一种基于微分相衬成像还原定量相位图像的方法及系统与流程

本发明涉及相位成像技术领域，具体涉及一种基于微分相衬图像还原定量相位图像的方法及基于LED阵列光源的定量相位还原显微成像系统。

背景技术：

在某些特定领域，如光学测量、材料物理学、自适应光学、X射线衍射光学、电子显微学、生物医学成像等领域，大部分样本都属于相位物体。这类物体的振幅透射率分布均匀，但折射率或厚度的空间分布不均匀，因此相位物体的光波振幅改变甚小，相位改变却非常大。人眼或其他光探测器都只能判断物体的振幅变化而无法判断其相位的变化，因此不能区分相位物体内厚度或折射率不同的各个部分。所以对于这些领域，获取相位信息显得尤为重要。

相衬(Phase Contrast)显微技术作为相位成像技术的里程碑，其基本原理在于将照明的背景光与样品散射光分隔开来，从而展现前景细节，使得相位变化以强度变化的形式呈现出来。但传统相衬显微技术存在相位倒转，晕轮和渐暗效应，样品厚度，盖玻片和载玻片影响等方面的不足。为解决这些问题，在相衬显微技术基础上相继出现了微分干涉对比成(DIC)、微分相衬成像(DPC)等一系列新技术。但这些技术存在操作复杂，成像条件苛刻等缺陷，更为重要的是这些方法无法获取全局定量的相位信息。

定量相位成像通过测量光束的相位延迟来对样品的折射性能进行显像和检测。在光学测量中，由于光波的频率很高，探测器无法直接探测光的相位分布。实际操作中，能够直接测量的数据往往只是波场的强度分布，因此，相位恢复是光学测量与成像技术的一个重要课题，如何从强度测量数据中获取相位信息成为研究中所要解决的技术问题。

技术实现要素：

鉴于上文所述，本发明为解决上述技术问题提出一种定量相位还原显微成像系统及基于微分相衬图像还原定量相位图像的方法。

为此，本发明采用如下技术方案：

一方面本发明提供一种定量相位还原显微成像系统，包括透射式显微镜，其特征在于，所述透射式显微镜光源为LED阵列，所述LED阵列的照明图样通过编程控制，还包括用于校正LED阵列光源位置的多维位移平台，采集显微镜观测结果的照相设备和将采集图像还原为定量相位图像的处理设备。

进一步地，本发明LED阵列是由m×n个发光二极管等间距排列构成的矩形阵列，m，n均为正整数；LED阵列照明图样的点亮采用静态屏模式。

进一步地，本发明还包括控制设备，所述控制器分别与LED阵列光源和照相设备连接以实现采用时分复用模式完成照明图样切换与相机采集频率同步；具体地，所述时分复用模式指单个控制设备可在不同时间段分别完成LED阵列照明图样切换的信号触发以及相机采集信号的触发，这样可节省控制引脚资源，由于触发时间极短，并不应影响图样切换与相机采集的同步。进一步地，本发明处理设备可完成图像数据的导出以及图像数据的计算与处理，最终获取样品的定量相位成像图片；具体地，本发明实施例采用与照相设备匹配的软件完成图像采集的触发与图像的导出，采用MATLAB或VC++等具有相同处理效果的图像处理工具完成图像数据的计算；

本发明所述处理设备的具体处理方法如下：

步骤A：获取样品以任意一个对称轴方向划分的微分相衬成像图片I_DPC；定义第一差分照明光下采集的第一目标图像为I₁，第二差分照明光下的第二目标图像为I₂，则I_DPC的获得方法为：

步骤B：基于弱目标传递函数建立微分相衬成像二维光学相位传递函数H(u),其表达式如下：

H(u)＝i[∫∫S(u′)P*(u′)p(u′+u)d²u′-∫∫s(u′)P*(u′)p(u′-u)d²u′]

其中，S(u′)为光源光强分布函数，P(u′)为光瞳传递函数，u′为光瞳平面上坐标；

步骤C：建立傅里叶域里微分相衬图像与相位信息关系模型如下：

则傅里叶域上还原的定量相位信息为：

对行逆傅里叶变换，最终获得了定量相位信息。

由于上述微分相衬成像结果是以单一对称轴方向获取的微分相衬图像，完全不包含垂直于对称轴上的相位信息；为增强不同方向上相位重构能力，可沿着任意方向采用多轴划分形成非对称照明图样，从而得到包含不同方向相位信息的微分相衬成像图片，再进一步完成含有不同相位信息的微分相衬成像还原为定量相位图片。

基于上文所述，本发明提供多个对称轴划分形成非对称照明图样下获取样品的定量相位成像图片的处理方法，具体如下：

步骤A：获取样品任意两个或多个对称轴方向划分的微分相衬成像图片

定义以第一条对称轴划分照明图样下，采用第一差分照明光采集的第一目标图像为I₁₁，采用第二差分照明光采集的第二目标图像为I₁₂；定义以第j条对称轴进一步划分照明图样下，采用第一差分照明光采集的第一目标图像为I_j1，采用第二差分照明光采集的第二目标图像为I_j2；则微分相衬图像为：

步骤B：基于弱目标传递函数建立微分相衬成像二维光学相位传递函数H(u)，其表达式如下：

H(u)＝i[∫∫s(u′)P^*(u′)p(u′+u)d²u′-∫∫S(u′)P^*(u′)p(u′-u)d²u′]

其中，S(u′)为光源光强分布函数，P(u′)为光瞳传递函数，u′为光瞳平面上坐标；

步骤C：建立傅里叶域里微分相衬图像与相位信息关系模型如下：

将上述方程式联合求解，则基于多轴划分的定量相位信息由如下公式计算：

由于H(u)与轴向沿相交处的频率点是零且参与运算的频率较宽，因此直接反卷积会大幅叠加这些频率上的噪声，所以可以通过正则化最小二乘法解决问题,最终化简定量相位信息表达式如下：其中，α为正则化参数

另一方面本发明提供一种基于微分相衬图像还原定量相位图像的方法，其中对于非对称照明图样的划分是采用单一对称轴根据任意方向进行划分，包括以下步骤：

步骤A：采用编程控制的LED阵列作为光源，基于时分复用模式控制LED阵列光源照明图样的切换与照相设备采集图像的频率同步，其中目标图像是通过非对称照明图样进行采集，所述非对称照明图样是以单一对称轴划分而成；定义第一差分照明光下采集的第一目标图像为I₁，第二差分照明光下的第二目标图像为I₂，则微分相衬图像为；

步骤B：基于弱目标传递函数建立微分相衬成像二维光学相位传递函数H(u)，其表达式如下：

H(u)＝i[∫∫S(u′)P*(u′)p(u′+u)d²u′-∫∫S(u′)P*(u′)p(u′-u)d²u′]

其中，S(u′)为光源光强分布函数，P(u′)为光瞳传递函数，u′为光瞳平面上坐标；

步骤C：建立微分相衬图像的傅里叶图谱能的模型如下：

则傅里叶域上还原的定量相位信息为：

对进行逆傅里叶变换，最终获得定量相位信息。

由于上述微分相衬成像结果是以单一对称轴方向获取的微分相衬图像，完全不包含垂直于对称轴上的相位信息；为增强不同方向上相位重构能力，可沿着任意方向采用多轴划分形成非对称照明图样，从而得到包含不同方向相位信息的微分相衬成像图片，再进一步完成含有不同相位信息的微分相衬成像还原为定量相位图片。

基于上文所述，本发明提供一种基于微分相衬图像还原定量相位图像的方法，其中对于非对称照明图样的划分是采用两个及以上个对称轴根据任意方向进行划分，包括以下步骤：

步骤A：采用编程控制的LED阵列作为光源，基于时分复用模式控制LED阵列光源的照明图样与照相设备采集图像的频率同步，其中目标图像是通过非对称照明图样进行采集，所述非对称照明图样是以两个或多个任意方向的对称轴划分而成；采集目标图像具体按照如下顺序步骤操作：

A1：采用第一条对称轴划分照明图样，定义第一差分照明光下采集的第一目标图像为I₁₁，采集第二差分照明光下所得第二目标图像为I₁₂；

A2：采用第j条对称轴进一步划分照明图样，定义第一差分照明光下采集的第一目标图像为I_j1，第二差分照明光下采集的第二目标图像为I_j2；

A3：重复步骤A2的操作直至达到目标轴数，则每一步骤所得两幅目标图像的微分相衬图像如下：

步骤B：基于弱目标传递函数建立微分相衬成像二维光学相位传递函数H(u)：

H(u)＝i[∫∫S(u′)P^*(u′)p(u′+u)d²u′-∫∫S(u′)P^*(u′)p(u′-u)d²u′]

其中，S(u′)为光源光强分布函数，P(u′)为光瞳传递函数，u′为光瞳平面上坐标；

步骤C：建立傅里叶域里微分相衬图像与相位信息关系模型如下：

将上述方程式联合求解，则基于多轴划分的定量相位信息由如下公式计算：

由于H(u)与轴向沿相交处的频率点是零且参与运算的频率较宽，因此直接反卷积会大幅叠加这些频率上的噪声，所以可以通过正则化最小二乘法解决问题,最终化简定量相位信息表达式如下：其中，α为正则化参数

本发明具有如下有益效果：

本发明公开的系统能够基于微分相衬成像还原定量相位信息，并且本发明建立了稳定的从目标图像到定量还原相位图像的方法，克服了传统定量图像获取操作复杂、成像条件苛刻的缺陷，并且获得的图像分辨率更高；本发明搭建基于LED阵列光源的定量相位还原显微成像系统，采用非对称照明图样同步与照相设备采集获得目标图像，然后采用处理设备进行运算处理，最终获得定量相位信息。本发明通过处理得到微分相衬成像图片，微分相衬成像图片包含了相位的梯度信息，本发明首先建立微分相衬成像二维光学相位传递函数H(u)(具体推导过程如上文所述)，进而建立H(u)、微分相衬图像的频域函数和定量相位信息之间的关系，最终实现通过对微分相衬成像的相位传递函数进行反卷积运算恢复出定量相位信息。本发明不仅局限于采用单个对称轴划分形成非对称照明图样，进一步地，本发明采用沿任意方向的多个对称轴划分形成非对称照明图样，进而获得多个含有不同相位信息的微分相衬成像图片，然后进行联合求解最终还原定量相位信息以达到增强不同方向上相位信息的重构能力。此外，本发明还对基于多轴划分的定量相位信息公式进行优化处理。

附图说明

图1为本发明实施例LED阵列光源显微成像系统的成像原理示意图；

图2为本发明实施例采用LED阵列光源显微成像系统还原定量相位图像的流程图；

图3为本发明实施例基于LED阵列光源显微成像系统的结构示意图；

图4为本发明实施例LED阵列光源的光路校正流程图；

图5为本发明实施例相衬成像照明图样示意图。

具体实施方式

结合以下说明书附图对本发明的具体实施方式进行进一步阐述，此处实施例只用于说明本发明，但不用来限制本发明范围。

如图1所示为LED阵列光源显微成像系统的原理示意图，基于本发明提供的定量相位还原显微成像系统，相干点光源在相机中的强度I(r_c)为：

I(r_c)＝|∫∫[∫∫q(r)o(r)exp(-i2πr·u″)d²r]P(u″)exp(-i2πu″·r_c)d²u″|² (1)

其中，LED阵列光源的照明函数为q(r)，待测样品的透射函数为o(r)，其余光学器件变换函数为P(u″)，r_c为相机焦平面的坐标，u为光瞳面的坐标；

当样品被扩展的非相干光源照明，那么相机的焦平面上的光强分布应该是微分的点光源的非相干叠加图像，上述微分的点光源非相干叠加图像的强度如下：

I(r_c)＝∫∫|∫∫[∫∫q(r)o(r)exp(-i2πr·u″)d²r]P(u″)exp(-i2πu″·r_c)d²u″|²d²u′ (2)

由于本发明中LED阵列作为光源距离显微镜所承载的样本足够远，因此，LED阵列形成的照明图样中每个照明单元均类似于平面波，那么LED阵列光源的照明函数可以表示为下式所示：

其中，S(u′)为LED阵列光源照明图样的光强分布函数，u′为LED阵列光源平面上的坐标；

样品透过函数为本领域常识，μ(r)为强度透过率，φ(r)为相位变化率，近似等价于o(r)≈1-μ(r)+iφ(r)，根据弱对象逼近方法线性简化该问题，忽略交叉项可得如下表达式：

将公式(3)和公式(4)代入公式(2)，并将等式两边进行傅里叶变换，得到光强频域函数可以通过下式表达：

公式(5)中含有三方面的信息：背景，吸收对比和相位对比：

其中，公式(5)中背景项Bδ(u)是通过成像系统的所有能量之和，可表示如下：

B＝∫∫S(u′)|P(u′)|²d²u′ (6)

公式(5)中光强传递函数H_abs(u)可表示如下：

H_abs(u)＝-[∫∫S(u′)P^*(u′)p(u′+u)d²u′+∫∫S(u′)P^*(u′)p(u′-u)d²u′] (7)

公式(5)中相位传递函数H_ph(u)可表示如下：

H_ph(u)＝i[∫∫S(u′)P^*(u′)p(u′+u)d²u′-∫∫S(u′)P^*(u′)p(u′-u)d²u′] (8)

基于上文推导过程，本发明立足于建立微分相衬图像与定量相位信息的等价关系。为了推导出微分相衬成像的特定传递函数，需要利用非对称照明的两幅图像先计算出微分相衬图像；如图2所示为本发明实施例采用基于LED阵列光源的定量相位还原显微成像系统还原定量相位图像的流程图，具体操作如下：

1、搭建基于LED阵列光源照明的显微镜系统；

2、LED阵列光源位置校正；

3、LED阵列光源形成非对称照明图样的设计；

4、微分相衬图像还原定量相位图像；

以下结合说明书附图及实施例进行详细的描述：

步骤1：搭建定量相位还原显微成像系统，包括透射式显微镜，所述透射式显微镜光源为LED阵列，所述LED阵列的照明图样通过编程控制，还包括用于校正LED阵列光源位置的多维位移平台，采集显微镜观测结果的照相设备和将采集图像还原为定量相位图像的处理设备。

进一步地，搭建过程将相机放于显微镜系统前端，采用相机单模式帧频≧24Hz的高速相机，(如图3所示为本发明显微成像系统的结构示意图)并采用控制器连接LED阵列光源和相机，从而实现LED阵列光源的照明图样多模式切换和不同模式时相机采集操作的同步。

在较佳的实施例中，LED阵列放置于多维位移平台上，多维位移平台置于显微镜载物平台上60～70mm。LED阵列光源可采用32×32、16×16、8×8、4×4等任意满足物镜数值孔径NA值的阵列尺寸。

本发明非对称照明图样是以LED阵列中心为圆心的半圆或半环形或者是以LED阵列中心对称的矩形，照明图样为第一照明图样和第二照明图样，所述第一照明图样和所述第二照明图样关于LED阵列的中心对称，且第一照明图样和第二照明图样同时点亮形成以LED阵列中心为中点的圆形、环形或者矩形。

以下以照明图样是以LED阵列中心为圆心的半圆形的实施方式进一步说明LED阵列尺寸选取与物镜的数值孔径的关系：

显微镜物镜的数值孔径表达式如下：

其中，n为介质折射率，本发明中具体实例中n＝1；θ为进入物镜光线的最大角度；R为LED阵列光源所发射光线能进入显微镜物镜的最大半径，D为LED阵列光源与显微镜物镜的间距。

由以下公式可知，LED阵列光源形成照明图样的最小半径R如下式：

若设定选用10×且数值孔径为0.25的显微镜物镜，则实际计算如下：

本发明实施例采用的LED阵列光源任意两个相邻发光二极管中心之间距离为4mm，因此，应选取的阵列尺寸至少为8×8的标准。

根据所选物镜确定发光二极管阵列明场范围大小后，为实现精准成像还需对LED阵列光源的位置校正。

步骤2：LED阵列光源的位置校正；此步骤主要包括将LED阵列光源中心与物镜中心对准、LED阵列光源的水平性校准和LED阵列光源的方向角校准；如图4所示为LED阵列光源位置校准过程的基本操作：

步骤10：需选定合适的目镜和物镜类型，由于需要将LED阵列中心与物镜相位环中心对准，因此需要选择相位型物镜作为显微镜物镜，然后将显微镜的目镜旋转至B口，本实施例采用伯特伦透镜，这样可以就看到傅里叶面即LED阵列面；

步骤11：点亮距离LED阵列中心；本实施点亮以LED阵列光源中心为圆心，半径为两个发光二极管的照明图样以便于中心对准；

步骤12：通过调节多维位移平台，将LED阵列中心与物镜相位环中心对准；

由于微分相衬图像的获取对LED阵列光源水平性与方向性要求的精度较高，肉眼校准达不到要求的准确性，作为优选实施方式，采用机器视觉技术完成校准：

步骤21：在显微镜的侧端口搭建相机；

步骤22：在相机与显微镜侧端口之间放置合适的透镜，并调节其与相机相对位置，根据透镜傅里叶变化特性相机即可成像傅里叶面(及LED阵列面)；

步骤23：通过PC端相机软件测量LED阵列水平性与方向角，通过调整多维位移平台完成水平性与校准。

完成LED阵列光源的位置校正后，为实现微分相衬成像还需对明场区域进一步划分。

步骤3：设计LED阵列光源形成非对称照明图样；

较佳实施例中，LED阵列光源形成照明图样的点亮采用静态屏而非扫描方式，因为静态屏点亮方式能增大通光量。根据微分相衬成像机理，为了获取相位对比图需采用非对称照明图样为本领域常识。较佳实施例中，通常采用以LED阵列中心为圆心的半圆形照明图样，此外，本发明非对称照明图样还可以是以LED阵列中心为圆心的半环形或者是以LED阵列中心对称的矩形。

以单一对称轴为划分方向获取微分相衬成像，照明图样为第一照明图样和第二照明图样，第一照明图和第二照明图样互补，即为：所述第一照明图样1和所述第二照明图样关于LED阵列的中心对称，且第一照明图样和第二照明图样同时点亮形成以LED阵列中心为中点的圆形、环形或者矩形。

如图5所示，本实施照明图样为以LED阵列中心为圆心的半圆形，被以与纸面水平方向夹角为α的单一对称轴划分为区域1和区域2，划分方向并不局限于说明书附图所示，α的取值范围为0°～180°；如图5所示，以任意夹角单一对称轴划分得到微分相衬成像结果为样品α+90°方向上的相衬成像结果。为获得各个方向上的相衬成像结果，采取沿角度α变换划分方式，即可获得沿α+90°方向上的相衬成像结果。

步骤4：微分相衬图像还原定量相位图像的处理；

采用控制器控制LED阵列光源照明图样的切换和相机曝光时间的频率同步，完成在单一对称轴划分形成非对称图样照明下目标图像的采集，定义第一差分照明光下采集的第一目标图像为I₁，第二差分照明光下的第二目标图像为I₂，；然后采用处理设备进行运算处理，具体处理方法如下：

步骤A：获取样品以任意一个对称轴方向划分的微分相衬成像图片I_DPC；定义第一差分照明光下采集的第一目标图像为I₁，第二差分照明光下的第二目标图像为I₂，则I_DPC的获得方法为：

对于一个无像差的系统来说，光瞳函数是一个半径设为目标数值，孔径的圆函数(实对称)。此种情况下，吸收传递函数令可将公式(5)简化为如下表达式，即微分相衬图像的傅里叶频谱与定量相位系关系：

因此，对进行逆傅里叶变换，即可获得样品显微测试的定量相位信息，即通过微分相衬图像的频域函数可以得出样品显微测试的定量相位信息。

如图5，以任意夹角的单一对称轴划分得到微分相衬成像结果为样品α+90°方向上的相衬成像结果。

由于上述微分相衬成像结果是以单一对称轴方向获取的微分相衬图像，完全不包含垂直于对称轴上的相位信息；为增强不同方向上相位重构能力，可沿着任意方向采用多轴划分形成非对称照明图样，从而得到包含不同方向相位信息的微分相衬成像图片，再进一步完成含有不同相位信息的微分相衬成像还原为定量相位图片。进一步地，本发明采用多方向对称轴划分形成非对称照明图样，进而采用处理设备对含有不同相位信息的目标图像进行处理，具体处理方法如下：

步骤A：获取样品任意两个或多个对称轴方向划分的微分相衬成像图片

定义以第一条对称轴划分照明图样下，采用第一差分照明光采集的第一目标图像为I₁₁，采用第二差分照明光采集的第二目标图像为I₁₂；定义以第j条对称轴进一步划分照明图样下，采用第一差分照明光采集的第一目标图像为I_j1，采用第二差分照明光采集的第二目标图像为I_j2；则微分相衬图像为：

步骤B：基于弱目标传递函数建立微分相衬成像二维光学相位传递函数H(u)，其表达式如下：

H(u)＝i[∫∫S(u′)P^*(u′)p(u′+u)d²u′-∫∫S(u′)P^*(u′)p(u′-u)d²u′]

其中，S(u′)为光源光强分布函数，P(u′)为光瞳传递函数，u′为光瞳平面上坐标；

步骤C：建立傅里叶域里微分相衬图像与相位信息关系模型如下：

将上述方程式联合求解，则基于多轴划分的定量相位信息由如下公式计算：

由于H(u)与轴向沿相交处的频率点是零且参与运算的频率较宽，因此直接反卷积会大幅叠加这些频率上的噪声，所以可以通过正则化最小二乘法解决问题,最终化简定量相位信息表达式如下：其中，α为正则化参数

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用与限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改，等同替换和改进等均应包含在本发明的保护范围之内。