和TMB混合液至500 μL，充分混匀后留作以下测定用；

(2) 另取1支按步骤(1)方法制备的检测溶液，加入2.5 μL三蒸水替代水胺硫磷标准液，处理后作为空白对照体系溶液；

(3) 分别取200 μL步骤(1)和步骤(2)制备的标准溶液和空白对照液置于96孔酶标板中，用酶标仪进行扫描测定450 nm处吸收峰。全波长扫描范围为300-800 nm，获得其吸收光谱；

(4) 以不同浓度的水胺硫磷与测定的⊿A作图，绘制标准曲线；

(5) 制备样品检测体系：取2.5 μL实际样液，按步骤(1)方法制备的检测溶液，充分混匀后按步骤(3)方法测定其吸收峰值；

(6) 根据样品在NaH₂PO₄缓冲液体系中测得的吸光度值，查标准曲线，可以求得不同样品中水胺硫磷的含量。

⊿A为待测样品的吸光值-空白样品的吸光值。

本发明的基本原理是：NaH₂PO₄缓冲液中随机ssDNA序列先与Hemin孵育一定时间后，其可以覆盖在Hemin表面，暂时抑制后者催化氧化TMB的活性，使底物分子中N原子失去一个电子，导致体系颜色发生显著变化，由原先的无色变成浅蓝色或蓝色，此时产物的特征吸收峰为370 nm和650 nm。如果在上述体系中加入水胺硫磷共同作用一定时间后，则hemin的催化活性大大增强，使得底物TMB失去两个电子，变成二亚胺结构，此时体系由蓝色变成黄色，在450 nm处出现特征吸收峰，且450 nm处吸光值变化幅度与水胺硫磷的浓度成正比，因而该方法可以用于水胺硫磷检测。

本发明提供的检测方法不需要依赖大型仪器设备，检测灵敏度高，选择性好，且操作简单快速，肉眼可辨，可以广泛应用于农产品等中有机磷农药残留的快速检测。

本方法对水胺硫磷最低检测限为0.38 ppb，具有检测特异性好、肉眼可辨、操作简便等优点，不需要依赖大型仪器就可以实现水胺硫磷农药残留的快速检测，可以广泛应用于农产品中有机磷农药检测。

附图说明

图1. 随机ssDNA存在下水胺硫磷引起的颜色变化和吸光度变化；1: Hemin+H₂O₂+TMB；2: Hemin+50 ppb水胺硫磷+H₂O₂+TMB；

3: ssDNA+Hemin+H₂O₂+TMB；4: ssDNA+Hemin+50 ppb水胺硫磷+H₂O₂+TMB；5: 50 ppb水胺硫磷+H₂O₂+TMB；6: H₂O₂+TMB；

图2. 随机ssDNA存在下不同浓度水胺硫磷与吸光值变化(⊿A)的对应关系；

图3. 其它有机磷农药对检测水胺硫磷的影响；

图4. 应用于实际样品中水胺硫磷的检测。

具体实施方式

实施方式一：

(1) 在NaH₂PO₄缓冲液体系制备已知水胺硫磷浓度的检测体系：取11支1.5 mL刻度离心管，分别加入5 μL浓度为2 μM随机ssDNA序列母液和3.5 μL浓度为2 mM 的Hemin母液。随机ssDNA序列组成为： 5’-AAGCTTGCTTTATAGCCTGCAGCGATTCTTGATCGGAA AAGGCTGAGAGCTACGC-3’(55-mer)。上述溶液充分混匀后置于30℃条件下孵育30 min，之后加入不同浓度的水胺硫磷标准液(总体积≤5 μL)，使得整个检测体系中的水胺硫磷含量维持在2-100 ppb，充分混匀后继续孵育30 min。再加入一定体积20 mM 的NaH₂PO₄缓冲液，最后再加入10 μL的2 M H₂O₂和10 μL的5 mM TMB混合液至500 μL，充分混匀后留作以下测定用。

(2) 另取1支按步骤(1)方法制备的检测溶液，加入2.5 μL三蒸水替代水胺硫磷标准液，处理后作为空白对照体系溶液。

(3) 分别取200 μL步骤(1)和步骤(2)制备的标准溶液和空白对照液置于96孔酶标板中，用酶标仪进行扫描测定450 nm处吸收峰。全波长扫描范围为300-800 nm，获得其吸收光谱。

(4) 以不同浓度的水胺硫磷与测定的⊿A(450 nm)作图，绘制标准曲线，得到线性范围2-40 ppb，其对应的回归方程为y=0.02399+0.06037 C，其中C指水胺硫磷浓度(ppb)。

(5) 制备样品检测体系：取2.5 μL实际样液(分别命名为废水-1、废水-2和西红柿汁)，按步骤(1)方法制备的检测溶液，充分混匀后按步骤(3)方法测定其吸光度变化。

(6) 根据样品在NaH₂PO₄缓冲液体系中测得的吸光度值，查标准曲线，可以求得不同样品中水胺硫磷的含量。

(7) 实际样本检测效果验证：用本发明方法测定3份不同地点取得的废水-1、废水-2和西红柿汁，往样品中加入50 ppb的水胺硫磷，得到的回收率为110.8%-116.8%，证明本方法可靠性。

(8) 本发明方法可以测定浓度范围为2-100 ppb的水胺硫磷，其最低检测限为0.38 ppb。