用于诊断上皮源性癌症的血液标志物及单克隆抗体的制作方法

文档序号:12061556阅读:310来源:国知局
用于诊断上皮源性癌症的血液标志物及单克隆抗体的制作方法与工艺
本申请是2010年9月9日提交的发明名称为“用于诊断上皮源性癌症的血液标志物及单克隆抗体”的中国专利申请201080068841.6(PCT/CN2010/001387)的分案申请。
技术领域
本发明涉及癌症的诊断,更具体地说,本发明涉及细胞角蛋白片段作为诊断上皮源性癌症的标志物的用途。
背景技术
:对于癌症患者的成功治疗而言最重要的因素之一是早期检测。随着基因分析及蛋白质组学的发展,在鉴定可用于诊断及预测特定癌症的分子标记方面已取得了显著的进步。上皮源性癌症是指起于上皮细胞的癌症,包括但不限于乳腺癌、胃癌、口腔癌、食管癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌和皮肤癌、前列腺癌、肾癌等。例如,胃癌是世界上第二大癌症死因,是威胁人类健康最常见的恶性肿瘤之一。胃癌患者预后的关键是作好二级预防,即早期发现和早期治疗。胃癌的早期及时准确检出和治疗,对于降低胃癌死亡率具有十分重要的意义。肺癌是一种常见的肺部恶性肿瘤,近年来,随着吸烟和各种环境因素的影响,世界各国特别是工业发达国家,肺癌的发病率和病死率均迅速上升。研发具有高度特异性和敏感性的血清肿瘤标记物对肺癌早期的发现及治疗具有很重要的意义。分子诊断是诊断癌症最流行的方法。不同类型的分子如DNA、蛋白质和脂肪被用作诊断工具。肿瘤标记物(TumorMarkers,TM),是指在肿瘤发生和增殖过程中,由肿瘤细胞所产生或分泌并释放到血液、细胞、体液中,反映肿瘤存在和生长的一类物质。肿瘤标记物通常是蛋白质,已经广泛应用于多种类型癌症的检测和诊断。肿瘤标记物浓度水平上升,可能表明了一种癌症在人体内的某种形式的存在。肿瘤标记物在临床上主要用于对原发肿瘤的发现、肿瘤高危人群的筛选、良性和恶性肿瘤的鉴别诊断、肿瘤发展程度的判断、肿瘤治疗效果的观察和评价以及肿瘤复发和预后的预测等。肿瘤标记物常用免疫法测定,如间接法、双抗体夹心法、竞争法。检测手段有胶体金法、酶联免疫法、化学发光法、电化学发光法等。血清学检测的目的在于测定病人血清中与癌症相关的肿瘤标记物的含量。此方法简单易行,适用于大量人群的普查。例如,目前国际上普遍应用的与胃癌相关的肿瘤标记物包括CEA,TPS以及CA72-4等。细胞角蛋白(Cytokeratins)包括20多种不同蛋白,是细胞骨架的重要成分。尽管所有上皮源的细胞均表达一定水平的细胞角蛋白,但是某些角蛋白的组分例如角蛋白8、18以及19与恶性肿瘤的发生与进展密切相关(M.Nap,Th.VanWel,C.Andres,etal.ImmunohistochemicalProfilesof30MonoclonalAntibodiesagainstCytokeratins8,18and19[J].TumorBiology2001;22:4-10)。细胞角蛋白18(Cytokeratin18)是一分子量为55kD的酸性蛋白质,由430个氨基酸组成,具有高度保守的α螺旋结构中心区域,呈丝状结构。广泛分布于正常组织表面如复层上皮和鳞状上皮,以及单层上皮细胞如腺泡、气管、乳腺导管、汗腺、子宫内膜、结肠和肝细胞等。在正常上皮细胞中细胞角蛋白18表达相对稳定,细胞角蛋白18及其片段在外周血、骨髓、淋巴结中无表达或低表达,几乎没有片段产生释放入血。相反的是,当上皮细胞恶性转化时,细胞角蛋白18表达急剧增高。同时,细胞角蛋白18生长进程发生异常。在肿瘤细胞凋亡和坏死过程中激活的蛋白酶加速了细胞的降解,使得大量可溶性的细胞角蛋白18片段被释放,造成组织液、体液中可溶性的细胞角蛋白18片段的浓度升高,尤其在胃癌患者血循环中含量丰富(StigL,AleksandraMH,TakayukiU,etal.Determiningtumorapoptosisandnecrosisinpatientserumusingcytokeratin18asabiomarker[J].CancerLetters214(2004):1-9;T.Stigbrand.TheVersatilityofCytokeratinsasTumorMarkers[J].TumorBiology2001;22:1-3)。细胞角蛋白19是一分子量为40kD的酸性蛋白质,是角蛋白家族中最小的成员,由400个氨基酸组成,具有高度保守的α螺旋结构中心区域,呈丝状结构。广泛分布于正常组织表面如复层上皮和鳞状上皮,以及单层上皮细胞如腺泡、气管、乳腺导管、汗腺、子宫内膜、结肠和肝细胞等。在正常上皮细胞中细胞角蛋白19表达相对稳定,细胞角蛋白19及其片段在外周血、骨髓、淋巴结中无表达或低表达,几乎没有片段产生释放入血循环系统。相反的是,当上皮细胞恶性转化时,细胞角蛋白19表达急剧增高。同时,细胞角蛋白19生长进程发生异常。在肿瘤细胞凋亡和坏死过程中激活的蛋白酶加速了细胞的降解,使得大量可溶性的细胞角蛋白19片段被释放,造成组织液、体液中可溶性的细胞角蛋白19片段的浓度升高,尤其在肺癌患者血循环中含量丰富(J.Niklinski,T.Burzykowski,W.Niklinska,etal.PreoperativeCYFRA21-1levelasaprognosticindicatorinresectednonsmallcelllungcancer[J].EurRespirJ1998;12:1424–1428)。技术实现要素:本发明一方面提供了与上皮源性癌症有关的细胞角蛋白片段,其中该片段包含选自由SEQIDNOs:2、3、5和6构成的组的抗原表位。在一个具体实施方式中,该片段包含SEQIDNO:1的氨基酸残基200-400。在另一个具体实施方式中,该片段包含SEQIDNO:2的氨基酸残基325-400。本发明另一方面提供了与所述抗原表位特异性结合的单克隆抗体。在一个具体实施方式中,该单克隆抗体由保藏号为CGMCCNo.1957、CGMCCNo.1956、CGMCCNo.1955或CGMCCNo.1952的杂交瘤产生。本发明还提供了所述单克隆抗体的抗原结合部分,其中该抗原结合部分与所述单克隆抗体竞争结合所述抗原表位。在一个具体实施方式中,该抗原结合部分为人源化抗体。在另一个具体实施方式中,该抗原结合部分为嵌合抗体。本发明一方面提供了用于对受试者中的上皮源性癌症进行早期筛查、诊断或预后评估的方法,该方法包括:获得来自受试者的生物样品,检测该生物样品中本发明的细胞角蛋白片段的含量,和将该含量与阈值水平进行比较。如果该含量超过阈值水平则说明该患者可能患有癌症。在一个优选实施方式中,该方法还涉及与其他上皮源性肿瘤标记物联用。具体而言,该方法包括:获得来自受试者的生物样品,检测该生物样品中本发明的细胞角蛋白片段的含量,检测该生物样品中其他上皮源性肿瘤标记物的含量,和将所述细胞角蛋白片段以及所述其他上皮源性肿瘤标记物的含量与阈值水平进行比较。优选地,所述其他上皮源性肿瘤标记物选自由AFP、CEA、CA242、CA19-9、CA72-4、CA125、CA15-3、NSE、SCCA、Cyfra21-1、PSA、freePSA构成的组。本发明另一方面提供了评估用于治疗上皮源性癌症的药物或疗法的治疗效果的方法,包括:向患有上皮源性癌症的受试者施用所述药物或疗法,在施用所述药物或疗法之前和之后采集所述受试者的生物样品,和检测所述生物样品中本发明的细胞角蛋白片段的含量,其中在施用所述药物或疗法之前和之后该细胞角蛋白片段含量明显降低的,表明所述药物或疗法有明显疗效。优选地,所述上皮源性癌症选自由胃癌、肝癌、肺癌、胆囊癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、肾癌、食道癌、肠癌、膀胱癌构成的组。优选地,所述生物样品选自由血液、血清、组织液、尿液、大便、痰液、脑脊液、唾液、眼泪和乳头吸出液构成的组。本发明另一方面提供了一种试剂盒,包含:固定于固相载体上的能够特异结合本发明的细胞角蛋白片段的包被抗体,以及被可检测地标记的能够特异结合该细胞角蛋白片段的检测抗体。该试剂盒可以用于实施本发明的方法,也可用于检测本发明的细胞角蛋白片段。本发明还提供了所述细胞角蛋白片段的特异结合剂,例如本发明的单克隆抗体或者抗原结合片段,在制备用于诊断上皮源性癌症的试剂中的用途。附图说明图1是一幅流程图,简要描述了细胞角蛋白18片段制备和活性分析的步骤。图2是一幅电泳图,显示了细胞角蛋白18片段cDNA的电泳结果。图3显示了TOPO质粒的结构。其中,Ampicillin是指氨苄青霉素,Neomycin是指新霉素。图4是一幅电泳图,显示了重组表达质粒TOPO-GY10、TOPO-GY11、TOPO-GY12的酶切鉴定结果。其中,marker是指标志物。图5是一幅电泳图,显示了重组细胞角蛋白18片段GY10、GY11、GY12的SDS-PAGE结果。图6显示了最佳抗体配对实验的结果。图7是一幅示意图,显示了单克隆抗体3A9、2A6的结合表位的位置。图8显示了单克隆抗体3A9及2A6与其他人血清肿瘤标记物的免疫检测结果。图9显示了胃癌与非胃癌诊断的ROC曲线。其中,specificity是指特异性,sensitivity是指灵敏度。图10是一幅流程图,简要描述了细胞角蛋白19片段制备和活性分析的步骤。图11是一幅电泳图,显示了细胞角蛋白19片段cDNA的电泳结果。图12显示了TOPO质粒的结构。其中,Ampicillin是指氨苄青霉素,Neomycin是指新霉素。图13是一幅电泳图,显示了重组表达质粒TOPO-GY20、TOPO-GY21、TOPO-GY22的酶切鉴定结果。其中,marker是指标志物。图14是一幅电泳图,显示了重组细胞角蛋白19片段GY20、GY21、GY22的SDS-PAGE结果。图15显示了最佳抗体配对实验的结果。图16是一幅示意图,显示了单克隆抗体2G2、5H2的结合表位的位置。图17显示了单克隆抗体2G2、5H2与其他人血清肿瘤标记物的免疫检测结果。图18显示了肺癌与非肺癌鉴别诊断ROC曲线。其中,specificity是指特异性,sensitivity是指灵敏度。相关序列的描述SEQIDNO:1显示了细胞角蛋白18(简称K18)的全长氨基酸序列,长度为430个氨基酸残基。SEQIDNO:2显示了单克隆抗体3A9识别的K18抗原表位的氨基酸序列,长度为51个氨基酸残基,对应于SEQIDNO:1的氨基酸位置200~250。SEQIDNO:3显示了单克隆抗体2A6识别的K18抗原表位的氨基酸序列,长度为51个氨基酸残基,对应于SEQIDNO:1的氨基酸位置350~400。SEQIDNO:4显示了细胞角蛋白19(简称K19)的全长氨基酸序列,长度为400个氨基酸残基。SEQIDNO:5显示了单克隆抗体2G2识别的K19抗原表位的氨基酸序列,长度为26个氨基酸残基,对应于SEQIDNO:4的氨基酸位置375~400。SEQIDNO:6显示了单克隆抗体5H2识别的K19抗原表位的氨基酸序列,长度为26个氨基酸残基,对应于SEQIDNO:4的氨基酸位置325~350。具体实施方式本发明提供了细胞角蛋白18(K18)的两个上皮源性癌症相关表位。两个癌相关表位均位于细胞角蛋白18氨基酸序列的C端,其序列如SEQIDNOs:2、3所示。所述表位在恶性转化期间,特别是在胃,结肠,乳腺,卵巢,肾脏等组织的恶性转化期间变得暴露。所述癌相关表位的暴露,是通过肿瘤细胞的不断增殖、坏死、凋亡而将细胞角蛋白18片段释放于血液中而暴露的。而正常组织和健康人员血液中没有这两个癌相关表位的表达。本发明提供了分别识别这两个癌相关表位的两株单克隆抗体3A9和2A6,并应用这两株单抗发明了诊断癌症的方法。用于生产K18单抗3A9和2A6的杂交瘤于2007年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(,中国北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所),保藏编号分别为CGMCCNO.1957(小鼠-小鼠杂交瘤,Mouse-Mousehybridoma)和1956(小鼠-小鼠杂交瘤,Mouse-Mousehybridoma)。保藏证明中的信息通过援引并入本文,作为本发明原始公开内容的一部分。本发明还提供了细胞角蛋白19的两个上皮源性癌症相关表位。其序列如SEQIDNOs:5、6所示。本发明提供了分别识别这两个癌相关表位的两株单克隆抗体2G2和5H2,并应用这两株单抗发明了诊断癌症的方法。用于生产K19单抗2G2和5H2的杂交瘤于2007年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC,中国北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所),保藏编号分别为CGMCCNO.1955(小鼠-小鼠杂交瘤,Mouse-Mousehybridoma)和1952(小鼠-小鼠杂交瘤,Mouse-Mousehybridoma)。保藏证明中的信息通过援引并入本文,作为本发明原始公开内容的一部分。本发明一方面提供了与上皮源性癌症有关的细胞角蛋白片段,其中该片段包含选自由SEQIDNOs:2、3、5和6构成的组的抗原表位。本文所用的术语“上皮源性癌症”是指起于上皮细胞的癌症,包括但不限于乳腺癌、基底细胞癌、腺癌、胃肠癌、唇癌、口腔癌、食管癌、小肠癌和胃癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌和皮肤癌例如鳞状细胞和基底细胞癌、前列腺癌、肾细胞癌及其它已知通过身体影响上皮细胞的癌症。本文所用的术语“片段”是指与天然的全长蛋白相比,缺少一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。例如,蛋白片段可以通过从全长蛋白中删除部分残基而获得,例如N段截短片段可以通过将位于蛋白N段的部分氨基酸残基删除而获得。蛋白片段中也可以含有外源序列,从而形成嵌合蛋白片段。例如,将蛋白A的N端结构域删除后,与蛋白B的N端结构域连接,可以形成蛋白A和蛋白B的嵌合片段。本领域技术人员可以理解,该嵌合片段的长度有可能超过蛋白A的长度。为了便于纯化,可以在蛋白片段中添加常用的纯化标签,例如GST(谷胱甘肽巯基转移酶)、His-tag(六聚组氨酸)等。本发明的细胞角蛋白片段可以含有抗原表位附近的一段连续的氨基酸序列。例如,本发明的K18片段可以包含SEQIDNO:1中涵盖SEQIDNO:2或3所示抗原表位的至少60、70、80、90、100、120、150、180、200、210、220、250、280、300、320、350、380、400或420个连续的氨基酸残基。例如,在本发明一个实施方式中,K18片段包含SEQIDNO:1的氨基酸残基1-250,涵盖单抗3A9识别的抗原表位;在另一个实施方式中,K18片段包含SEQIDNO:1的氨基酸残基250-430,涵盖单抗2A6识别的抗原表位;在又一个实施方式中,K18片段包含SEQIDNO:1的氨基酸残基150-430,同时涵盖两个抗原表位。可以将包含K18的一个或两个抗原表位的片段与K19的抗原表位融合在一起,形成嵌合片段。本发明的K19片段可以包含SEQIDNO:4中涵盖SEQIDNO:5或6所示抗原表位的至少30、50、60、70、80、90、100、120、150、180、200、210、220、250、280、300、320、350或380个连续的氨基酸残基。例如,在本发明一个实施方式中,K19片段包含SEQIDNO:4的氨基酸残基1-375,涵盖单抗5H2识别的抗原表位;在另一个实施方式中,K19片段包含SEQIDNO:1的氨基酸残基150-400,同时涵盖单抗2G2和5H2识别的抗原表位。通过本领域公知的分子克隆实验技术可以容易地制备包含特定氨基酸残基的蛋白片段。本文所用的“生物样品”是指从患者(优选病人)获得的生物材料样品,包括组织样品、细胞样品(例如组织活检样品,例如吸出活检样品、刷拭活检样品、表面活检样品、针吸活检样品、钻取活检样品、切除活检样品、开胸腹活检样品、切开式活检样品或内窥镜活检样品)和肿瘤样品。生物样品也可为生物流体样品。在一个优选实施方案中,生物样品为血清。然而,也可使用血液、尿液、唾液、脑脊液、乳头吸出液和细胞裂解物上清液等。如本文所述,可通过本领域技术人员所知的任何手段来测量本发明细胞角蛋白片段的水平。在本发明中,一般优选使用抗体或抗体的抗原结合部分来检测生物样品中的细胞角蛋白片段的水平。然而,其它方法也可使用,例如通过分析mRNA转录物来测量细胞角蛋白片段的表达。mRNA水平的评价方法为本领域技术人员所熟知。举例而言,通过RNA印迹法可完成RNA转录物的检测,其中RNA制备物在变性琼脂糖凝胶上进行,并转移至合适支持物上,例如活性纤维素膜、硝酸纤维素膜或玻璃膜或尼龙膜。然后使标记(例如放射性标记)的cDNA或RNA与该制备物杂交,洗涤,并通过例如放射自显影等方法来分析。或者,可在DNA阵列、芯片或微阵列上检测mRNA表达。举例而言,为监测mRNA水平,从待测生物样品中提取mRNA,逆转录,产生荧光-标记的cDNA探针。然后用标记的cDNA探针探测能够与细胞角蛋白片段cDNA杂交的微阵列,扫描载玻片,测量荧光强度。该强度和杂交强度与表达水平相关。也可测量细胞角蛋白片段水平,尤其是当该生物样品为流体样品例如血液或尿液时。在一个实施方案中,通过让生物样品与特异性结合细胞角蛋白片段的单克隆抗体接触,来测量细胞角蛋白片段水平。术语“抗体的抗原结合部分”包括与细胞角蛋白的抗原表位特异性结合(起免疫反应)的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性决定簇,例如含有抗原结合位点的分子。术语“抗体的抗原结合部分”意指包括全抗体,例如任何同种型(IgG、IgA、IgM、IgE等等),也包括抗体片段。可使用常规技术使抗体片段化。因此,该术语包括能够选择性地与某一蛋白反应的抗体分子的蛋白水解片段或重组制备的部分。此等蛋白水解和/或重组片段的非限制性实例包括Fab、F(ab')2、Fab'、Fv、dAbs及含有由多肽接头连接的VL区和VH区的单链抗体(scFv)。所述scFv可共价或非共价连接形成含两个以上结合位点的抗体。因此,“抗体的抗原结合部分”包括多克隆抗体、单克隆抗体或抗体的其它纯化制备物和重组抗体。术语“抗体的抗原结合部分”还指包括人源化抗体、双特异性抗体及含至少一个源自抗体分子的抗原结合决定簇的嵌合分子。术语“人源化抗体”指源自非人抗体(例如鼠)的保持或基本上保持亲本抗体抗原结合特性,但在人中具有较低免疫原性的抗体。人源化抗体的优点是减少或消除了抗体在宿主中的免疫原性,从而增加生物利用度和减少可能的不利免疫反应。可使用CDR移植的方法制备人源化抗体。本文所用的“标记抗体”包括以可检测的方式标记的抗体,包括但不限于酶标记抗体、放射性标记抗体、荧光标记抗体和化学发光标记抗体。也可用可检测标签例如HA、HSV、FLAG或HIS标记抗体。在本发明诊断及预后方法中使用抗体或抗体的抗原结合部分检测细胞角蛋白片段的水平,生物样品中存在的细胞角蛋白片段水平与可检测的标记抗体发射的信号强度相关。在一个优选实施方案中,可通过将抗体与酶连接,来可检测地标记抗体或抗体的抗原结合部分。当该酶与其底物接触时,将与该底物反应,其反应方式能产生可检测化学部分,举例而言,通过分光光度法、荧光测定法或通过视觉手段来检测。可用于可检测地标记本发明抗体的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、尿素酶、过氧化氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。化学发光是另一种可用于检测基于抗体或其抗原结合部分的方法。使用多种其它免疫测定中的任一种也可完成检测。举例而言,通过放射性标记抗体,通过使用放射免疫测定可以检测该抗体。通过使用例如γ计数器或闪烁计数器或通过放射自显影等手段可检测放射性同位素。用荧光化合物标记抗体也是可行的。当荧光标记的抗体暴露于合适波长的光时,由于荧光于是可检测其存在。在最常用荧光标记化合物中有异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白和荧光胺。本发明一方面提供了用于对受试者中的上皮源性癌症进行早期筛查、诊断或预后评估的方法,包括:获得来自受试者的生物样品,检测该生物样品中细胞角蛋白片段的含量,和将该含量与阈值水平进行比较。如果该含量超过阈值水平则说明该患者可能患有癌症或者预后不佳。在一个优选实施方式中,采用本发明提供的单克隆抗体进行检测。例如,可以仅使用一种单抗来检测K18或K19片段;可以组合使用3A9和2A6来检测K18片段;可以组合使用2G2和5H2来检测K19片段;也可以组合使用3A9和2G2来同时检测K18片段和K19片段;或者同时组合使用上述四种单克隆抗体进行检测。可以理解,组合使用几种抗体可能提高诊断的准确性。本文所用的术语“3A9”是指由保藏编号为CGMCCNO.1957的杂交瘤生产的单克隆抗体,可以特异识别K18上的抗原表位。本文所用的术语“2A6”是指由保藏编号为CGMCCNO.1956的杂交瘤生产的单克隆抗体,可以特异识别K18上的抗原表位。本文所用的术语“2G2”是指由保藏编号为CGMCCNO.1955的杂交瘤生产的单克隆抗体,可以特异识别K19上的抗原表位。本文所用的术语“5H2”是指由保藏编号为CGMCCNO.1952的杂交瘤生产的单克隆抗体,可以特异识别K19上的抗原表位。在一个优选实施方式中,该方法还涉及与其他上皮源性肿瘤标记物联用,例如AFP、CEA、CA242、CA19-9、CA72-4、CA125、CA15-3、NSE、SCCA、Cyfra21-1、PSA、freePSA等常用肿瘤标记物。对多个肿瘤标记物进行组合检测对于提高诊断的准确性有帮助。本发明另一方面提供了评估用于治疗上皮源性癌症的药物或疗法的治疗效果的方法,包括:向患有上皮源性癌症的受试者施用所述药物或疗法,在施用所述药物或疗法之前和之后采集所述受试者的生物样品,和检测所述生物样品中本发明的细胞角蛋白片段的含量,其中在施用所述药物或疗法之前和之后该细胞角蛋白片段含量明显降低的,表明所述药物或疗法有明显疗效。本发明也涉及对上皮源性癌症进行检测和预后评价的商用试剂盒。该试剂盒可以是本领域普通技术人员所熟知的任何配置,用于实施一种或多种本文所述的方法。另外,优选用包括于试剂盒中的一种或多种标准品同时实施测试,以便该测试结果可定量或确证。例如,标准品可以是纯化的K18或K19蛋白。试剂盒包括检测细胞角蛋白片段水平的手段,例如选择性结合细胞角蛋白片段的抗体或抗体片段。诊断检测试剂盒优选以标准双抗体结合形式配制,其中一种特异性抗体捕获患者样品中的细胞角蛋白片段,另一种特异性抗体用于检测捕获的细胞角蛋白片段。举例而言,将该捕获抗体(包被抗体)固定于例如测试板或硝酸纤维素膜等固相上。通常用可检测标记例如辣根过氧化物酶或放射性同位素来给第二抗体即检测抗体作标签。在一个优选实施方式中,试剂盒中组合使用3A9和2A6来检测K18片段。在另一个优选实施方式中,试剂盒中组合使用2G2和5H2来检测K19片段。也可以组合使用3A9和2G2来同时检测K18片段和K19片段;或者同时组合使用上述四种单克隆抗体进行检测。可以理解,组合使用几种抗体可能提高诊断的准确性。在其它的实施方案中,检测试剂盒可采用(但不限于)下列技术:竞争性和非竞争性测定、放射免疫测定(RIA)、生物发光和化学发光测定、荧光测定、夹层试验、免疫放射测定、斑点印迹、酶联测定(包括ELISA)、微量滴定板和免疫细胞化学法。对每一试剂盒,测试的范围、灵敏度、准确度、可靠性、特异性和再现性均通过本领域技术人员所熟知的方法来确立。上述检测试剂盒将还提供使用说明书。本发明由下列实施例作进一步说明。提供这些实施例是为了帮助理解本发明,不得解释为对本发明的限制。实施例11.抗角蛋白18及片段的单克隆抗体的制备1.1免疫原——重组细胞角蛋白18片段的制备重组细胞角蛋白18片段GY10为E.coli系BL21(DE3)大肠杆菌表达。1.1.1研制方案见图1。1.1.2细胞角蛋白18片段的cDNA合成通过RT-PCR方法制备编码各种细胞角蛋白18片段的cDNA:a)模板及引物先从一种HELA人癌细胞系中分离得到总RNA。然后根据说明书用反转录试剂盒(Promega)合成cDNA。所获得的cDNA即是PCR的模板。设计三种片段的引物,对各cDNA进行PCR扩增。片段编号及氨基酸序列见表1-1。表1-1重组细胞角蛋白18片段的编号及序列片段编号细胞角蛋白18片段序列GY10aa1~430GY11aa150~430GY12aa180~430b)PCR反应PCR反应溶液组分:cDNA模板:5μl;引物:5’和3’引物各10pmol10×PCR缓冲液:10μl;dNTP:各2.5mM,共4μl;Taq聚合酶(Promega):5U;加入无菌双蒸水至100μl。程序如下:溶液加热至94℃恒温2min,然后循环40次,每个循环设置为:加热94℃30s,52℃1min,72℃3min。程序完成后,反应溶液加热72℃10min。然后获取扩增的DNA片段,用含0.25μg/ml溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶分离,见图2。结果显示条带中包含所需的细胞角蛋白18片段cDNA片段,然后用GeneCleankit(BIO101,Irvine,CA)回收DNA片段。1.1.3构建质粒并筛选用TOPO100expressionCloningKit(Invitrogen,Carlsbad,CA)克隆cDNA片段。(1)将从PCR反应溶液回收的细胞角蛋白18的cDNA与克隆试剂盒提供的TOPO质粒(图3)50ng混合;(2)溶液中加入10×连接酶反应缓冲液(6mMTris-HCl(pH7.5),6mMMgCl,5mMNaCl,7mMβ-巯基乙醇,0.1mMATP,2mMDTT,1mM亚精胺,0.1mg/mlBSA);(3)再加入4UT4DNA连接酶(1μl);(4)用灭菌去离子水调整溶液体积至10μl;(5)将其在14℃温育15h;(6)取2μl加入到50μl感受态E.coli细菌株TOP10F(由TA克隆试剂盒提供,并按照说明书制成感受态,混合物冰浴30min,然后孵育42℃30s,再冰浴5min)(7)配制500μl培养基,含2%(v/v)蛋白胨,0.5%(w/v)酵母膏,0.05%(w/v)NaCl,2.5mMKCl,1mMMgCl和20mM葡萄糖,将(6)加入其中,37℃温育1h,并振摇。(8)在L-肉汤琼脂平板(1%(v/v)蛋白胨,0.5%(w/v)酵母膏,0.5%(w/v)NaCl,0.1%葡萄糖,0.6%(w/v)bacto-agar(Difo,Detroit,MI))涂铺(7),100μg/ml。(9)培养基表面可筛选出抗氨苄的克隆子,用铂丝涂布圈挑出单菌落放入L-肉汤培养基(含氨苄100μg/ml)中37℃培养,过夜,振摇(200rpm)。(10)温育过后,离心收集细菌,用碱法提取DNA质粒。经酶切鉴定,已经得到重组的表达质粒TOPO-GY10、TOPO-GY11、TOPO-GY12,如图4。1.1.4重组蛋白的诱导表达和鉴定编码各种细胞角蛋白18的cDNA已经插入TOPO质粒中,(1)所获质粒转化至E.coli系BL21(DE3),然后在LB培养基中培养至指数增长期,用异丙醇β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达3h。(2)沉淀细胞,用裂解液(8Murea,20mMTris-HCl)重悬,并用超声破碎。(3)后14,000×g离心15min,在Ni柱纯化上清。用PBS溶液透析纯化蛋白,4℃过夜。(4)用BCA试剂(Pierece,Woburn,MA)检测蛋白浓度。1.1.5重组细胞角蛋白18的纯化活化SephadexG-50,利用分子筛层析纯化重组细胞角蛋白18片段。将SephadexG-50溶于100mMTris-HCl缓冲液(pH7.4),在100℃煮沸10分钟,然后用100mMTris-HCl缓冲液(pH7.4)封闭,并在4℃保存。将细菌破碎浓缩液流经2ml凝胶珠,流速为2ml/min。样品通过后,50毫升PBS冲洗,洗脱缓冲液0.1M甘氨酸(pH2.4),0.15MNaCl。洗脱液于紫外OD280nm测值判断洗脱是否完毕。收集有效洗脱液(OD>0.01)置于透析袋用1L的磷酸盐缓冲液(pH7.5)4℃透析,期间更换2次透析缓冲液。将纯化的蛋白质浓缩到约1mg/ml,加入1‰NaN3,4℃保存。用10%的SDS–PAGE检测,并用GDS8000凝胶成像系统扫描分析蛋白纯度。结果如图5,结果显示获得了高纯度的重组细胞角蛋白18片段GY10、GY11、GY12,电泳测定纯度大于95%。用于制备单克隆抗体的免疫原为基因重组全长人细胞角蛋白18,此蛋白由美国UAB大学周铜教授馈赠。1.2免疫流程动物:6~8周龄雌性Balb/c小鼠。初次免疫(第1天):采用1ml抗原蛋白溶液与相同体积的弗氏完全佐剂混匀形成乳化颗粒,每只足底注射100μl。二次免疫(第7天):采用1ml抗原蛋白溶液与相同体积的弗氏不完全佐剂混匀形成乳化颗粒,每只足底注射100μl。强化免疫(第14、21、28天):采用不含佐剂的抗原(1mg/ml),每只足底注射100μl。融合(第31天)。1.3杂交瘤的建立取免疫小鼠的腘窝及腹股沟分离淋巴细胞,将其与NS1骨髓瘤细胞按2:1比例混合,用无血清RPMI1640洗涤2次,加入1ml37℃预热的PEG1500,在37℃轻微混合细胞1分钟,然后在3分钟内缓慢滴加20ml预热至37℃的无血清RPMI1640培养基。离心,将融合细胞悬浮于12%FBSRPMI1640HAT选择培养基。将细胞加入5块96孔细胞培养板中,100μl/孔。1.4ELISA检测筛选阳性克隆在细胞融合后7天,用间接ELISA法进行初次筛选,所有杂交瘤均用三种重组人细胞角蛋白18抗原筛选:(1)全长细胞角蛋白18;(2)N端细胞角蛋白18片段;(3)C端细胞角蛋白18片段。用上述角蛋白18抗原(1μg/ml)包被ELISA板4℃过夜;用PBS洗涤3次,用含3%(w/v)BSA的PBS室温封闭1h。检测时每孔加入100μl细胞培养液上清;37℃温浴30分钟,用PBST洗涤液洗5遍,拍干后加入过氧化物酶结合的羊抗鼠免疫球蛋白(HRP-GAMIg,DAKO公司),37℃温浴30分钟,取出后用PBST洗涤液洗5遍,拍干后先后加入底物液A、B各50μl(底物液A成分为:13.42gNa2HPO4·12H2O、4.2g柠檬酸·H2O和0.3g过氧化氢,用去离子水中调节体积为700ml;显色液B成分为:0.2g四甲基联苯胺、20ml二甲基甲酰胺用去离子水中调节体积为700ml),37℃显色10分钟,加入50μl终止液(2MH2SO4)终止反应,并于酶标仪上检测各孔的OD450值,以OD450值高于2.0以上者视为阳性。单克隆抗体的初筛结果概括为表1-2。所有480孔杂交瘤培养上清经四种抗原检测后,我们鉴定出48个克隆与全长细胞角蛋白18抗原反应很强。其中5个克隆与角蛋白18的N端、C端片段以及无关对照抗原呈阳性反应,这些克隆被视为非特异性克隆;其中18个克隆与N端细胞角蛋白18片段呈阳性反应,定义为N端特异性克隆;其中24个与C端细胞角蛋白18片段呈阳性反应,定义为C端特异性克隆。另外,还有1株克隆与N端及C端抗原反应,其反应特异性未知。这些N端和C端特异性克隆作为候选克隆进行进一步研究。这些克隆通过有限稀释法进行三次亚克隆。表1-2初次筛选鼠抗人角蛋白18单抗结果1.5单克隆抗体的产生及纯化取16周龄的健康Balb/c小鼠,腹腔注射0.5mlpristane。5~7天后,收集克隆化的杂交瘤细胞,离心去上清,加入不含血清的培养基,调节细胞密度至2×105~2×106个/ml,每只小鼠注射0.5ml。7~10天后小鼠腹部增大,开始收集腹水。3000rpm离心15分钟,吸取中间澄清部分的液体,0.45μm的微孔滤膜过滤除菌,分装后-20℃保存。将处理好的腹水用0.02mol/L、pH7.4的PBS(81ml0.2mol/LNa2HPO4,19ml0.2mol/LNaH2PO4,加生理盐水至100ml)5倍稀释,取50ml上样至2mlprotein-A/G层析柱,流速为1ml/min.然后用PBS洗涤亲和层析柱至流出液OD280测值小于0.01。然后使用0.1MGlycine-HCLpH2.4缓冲液洗脱结合在层析柱上的抗体,收集洗脱组分2ml/管,最后将所有OD280大于0.1的洗脱组分混合,再用1/10体积的1MTris-HCLpH8.5溶液中和。最后在PBS溶液中透析过夜,期间更换2次透析液。1.6酶标抗体的制备辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基,加入抗体IgG后该醛基与IgG氨基结合,形成Schiff氏碱。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合,在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了,用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。(1)将5mgHRP溶于0.5ml0.1mol/LNaHCO3溶液中;加0.5ml10mmol/LNaIO4溶液,混匀,盖紧瓶塞,室温避光作用2小时。(2)加0.75ml0.1mol/LNa2CO3混匀。(3)加入0.75ml纯化单抗(15mg/ml),混匀。(4)称取SephadexG25干粉0.3g,加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧,室温作用(避光)3小时或4℃过夜。(5)用少许PBS将交联物全部洗出,收集洗出液,加1/20V体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4溶液,混匀,室温作用30分钟;再加入3/20VNaBH4溶液,混匀,室温作用1小时(或4℃过夜)。(6)将交联物过SephadexG200或Sepharose6B(2.6×50cm)层析纯化,分管收集第一峰。(7)酶结合物质量鉴定:克分子比值测定酶量(mg/ml)=OD403×0.4IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.3)×0.62克分子比值(E/P)=酶量×4/IgG量,一般在1-2之间。酶结合率=酶量×体积/抗体,标记率一般为0.3-0.6,即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上,标记率可大于0.6,0.8,0.9;OD403/OD280等于0.4时,E/P约为1。标记率=OD403/OD280酶活性和抗体活性的测定可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H2O2显色反应测定酶结合物的酶活性,抗体活性及效价、特异性。(8)HRP抗体结合物的保存:加入等量甘油后,小量分装-20℃存放,防止反复冻融;或加入等量60%甘油4℃保存;不宜加NaN3或酚防腐,否则会影响酶活性。必要时冻干保存,以BSA或脱脂牛奶作保护剂。1.7肿瘤相关角蛋白18片段单克隆抗体配对筛选和临床初步验证纯化及酶标抗体经ELISA法确认其抗原反应性后,选取10株具有高度亲和力的进行配对实验,以筛选出与胃癌高度相关的角蛋白18抗体配对。1.7.1交叉配对试验为了获取与胃癌血清角蛋白18具有选择性的单克隆抗体配对,我们选取10份胃癌血清样本及10份正常人血清样本作为测试样本。将10份胃癌血清等量体积混合作为阳性样本,将10份正常人血清等量体积混合作为阴性样本。用1μg/ml的纯化抗体包被96孔板,4℃过夜,然后以含3%BSA的PBS封闭,室温下1h。然后在一套ELISA板中各孔加入50μl的胃癌阳性血清,在另外一套ELISA板中加入正常人阴性对照血清,再各加入50μl的1:1000酶标抗体。37℃温育后洗涤,加入显色底物,避光10分钟,加入终止液,在450nm测量OD值。表1-3概括了5对单克隆抗体的交叉配对实验结果。其中以3A9/2A6-HRP,2A6/3A9-HRP,3H7/3A9-HRP的抗体配对显示出对胃癌血清的强阳性反应,而对正常人血清呈阴性反应。因此,我们确定这些抗体配对所检测的血清角蛋白18与胃癌高度相关。表1-3筛选胃癌相关角蛋白18抗体的交叉实验1.7.2最佳抗体配对临床验证实验从上述交叉抗体配对实验中初选出3对与胃癌角蛋白18高度相关的抗体配对3A9/2A6-HRP,2A6/3A9-HRP,3H7/3A9-HRP,使用ELISA法进行临床验证。用1μg/ml的纯化抗体包被96孔板,4℃过夜,然后以含3%BSA的PBS室温下封闭1h。分别入10份胃癌血清和10份正常人血清各50μl作为检测样本进行检测,然后加入50μl的1:1000酶标抗体。37℃温育后洗涤,加入显色底物,避光10分钟,加入终止液,在450nm测量OD值。将检测数据作散点分布图,初步观察比较诊断灵敏度及特异性,见图6。结果显示,3A9/2A6-HRP检测中,胃癌血清检测值均高于正常人血清检测值,灵敏度及特异性均为100%;2A6/3A9-HRP检测中,1例胃癌血清检测值在正常人血清检测值范围内,灵敏度及特异性较前者低;3H7/3A9-HRP检测中,4例胃癌血清检测值在正常人血清检测值范围内,灵敏度及特异性较前两者低;所以,3A9/2A6-HRP配对对血清的诊断性能最佳。1.8肿瘤相关角蛋白18单克隆抗体的特征性研究1.8.1抗体识别肿瘤相关角蛋白18片段抗原决定簇的确定为了进一步确定3A9及2A6的抗原结合表位,我们制备了一组重组角蛋白18片段,这些片段带有每50个氨基酸片段的缺失,如表1-4所示。采用间接ELISA法测定抗体与这些抗原的结合活性。(1)ELISA微孔板包被1μg/ml各种细胞角蛋白18片段,4℃过夜;(2)用PBS洗涤3次,用含3%(w/v)BSA的PBS封闭,室温,1h;(3)微孔中加入检测抗体(终浓度1μg/ml),温育1h,37℃;(4)用PBS洗涤3次,未结合抗体即被洗去。然后加入连接HRP的抗mouseIgG抗体(μg/ml),温育30min,37℃;(5)用PBS洗涤3次,加入TMB底物,静置10min,然后加入终止液2NH2SO4;在ELISA酶标仪上检测样本孔450nm/650nm光密度。表1-4抗原识别表位的确定结果显示,单抗3A9结合抗原1~5,但是不能结合抗原6(aa250~430),同时与所有C端缺失片段呈阳性反应。因此,单抗3A9的抗原结合表位位于细胞角蛋白18aa200~250的片段内。单抗2A6与所有的N端缺失片段均呈阳性反应,并且与1个N端片段(aa1~400)呈阳性反应,其它3个N端片段均呈阴性反应。因此,单抗2A6结合表位为细胞角蛋白18aa350~400的片段内。单抗3A9和单抗2A6的结合表位如图7所示。1.8.2杂交瘤分泌抗体的类型及亚类鉴定以纯化角蛋白18抗原包被ELISA板。每孔加入各单克隆抗体的细胞上清100μL,37℃温育30min;在TECAN全自动洗板机上用PBST洗涤5次,每次间隔20秒,扣干,加入合适稀释度的HRP-山羊抗小鼠IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体(Serotec公司)酶标二抗,于37℃温育30min;在TECAN全自动洗板机上用PBST洗涤5次,每次间隔20sec,扣干,加入显色液A(H2O2)和B(TMB)各1滴,于37℃显色10min,加入1滴终止液(2MH2SO4);在TECAN酶标仪上测量OD450nm(参比波长为620nm),cutoff值为2倍的阴性均值,OD值大于cutoff值为阳性,OD值小于cutoff值为阴性。结果表明,3A9为IgG2a,2A6为IgG1。1.8.3特异性为了检测单抗3A9及2A6的反应特异性,我们检测其与其它人血清肿瘤标记物的免疫结合强度。首先将K18、K8、K19、CEA、CA724其他人血清肿瘤标记物按1μg/ml包被96孔板,4℃过夜,然后以含3%BSA的PBS室温下封闭1h。检测时每孔加入50μl1:1000稀释的单抗3A9或2A6;37℃温浴30分钟,用PBST洗涤液洗5遍,拍干后加入过氧化物酶结合的羊抗鼠免疫球蛋白(HRP-GAMIg,DAKO公司),37℃温浴30分钟,取出后用PBST洗涤液洗5遍,拍干后先后加入底物液A、B各50μl(底物液A成分为:13.42gNa2HPO4·12H2O、4.2g柠檬酸·H2O和0.3g过氧化氢,用去离子水中调节体积为700ml;显色液B成分为:0.2g四甲基联苯胺、20ml二甲基甲酰胺用去离子水中调节体积为700ml),37℃显色10分钟,加入50μl终止液(2MH2SO4)终止反应,并于酶标仪上检测各孔的OD450值。结果见图8。结果显示,单克隆抗体3A9、2A6与K18呈强阳性反应,与其它肿瘤标记物均呈阴性反应。表明单克隆抗体3A9、2A6为角蛋白18高度特异的单克隆抗体。2角蛋白18-3A9试剂盒的制备细胞角蛋白18-3A9测定试剂盒(化学法发光法)采用固相96孔发光板作为反应载体,通过与胃癌相关的抗角蛋白18的一对单克隆抗体构成双抗体夹心法,使用高敏感的化学发光检测技术对胃癌病人血清中角蛋白18片段进行定量检测。以K18单抗3A9作为包被抗体,以K18单抗2A6作为标记抗体,制备K18试剂盒。试剂盒主要组分为:校准品、包被板、酶结合物、发光液、浓缩洗涤液。标准品为纯化的角蛋白18。包被抗体为K18单抗3A9。标记抗体为K18单抗2A6,以HRP辣根过氧化物酶进行标记,形成抗体-HRP复合物(酶结合物)。包被板是包被单抗3A9经洗涤、封闭、干燥,真空封装而成。K18单抗3A9以柠檬酸缓冲液PH4.8为包被缓冲液,以5μg/mL的包被浓度进行包被。封闭液为0.02MPBS+0.4%酪蛋白+1%BSA+0.5MNaCl+0.2%明胶+10%牛血清+0.05%Tween-20+1‰防腐剂+2.5%蔗糖。标记抗体为2A6-HRP。稀释液为0.02MPBS+1%酪蛋白+1%BSA+1‰氨基比啉+0.05%Tween-20。发光液由将KPL生产的发光液A和发光液B分装而成。浓缩洗涤液为20×PBS洗涤液。3临床验证和应用在临床实验的统计分析过程中,考虑到对治疗(化疗和手术)后处于恢复期的患者血清中K18的含量较治疗前会明显减少,为了排除治疗对试验结果的干扰,在临床1000例样本中选取24例胃癌初诊患者(未经治疗)血清标本检测结果进行分析,结果表明K18试剂盒的灵敏度为62.5%,CA72-4试剂盒的灵敏度为37.50%,详见表1-5。表1-5K18试剂盒与CA72-4试剂盒对初诊胃癌患者诊断评价指标比较在临床实验的统计分析过程中,考虑到试剂盒对炎症等患者诊断的假阳性率是影响诊断结果的重要因素,本试验对150例胃炎患者血清样本进行对比试验,以比较K18试剂盒和CA72-4试剂盒鉴别诊断能力。结果显示,K18试剂盒对炎症患者血清样本诊断假阳性率为5.3%,CA72-4试剂盒对炎症患者血清样本诊断假阳性率为16.7%,K18试剂盒假阳性率低于CA72-4。见表1-6。检测结果表明本试剂盒能将炎症患者血清与胃癌患者血清很好的区分,具有很好的特异性。表1-6炎症患者血清检测结果统计如图9所示,由ROC曲线分析结果可知,角蛋白18-3A9试剂盒对应的ROC曲线下面积(0.743)大于罗氏公司的CA72-4试剂盒对应ROC曲线下所围面积(0.612),角蛋白18-3A9试剂盒诊断胃癌的效果较CA72-4试剂盒好。在中国医学科学院肿瘤医院进行的预实验中,选择癌症患者血清241例,其中肺癌84例,胃癌76例,肠癌81例,阴性对照61例,正常人体检血清61例进行临床验证预实验。结果如表1-7,表明角蛋白18-3A9测定试剂盒(化学发光法)对其它上皮源肿瘤也具有较高的检出率。表1-7K18对各种癌症鉴别诊断结果实施例21抗角蛋白19及片段的单克隆抗体的制备1.1免疫原重组细胞角蛋白19片段GY20为E.coli系BL21(DE3)大肠杆菌表达。通过以下方法研制得到:1.1.1研发方案见图101.1.2细胞角蛋白19片段的cDNA合成通过RT-PCR方法制备编码各种细胞角蛋白19片段的cDNA:a)模板及引物先从一种HELA人癌细胞系中分离得到总RNA。然后根据说明书用反转录试剂盒(Promega)合成cDNA。所获得的cDNA即是PCR的模板。设计三种片段的引物,对各cDNA进行PCR扩增。片段编号及氨基酸序列见表2-1。表2-1重组细胞角蛋白19片段的编号及序列片段编号细胞角蛋白19片段序列GY20aa1~400GY21aa150~400GY22aa200~400b)PCR反应PCR反应溶液组分:cDNA模板:5μl;引物:5’和3’引物各10pmol10×PCR缓冲液:10μl;dNTP:各2.5mM,共4μl;Taq聚合酶(Promega):5U;加入无菌双蒸水至100μl。程序如下:溶液加热至94℃恒温2min,然后循环40次,每个循环设置为:加热94℃30s,52℃1min,72℃3min。程序完成后,反应溶液加热72℃10min。然后获取扩增的DNA片段,用含0.25μg/ml溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶分离,见图11。结果显示条带中包含所需的细胞角蛋白19片段cDNA片段,然后用GeneCleankit(BIO101,Irvine,CA)回收DNA片段。1.1.3构建质粒并筛选用TOPO100expressionCloningKit(Invitrogen,Carlsbad,CA)克隆cDNA片段。(11)将从PCR反应溶液回收的细胞角蛋白19的cDNA与克隆试剂盒提供的TOPO质粒(图12)50ng混合;(12)溶液中加入10×连接酶反应缓冲液(6mMTris-HCl(pH7.5),6mMMgCl,5mMNaCl,7mMβ-巯基乙醇,0.1mMATP,2mMDTT,1mM亚精胺,0.1mg/mlBSA);(13)再加入4UT4DNA连接酶(1μl);(14)用灭菌去离子水调整溶液体积至10μl;(15)将其在14℃温育15h;(16)取2μl加入到50μl感受态E.coli细菌株TOP10F(由TA克隆试剂盒提供,并按照说明书制成感受态,混合物冰浴30min,然后孵育42℃30s,再冰浴5min)(17)配制500μl培养基,含2%(v/v)蛋白胨,0.5%(w/v)酵母膏,0.05%(w/v)NaCl,2.5mMKCl,1mMMgCl和20mM葡萄糖,将(6)加入其中,37℃温育1h,并振摇。(18)在L-肉汤琼脂平板(1%(v/v)蛋白胨,0.5%(w/v)酵母膏,0.5%(w/v)NaCl,0.1%葡萄糖,0.6%(w/v)bacto-agar(Difo,Detroit,MI))涂铺(7),100μg/ml。(19)培养基表面可筛选出抗氨苄的克隆子,用铂丝涂布圈挑出单菌落放入L-肉汤培养基(含氨苄100μg/ml)中37℃培养,过夜,振摇(200rpm)。(20)温育过后,离心收集细菌,用碱法提取DNA质粒。经酶切鉴定,已经得到重组的表达质粒TOPO-GY20、TOPO-GY21、TOPO-GY22,如图13。1.1.4重组蛋白的诱导表达和鉴定编码各种细胞角蛋白19的cDNA已经插入TOPO质粒中,(5)所获质粒转化至E.coli系BL21(DE3),然后在LB培养基中培养至指数增长期,用异丙醇β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达3h。(6)沉淀细胞,用裂解液(8Murea,20mMTris-HCl)重悬,并用超声破碎。(7)后14,000×g离心15min,在Ni柱纯化上清。用PBS溶液透析纯化蛋白,4℃过夜。(8)用BCA试剂(Pierece,Woburn,MA)检测蛋白浓度。1.1.5重组细胞角蛋白19的纯化活化SephadexG-50,利用分子筛层析纯化重组细胞角蛋白19片段。将SephadexG-50溶于100mMTris-HCl缓冲液(pH7.4),在100℃煮沸10分钟,然后用100mMTris-HCl缓冲液(pH7.4)封闭,并在4℃保存。将细菌破碎浓缩液流经2ml凝胶珠,流速为2ml/min。样品通过后,50毫升PBS冲洗,洗脱缓冲液0.1M甘氨酸(pH2.4),0.15MNaCl。洗脱液于紫外OD280nm测值判断洗脱是否完毕。收集有效洗脱液(OD>0.01)置于透析袋用1L的磷酸盐缓冲液(pH7.5)4℃透析,期间更换2次透析缓冲液。将纯化的蛋白质浓缩到约1mg/ml,加入1‰NaN3,4℃保存。用10%的SDS–PAGE检测,并用GDS8000凝胶成像系统扫描分析蛋白纯度。结果如图14,结果显示获得了高纯度的重组细胞角蛋白19片段GY20、GY21、GY22,电泳测定纯度大于95%。用于制备单克隆抗体的免疫原为基因重组全长人细胞角蛋白19,此蛋白由美国UAB大学周铜教授馈赠。1.2免疫程序动物:6~8周龄雌性Balb/c小鼠。初次免疫(第1天):采用1ml抗原蛋白溶液与相同体积的弗氏完全佐剂混匀形成乳化颗粒,每只足底注射100μl。二次免疫(第7天):采用1ml抗原蛋白溶液与相同体积的弗氏不完全佐剂混匀形成乳化颗粒,每只足底注射100μl。强化免疫(第14、21、28天):采用不含佐剂的抗原(1mg/ml),每只足底注射100μl。融合(第31天)。杂交瘤的建立取免疫小鼠的腘窝及腹股沟分离淋巴细胞,将其与NS1骨髓瘤细胞按2:1比例混合,用无血清RPMI1640洗涤2次,加入1ml37℃预热的PEG1500,在37℃轻微混合细胞1分钟,然后在3分钟内缓慢滴加20ml预热至37℃的无血清RPMI1640培养基。离心,将融合细胞悬浮于12%FBSRPMI1640HAT选择培养基。将细胞加入5块96孔细胞培养板中,100μl/孔。1.4ELISA检测筛选阳性克隆在细胞融合后7天,用间接ELISA法进行初次筛选,所有杂交瘤均用三种重组人细胞角蛋白19抗原筛选:(1)全长细胞角蛋白19;(2)N端细胞角蛋白19片段;(3)C端细胞角蛋白19片段。用上述角蛋白19抗原(1μg/ml)包被ELISA板4℃过夜;用PBS洗涤3次,用含3%(w/v)BSA的PBS室温封闭1h。检测时每孔中加入100μl细胞培养液上清;37℃温浴30分钟,用PBST洗涤液洗5遍,拍干后加入过氧化物酶结合的羊抗鼠免疫球蛋白(HRP-GAMIg,DAKO公司),37℃温浴30分钟,取出后用PBST洗涤液洗5遍,拍干后先后加入底物液A、B各50μl(底物液A成分为:13.42gNa2HPO4·12H2O、4.2g柠檬酸·H2O和0.3g过氧化氢,用去离子水中调节体积为700ml;显色液B成分为:0.2g四甲基联苯胺、20ml二甲基甲酰胺用去离子水中调节体积为700ml),37℃显色10分钟,加入50μl终止液(2MH2SO4)终止反应,并于酶标仪上检测各孔的OD450值,以OD450值高于2.0以上者视为阳性。单克隆抗体的初筛结果概括与表2-2。所有480孔杂交瘤培养上清经四种抗原检测后,我们鉴定出39个克隆与全长细胞角蛋白19抗原反应很强。其中,3个克隆与角蛋白19的N端、C端片段以及无关对照抗原呈阳性反应,这些克隆被视为非特异性克隆;其中15个克隆与N端细胞角蛋白19片段呈阳性反应,定义为N端特异性克隆;其中18个与C端细胞角蛋白19片段呈阳性反应,定义为C端特异性克隆。另外,还有3株克隆与N端及C端抗原反应,其反应特异性未知。这些N端和C端特异性克隆作为候选克隆进行进一步研究。这些克隆通过有限稀释法进行三次亚克隆。表2-2初次筛选角蛋白19鼠抗人单抗结果1.5单克隆抗体的产生及纯化取16周龄的健康Balb/c小鼠,腹腔注射0.5mlpristane。5~7天后,收集克隆化的杂交瘤细胞,离心去上清,加入不含血清的培养基,调节细胞密度至2×105~2×106个/ml,每只小鼠注射0.5ml。7~10天后小鼠腹部增大,开始收集腹水。3000rpm离心15分钟,吸取中间澄清部分的液体,0.45μm的微孔滤膜过滤除菌,分装后-20℃保存。将处理好的腹水用0.02mol/L、pH7.4的PBS(81ml0.2mol/LNa2HPO4,19ml0.2mol/LNaH2PO4,加生理盐水至100ml)5倍稀释,取50ml上样至2mlprotein-A/G层析柱,流速为1ml/min.然后用PBS洗涤亲和层析柱至流出液OD280测值小于0.01。使用0.1MGlycine-HCLpH2.4缓冲液洗脱结合在层析柱上的抗体,收集洗脱组分2ml/管,最后将所有OD280大于0.1的洗脱组分混合,然后用1/10体积的1MTris-HCLpH8.5溶液中和。然后在PBS溶液中透析过夜,期间更换2次透析液。1.6酶标抗体的制备辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基,加入抗体IgG后该醛基与IgG氨基结合,形成Schiff氏碱。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合,在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了,用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。(1)将5mgHRP溶于0.5ml0.1mol/LNaHCO3溶液中;加0.5ml10mmol/LNaIO4溶液,混匀,盖紧瓶塞,室温避光作用2小时。(2)加0.75ml0.1mol/LNa2CO3混匀。(3)加入0.75ml纯化单抗(15mg/ml),混匀。(4)称取SephadexG25干粉0.3g,加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧,室温作用(避光)3小时或4℃过夜。(5)用少许PBS将交联物全部洗出,收集洗出液,加1/20V体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4溶液,混匀,室温作用30分钟;再加入3/20VNaBH4溶液,混匀,室温作用1小时(或4℃过夜)。(6)将交联物过SephadexG200或Sepharose6B(2.6×50cm)层析纯化,分管收集第一峰。(7)酶结合物质量鉴定:克分子比值测定酶量(mg/ml)=OD403×0.4IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.3)×0.62克分子比值(E/P)=酶量×4/IgG量,一般在1-2之间。酶结合率=酶量×体积/抗体,标记率一般为0.3-0.6,即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上,标记率可大于0.6,0.8,0.9;OD403/OD280等于0.4时,E/P约为1。标记率=OD403/OD280酶活性和抗体活性的测定可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H2O2显色反应测定酶结合物的酶活性,抗体活性及效价、特异性。(8)HRP抗体结合物的保存:加入等量甘油后,小量分装-20℃存放,防止反复冻融;或加入等量60%甘油4℃保存;不宜加NaN3或酚防腐,否则会影响酶活性。必要时冻干保存,以BSA或脱脂牛奶作保护剂。1.7肿瘤相关角蛋白19片段单克隆抗体配对的筛选纯化及酶标抗体经ELISA法确认其抗原反应性后,选取10株具有高度亲和力的进行配对实验,以筛选出与肺癌高度相关的角蛋白19抗体配对。1.7.1交叉配对试验选择为了获取与肺癌血清角蛋白19具有选择性的单克隆抗体配对,我们选取10份肺癌血清样本及10份正常人血清样本作为测试样本。将10份肺癌血清等量体积混合作为阳性样本,将10份正常人血清等量体积混合作为阴性样本。用1μg/ml的纯化抗体包被96孔板,4℃过夜,然后以含3%BSA的PBS室温下封闭1h。然后一套ELISA板中各孔加入50μl的肺癌阳性血清,在另外一套ELISA板中加入正常人阴性对照血清,再各加入50μl的1:1000酶标抗体。37℃温育后洗涤,加入显色底物,避光10分钟,加入终止液,在450nm测量OD值。表2-3概括了5对单克隆抗体的交叉配对实验结果。其中以2G2/5H2-HRP,5H2/2G2-HRP,5H2/1D11-HRP的抗体配对显示出对肺癌血清的强阳性反应,而对正常人血清呈阴性反应。因此,我们确定这些抗体配对所检测的血清角蛋白19与肺癌高度相关。表2-3筛选肺癌相关角蛋白19抗体的交叉实验1.7.2初步确认最佳抗体配对实验从上述交叉抗体配对实验中初选出3对与肺癌角蛋白19高度相关的抗体配对2G2/5H2-HRP,5H2/2G2-HRP,5H2/1D11-HRP,使用ELISA法进行临床验证。用1μg/ml的纯化抗体包被96孔板,4℃过夜,然后以含3%BSA的PBS室温下封闭1h。分别入10份肺癌血清和10份正常人血清各50μl作为检测样本进行检测,然后加入50μl的1:1000酶标抗体。37℃温育后洗涤,加入显色底物,避光10分钟,加入终止液,在450nm测量OD值。将检测数据作散点分布图,初步观察比较诊断灵敏度及特异性,见图15。结果显示,2G2/5H2-HRP检测中,1例肺癌血清检测值在正常人血清检测值范围内,且其它肺癌血清检测值均较高,以特异性100%计,灵敏度为90%;5H2/2G2-HRP检测中,2例肺癌血清检测值在正常人血清检测值范围内,4例肺癌血清检测值偏低,以特异性100%计,灵敏度为80%;5H2/1D11-HRP检测中,4例肺癌血清检测值在正常人血清检测值范围内,且所有肺癌血清检测值较前两种检测均偏低,以特异性100%计,灵敏度为60%;;所以,2G2/5H2-HRP配对对血清的诊断性能最佳。1.8肿瘤相关角蛋白19单克隆抗体的特征性研究1.8.1肿瘤相关角蛋白19片段抗原决定簇的确定为了进一步确定2G2、5H2的抗原结合表位,我们制备了一组重组角蛋白19片段,这些片段带有每50个氨基酸片段的缺失,如表2-4所示。采用间接ELISA法测定抗体与这些抗原的结合活性。(1)ELISA微孔板包被1μg/ml各种细胞角蛋白19片段,4℃过夜;(2)用PBS洗涤3次,用含3%(w/v)BSA的PBS封闭,室温,1h;(3)微孔中加入检测抗体(终浓度1μg/ml),温育1h,37℃;(4)用PBS洗涤3次,未结合抗体即被洗去。然后加入连接HRP的抗mouseIgG抗体(μg/ml),温育30min,37℃;(5)用PBS洗涤3次,加入TMB底物,静置10min,然后加入终止液2NH2SO4;在ELISA酶标仪上检测样本孔450nm/650nm光密度。表2-4抗原识别表位的确定结果显示,单抗2G2结合抗原1~4,同时与所有C端缺失片段呈阳性反应。因此,单抗2G2的抗原结合表位位于细胞角蛋白19aa375~400的片段内。单抗5H2与所有的N端缺失片段均呈阳性反应,并且与1个N端片段(aa1~375)呈阳性反应,与其它3个N端片段均呈阴性反应。单抗5H2结合表位为细胞角蛋白19aa325~350的片段内。单抗2G2和单抗5H2的结合表位如图16所示:1.8.2杂交瘤分泌抗体的类型及亚类鉴定以纯化角蛋白19抗原包被ELISA板。每孔加入各单克隆抗体的细胞上清100μL,37℃温育30min;在TECAN全自动洗板机上用PBST洗涤5次,每次间隔20秒,扣干,加入合适稀释度的HRP-山羊抗小鼠IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体(Serotec公司)酶标二抗,于37℃温育30min;在TECAN全自动洗板机上用PBST洗涤5次,每次间隔20sec,扣干,加入显色液A(H2O2)和B(TMB)各1滴,于37℃显色10min,加入1滴终止液(2MH2SO4);在TECAN酶标仪上测量OD450nm(参比波长为620nm),cutoff值为2倍的阴性均值,OD值大于cutoff值为阳性,OD值小于cutoff值为阴性。结果表明2G2为IgG2a,5H2为IgG1。1.8.3特异性为了检测单抗2G2及5H2的反应特异性,我们检测其与其它人血清肿瘤标记物的免疫结合强度。首先将K18、K8、K19、CEA、CA724其他人血清肿瘤标记物按1μg/ml包被96孔板,4℃过夜,然后以含3%BSA的PBS室温下封闭1h。检测时每孔加入50μl1:1000稀释的单抗2G2或5H2;37℃温浴30分钟,用PBST洗涤液洗5遍,拍干后加入过氧化物酶结合的羊抗鼠免疫球蛋白(HRP-GAMIg,DAKO公司),37℃温浴30分钟,取出后用PBST洗涤液洗5遍,拍干后先后加入底物液A、B各50μl(底物液A成分为:13.42gNa2HPO4·12H2O、4.2g柠檬酸·H2O和0.3g过氧化氢,用去离子水中调节体积为700ml;显色液B成分为:0.2g四甲基联苯胺、20ml二甲基甲酰胺用去离子水中调节体积为700ml),37℃显色10分钟,加入50μl终止液(2MH2SO4)终止反应,并于酶标仪上检测各孔的OD450值。结果见图17。结果显示,单克隆抗体2G2、5H2与K19呈强阳性反应,与其它肿瘤标记物均呈阴性反应。表明单克隆抗体2G2、5H2为角蛋白19高度特异的单克隆抗体。2角蛋白19-2G2试剂盒的制备角蛋白19-2G2测定试剂盒(化学法发光法)采用固相96孔发光板作为反应载体,通过与肺癌相关的抗角蛋白19的一对单克隆抗体构成双抗体夹心法,使用高敏感的化学发光检测技术对肺癌病人血清中角蛋白19片段进行定量检测。以K19单抗2G2作为包被抗体,以K19单抗5H2作为标记抗体,制备K19试剂盒。试剂盒主要组分为:校准品、包被板、酶结合物、发光液、浓缩洗涤液。标准品为纯化的角蛋白19。包被抗体为K19单抗2G2。标记抗体为K19单抗5H2,以HRP辣根过氧化物酶进行标记,形成抗体-HRP复合物(酶结合物)。包被板是包被单抗2G2,经洗涤、封闭、干燥,真空封装而成。K19单抗2G2以柠檬酸缓冲液PH4.8为包被缓冲液,以5μg/mL的包被浓度进行包被。封闭液为0.02MPBS+0.4%酪蛋白+1%BSA+0.5MNaCl+0.2%明胶+10%牛血清+0.05%Tween-20+1‰防腐剂+2.5%蔗糖。标记抗体为5H2-HRP。稀释液为0.02MPBS+0.4%酪蛋白+1%BSA+0.5MNaCl+1‰氨基比啉+0.2%明胶+10%牛血清+0.05%Tween-20。发光液由将KPL生产的发光液A和发光液B分装而成。浓缩洗涤液为20×PBS洗涤液。3临床验证和应用在临床实验的统计分析过程中,考虑到对治疗(化疗和手术)后处于恢复期的患者,血清中K19的含量较治疗前会明显减少。为了排除治疗对试验结果的干扰,在临床1000例样本中选取69例肺癌初诊患者(未经治疗)血清标本检测结果进行分析,结果表明K19试剂盒的灵敏度为88.4%,CYFRA21-1试剂盒的灵敏度为52.17%,见表2-5。表2-5K19试剂盒与CYFRA21-1试剂盒对初诊肺癌患者诊断评价指标比较在临床实验的统计分析过程中,考虑到试剂盒对炎症等患者诊断的假阳性率是影响诊断结果的重要因素。本试验对150例肺炎患者血清样本进行对比试验,以比较K19试剂盒和CYFRA21-1试剂盒鉴别诊断能力。结果显示K19试剂盒对炎症患者血清样本诊断假阳性率为5.3%,CYFRA21-1试剂盒对炎症患者血清样本诊断假阳性率为12.0%。K19试剂盒假阳性率低于CYFRA21-1试剂盒,见表2-6。检测结果表明本试剂盒能将炎症患者血清与肺癌患者血清很好的区分,具有很好的特异性。表2-6炎症患者血清检测结果统计由图18的ROC曲线分析结果可知,角蛋白19-2G2试剂盒对应的ROC曲线下面积(0.817)大于罗氏公司的CYFRA21-1试剂盒对应ROC曲线下所围面积(0.766),角蛋白19-2G2试剂盒诊断肺癌效果优于CYFRA21-1试剂盒。在中国医学科学院肿瘤医院进行的预实验中,选择癌症患者血清241例,其中肺癌84例,胃癌76例,肠癌81例,阴性对照61例,正常人体检血清61例进行临床验证预实验。结果如表2-7,表明角蛋白19-2G2测定试剂盒(化学发光法)对其它上皮源肿瘤也具有较高的检出率。表2-7K19对各种癌症鉴别诊断结果当前第1页1 2 3 
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