一种检测海洋生物体内塑料含量的方法与流程

本发明涉及一种生物体内物质含量的检测方法，特别是一种检测海洋生物体内塑料含量的方法。

背景技术：

塑料及其制品在工业、农业及日常生活中被广泛应用，全球每年使用塑料不少于2.4亿吨。环境中的塑料残体可以通过风力、河流、洋流等外力进行远距离迁移，污染地球上的偏远角落。从已有报道发现，目前在北大西洋和太平洋表面以及深海均存在着较高程度的塑料碎片污染；同时也有研究表明，中国南海海岸带地区塑料碎片的污染也非常普遍。这些碎片由于受到太阳辐射(光降解、脆化)或波浪等作用，直径往往小于1 cm甚至更低, 并且在长期的物理、化学作用下会分解成更为微小型的塑料碎片或颗粒，当其直径小于5mm时即可定义为微塑料。传统的微塑料鉴定可通过目测或者显微镜辅助下的观测实现。这主要依据它们的透明性、颜色、形状、硬度等特征进行鉴别并分类，但这些鉴定方法主观性较强，容易造成误判。一些破坏性的方法比如通过样品燃烧现象或者有机溶剂溶解后的信息来判定聚合物的组成也被广泛应用。例如，Fries等人运用裂解气相色谱/质谱法同时鉴定微塑料及其中添加剂的类型，该种方法具有用量小、直接进样、可定性定量等优点，但具有破坏性，实验条件控制要求高。热分析如差示扫描量热法等由于对不同的塑料具有很高的区分率、样品用量少、且对共混物的鉴别具有很大的优越性，也被用于微塑料的鉴定，但费时且要完全破坏样品。相比较破坏性的鉴定方法，原位非破坏性的方法在微塑料研究方面更受到关注，这主要是由于微塑料提取的样品量往往较少，非破坏性的分析鉴定方法可以满足在较少样品量的情况下进行多途径分析，得到不同的参数。目前运用较为普遍的是傅立叶变换红外光谱、拉曼光谱等进行微塑料成分的鉴定，傅立叶变换红外光谱不受样品大小、形状等影响，且样本量小，但易受塑料老化的影响，拉曼光谱不仅可以获得表面官能团信息，还能观察其局部微观形貌，但获得的仅仅是微塑料表面的信息。在微塑料的形貌及表面元素鉴定方面，还可以采用扫描电子显微镜-能谱分析等方法。这些方法其准确性还有待进一步提高。

技术实现要素：

本发明是为了解决现有技术所存在的上述不足，提出一种能够快速、准确测量海洋生物体内微塑料数量的方法。

本发明的技术解决方案是：一种检测海洋生物体内塑料含量的方法，其特征在于：首先取被测海洋生物的肌肉组织或从食道到肛门括约肌之间的消化道组织，称重后记录生物组织质量，并将其在烘箱中于60℃条件下恒温烘干，将烘干至恒重后的生物组织在石英研钵中破碎，破碎后保证其粒径范围是5-10mm，称取粉碎后的生物组织5-10g样品加入500ml的玻璃烧杯中，加入25-50ml浓度为65%的浓硝酸，于电热板上煮沸消解30min，加热温度的范围是90-100℃，在加热的过程中逐滴向烧杯中加入浓度为30%的双氧水，直至获得透明溶液，然后利用浓度为10%的NaOH溶液调节透明溶液的pH值至中性，获得消解液。

将上述消解液利用等密度区带离心法处理，分离出不同密度的微塑料，具体操作步骤如下：首先在离心管中预先放置梯度介质密度为1.36g/cm³的蔗糖溶液，然后将消解液放在梯度介质的液面上，或者预先将消解液与密度为1.36g/cm³的梯度介质混合后放入离心管中，将上述的离心管放入离心机中，在转速4000转/min 的条件下离心处理10-15min，形成不同密度梯度溶液层，不同密度的微塑料可以实现分离，

从离心处理后的离心管中定量获取离心液，并在荧光显微镜下镜检、分离出能够发出荧光的微塑料，进行计数，在全自动傅里叶变换红外光谱显微镜下镜检、分离出不能发出荧光的微塑料，进行计数；可以获得不同密度微塑料的数量，

将上述两次计数结果相加，除以初始的生物组织质量，获得单位质量内海洋生物体内的塑料含量，

结果计算：

生物体内微塑料浓度=（（n₁+n₂）×V））/m

n₁：荧光显微镜下统计的微塑料数量（个）

n₂：傅里叶变换红外光谱显微镜下统计的微塑料的数量（个）

V：消解后获得的消解液的体积（ml）

m：消解称取的生物组织的重量（g）。

本发明同现有技术相比，具有如下优点：

本发明所公开的方法，可以在海洋生物的样品中，快速、准确地检测出是否含有微塑料，并可以直接得出单位质量的海洋生物体内含有的微塑料的量，该方法可以通过微波消解将生物体进行消解、液化，能够排除部分样品本身残留物的影响，使实验检测更为准确，并且该试验方法操作简便、实验仪器药品易制备、实用性强，特别适合于用于科研单位生物体内塑料含量的实验研究。

附图说明

图1为微塑料的红外谱图。

图2为海洋生物体内微塑料的照片。

图3显微镜下的微塑料图。

具体实施方式

下面将结合附图说明本发明的具体实施方式：如图1至图3所示：一种检测海洋生物体内塑料含量的方法，按照以下步骤进行操作：首先取被测海洋生物的肌肉组织，或取北侧海洋生物的从食道到肛门括约肌之间的消化道组织，称重后记录生物组织质量，并将其在烘箱中60℃条件下恒温烘干，将烘干至恒重后的生物组织在石英研钵中破碎，破碎后保证其粒径范围是5-10mm。称取粉碎后的生物组织5-10g样品加入500ml的玻璃烧杯中，加入25-50ml浓硝酸（浓度为65%硝酸），于电热板上煮沸消解30min，加热温度的范围是90-100℃，在加热的过程中逐滴向烧杯中浓度为30%的双氧水，直至获得透明溶液。然后利用浓度为10%的NaOH溶液调节透明溶液的pH值至中性，获得消解液。

将上述消解液利用等密度区带离心法处理，分离出不同密度的微塑料，具体操作步骤如下：首先在离心管中预先放置梯度介质密度为（1.36g/cm³）的蔗糖溶液，然后将消解液放在梯度介质的液面上，或者预先将消解液与梯度介质（1.36g/cm³）混合后放入离心管中，将上述的离心管放入离心机中，在转速4000转/min 的条件下离心处理10-15min，形成不同密度梯度溶液层，不同密度的微塑料可以实现分离。

从离心处理后的离心管中定量获取离心液，并在荧光显微镜下镜检、分离出能够发出荧光的微塑料，进行计数，在全自动傅里叶变换红外光谱显微镜下镜检、分离出不能发出荧光的微塑料，进行计数；可以获得不同密度微塑料的数量。

将上述两次计数结果相加，除以初始的生物组织质量，获得单位质量内海洋生物体内的塑料含量。

结果计算：

生物体内微塑料浓度=（（n₁+n₂）×V））/m

n₁：荧光显微镜下统计的微塑料数量（个）

n₂：傅里叶变换红外光谱显微镜下统计的微塑料的数量（个）

V：消解后获得的消解液的体积（ml）

m：消解称取的生物组织的重量（g）。