本发明属于检测领域，尤其涉及一种肌纤维细胞参数的图像测量方法。
背景技术：
对肌肉纤维的定量分析可用于评价不同的饲养或成长环境对于肌肉的影响，也可用于选种等工作。现有的分析方法基本仍然依赖于人工测量，即通过人来观察显微镜下的肌肉样本，并进行相应的测量，存在着劳动量大、工作效率低、准确性差等问题。有部分文献中使用了图像处理软件来帮助测量，但仍然依赖于人工选择，劳动量和工作效率等方面没有大的改观。
例如在论文《不同图像分析软件定量计算肌纤维类型数量及面积》中，作者使用了imagej、imageproplus和photoshop等图像处理软件，通过人工交互的方式，手工选择肌纤维细胞，然后由图像处理软件计算其面积。虽然利用图像处理软件计算面积提高了测量的准确性，避免了过去由人估算不规则形状的肌纤维细胞的面积时造成的误差，但是测量过程本质上仍然依赖于人工。
在本发明中，我们在制备了猪肉的肌纤维样本之后，采集显微图像，然后通过图像处理算法，编写程序来自动地分割出肌纤维细胞，并在此基础上完成单个细胞的面积、直径等参数的计算，从而实现猪肉肌纤维参数的自动测量，减少测量的工作量，提高测量的准确度。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种肌纤维细胞参数的图像测量方法，本发明通过图像处理的方法，能够自动地完成猪肉肌纤维参数的测量，劳动量小，工作效率高，结果稳定，准确度高，并可避免人工操作中因疲劳或主管判断因素所引入的错误结果。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下所示：
一种肌纤维细胞参数的图像测量方法，包括如下步骤:
(1)获得肌纤维的图像和图像的标尺；
(2)肌纤维参数的图像测量：
(2.1)将拍摄得到的彩色图像i转化为灰度图像g，然后对g进行阈值分割得到二值图像b1；b1中，深色的肌纤维细胞区域为黑色，背景区域为白色；
(2.2)对b1进行连通域标记，然后去除面积小于给定阈值ta1的白色区域；求取白色区域去除之后的二值图像的反色图像，得到b2；
(2.3)对b2进行连通域标记，得到标记图像l1，然后去除l1中的贴边区域，得到标记图像l2；
(2.4)去除l2中面积小于给定阈值ta2或大于给定阈值ta3的区域，得到标记图像l3；
(2.5)对l3中的每个区域，计算其面积与凸包面积之比r，去除l3中r值小于给定阈值tacar的区域，得到标记图像l4；
(2.6)对l4中的每个区域，进行孔洞填充，即得肌纤维区域；
(2.7)根据肌纤维区域计算得到肌纤维细胞参数。
进一步的改进，步骤(2.7)中，所述肌纤维细胞参数包括肌纤维的实际面积，肌纤维的实际面积计算方法如下：
计算肌纤维区域的相对面积即肌纤维区域内的像素点个数ai；根据图像中所给的标尺，计算图像中1像素长度所对应的实际长度s，于是肌纤维的实际面积a＝ai·s2。
进一步的改进，步骤(2.7)中，所述肌纤维细胞参数包括肌纤维的实际直径，肌纤维的实际直径计算方法如下：
提取肌纤维区域的轮廓，计算轮廓上每对相异点之间的距离，以所有相异点对的距离的最大值为肌纤维的直径di，单位为像素；据图像中所给的标尺，计算图像中1像素长度所对应的实际长度s，于是肌纤维的实际直径d＝di·s。
进一步的改进，步骤(2.3)中的贴边区域即若某个肌纤维细胞区域中至少有一个像素点落在了图像的外缘，即图像的最上、最下行、最左列或最右列外的区域，则此肌纤维细胞在图像l1内的区域称作贴边区域。
进一步的改进，所述肌纤维细胞为猪肉纤维细胞。
进一步的改进，步骤(1)中，肌纤维的图像通过相机拍摄多个视野的样本显微图像获得。
进一步的改进，所述样本通过以下步骤制得：
(1.1)固定：用4％的多聚甲醛固定样本24小时；
(1.2)脱水：将洗好后的样品放入为70％、80％、90％、100％、100％的酒精中分别经过过夜、8小时、8小时、1小时、1小时浸泡以脱去样品中的水分；
(1.3)透明：以1:1的二甲苯:无水酒精浸泡1小时，再用二甲苯浸泡1小时，以置换出组织块中的无水酒精；
(1.4)浸蜡和包埋：将透明好的样品放入1:1的二甲苯:石蜡中过渡30分钟，再将其放入装有石蜡的蜡杯中30分钟，需在温箱中将石蜡熔化后进行，温箱温度不得高于56℃，将浸好蜡的组织块放入盛有熔化石蜡的纸盒内，使组织块包埋于石蜡中，迅速放在水盆中，待其冷却后备用；
(1.5)切片：将制好的组织蜡块经修切后粘附于台木后用切片机切成6μm厚的薄片，薄片连续成蜡带状；
(1.6)展片和粘片：将切成的蜡带展于30℃的温水中，再以1:1的鸡蛋清:甘油混合剂为粘附剂，将组织薄片粘附于载玻片上，再将其置于37℃温箱中烘干，不少于24h；
(1.7)脱蜡复水：将水浴锅温度调至60℃，待水温控制在60℃时，将切片连同切片架放入一个干燥的染色缸内，放入水浴锅中，盖上盖子，30min至蜡熔化；
(1.8)石蜡切片经二甲苯ⅰ、ⅱ脱蜡各5min，然后放入100％、95％、90％、80％、70％各级浓度的酒精溶液中各3-5min，再放入蒸馏水中3min；
(1.9)染色：切片放入苏木精中染色15min；
(1.10)水洗：用自来水流水冲洗15min；使切片颜色变蓝；
(1.11)分化：将切片放入1％盐酸乙醇液中褪色，2秒至数十秒钟；见切片变红，颜色较浅即可；
(1.12)漂洗：切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色；
(1.13)脱水ⅰ：切片入50％乙醇→70％乙醇→80％乙醇中各3-5min；
(1.14)复染：用0.5％伊红乙醇液对比染色1min；
(1.15)脱水ⅱ：将切片放入95％乙醇中洗去多余的红色，然后放入无水乙醇中3-5min；最后用吸水纸吸干多余的乙醇；
(1.16)透明：切片放入二甲苯ⅰ、ⅱ中各3-5min；
(1.17)封藏：中性树胶封存。
具体实施方式
实施例
本发明所提方法包括两个主要阶段：猪肉肌肉样本的制备和图像获取阶段，以及图像处理和测量阶段。
(1)样本制备与图像获取
(1.1)固定：用4％的多聚甲醛固定样本24小时。
(1.2)脱水：将洗好后的样品放入为70％、80％、90％、100％(无水酒精)、100％(无水酒精)的酒精中分别经过过夜、8小时、8小时、1小时、1小时浸泡以脱去样品中的水分。
(1.3)透明：以1:1的二甲苯:无水酒精浸泡1小时，再用二甲苯浸泡1小时，以置换出组织块中的无水酒精。
(1.4)浸蜡和包埋：将透明好的样品放入1:1的二甲苯:石蜡中过渡30分钟，再将其放入装有石蜡的蜡杯中30分钟(需在温箱中将石蜡熔化后进行，温箱温度不得高于56℃)。将浸好蜡的组织块放入盛有熔化石蜡的纸盒内，使组织块包埋于石蜡中，迅速放在水盆中，待其冷却后备用。
(1.5)切片：将制好的组织蜡块经修切后粘附于台木后用切片机切成6μm厚的薄片，薄片应该连续成蜡带状。
(1.6)展片和粘片：将切成的蜡带展于30℃的温水中，再以1:1的鸡蛋清:甘油混合剂为粘附剂，将组织薄片粘附于载玻片上，再将其置于37℃温箱中烘干(不少于24h)。
(1.7)脱蜡复水：将水浴锅温度调至60℃，待水温控制在60℃时，将切片连同切片架放入一个干燥的染色缸内，放入水浴锅中，盖上盖子(可密封)，30min至蜡熔化。
(1.8)石蜡切片经二甲苯ⅰ、ⅱ脱蜡各5min，然后放入100％、95％、90％、80％、70％各级浓度的酒精溶液中各3-5min，再放入蒸馏水中3min。
(1.9)染色：切片放入苏木精中染色约15min。
(1.10)水洗：用自来水流水冲洗约15min。使切片颜色变蓝(或放入碱性水中也可)，但要注意流水不能过大，以防切片脱落。
(1.11)分化：将切片放入1％盐酸乙醇液中褪色，约2秒至数十秒钟。见切片变红，颜色较浅即可。
(1.12)漂洗：切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。
(1.13)脱水ⅰ：切片入50％乙醇→70％乙醇→80％乙醇中各3-5min。
(1.14)复染：用0.5％伊红乙醇液对比染色1min。
(1.15)脱水ⅱ：将切片放入95％乙醇中洗去多余的红色，然后放入无水乙醇中3-5min。最后用吸水纸吸干多余的乙醇。
(1.16)透明：切片放入二甲苯ⅰ、ⅱ中各3-5min。
(1.17)封藏：中性树胶封存
(1.18)获取图像：将样本置于显微镜下，通过相机拍摄多个视野的样本显微图像，图像中应加入标尺。
(2)肌纤维参数的图像测量
(2.1)将拍摄得到的彩色图像i转化为灰度图像g，然后对g进行阈值分割得到二值图像b1。b1中，深色的肌纤维细胞区域为黑色，背景区域为白色；
(2.2)对b1进行连通域标记，然后去除面积小于给定阈值ta1的那些白色区域。求取区域去除之后的二值图像的反色图像，得到b2；
(2.3)对b2进行连通域标记，得到标记图像l1，然后去除l1中的贴边区域，即区域中至少有一个像素点落在了图像的外缘(即图像的最上和最下行以及最左和最右列)上，得到标记图像l2；贴边区域即指个别肌纤维细胞不是全部在图像l1的范围内，而是一部分在图像l1内，另一部分在图像l1外，在图像l1内的那部分不完整的肌纤维细胞区域即所说的贴边区域。
(2.4)去除l2中面积小于给定阈值ta2或大于给定阈值ta3的区域，得到标记图像l3；
(2.5)对l3中的每个区域，计算其面积与凸包面积之比r，去除l3中r值小于给定阈值tacar的区域，得到标记图像l4；
(2.6)对l4中的每个区域，对其进行孔洞填充，即得猪肉的肌纤维区域；
(2.7)计算肌纤维区域的面积(即像素点个数)ai；
(2.8)提取肌纤维区域的轮廓，计算轮廓上每对相异点之间的距离，以所有这些点对的距离的最大值为肌纤维的直径(以像素为单位)di；
(2.9)根据图像中所给的标尺，计算图像中1像素长度所对应的实际长度s，于是肌纤维的实际面积为a＝ai·s2，实际直径为d＝di·s。
本发明虽然是针对猪肉的肌纤维参数测量所提，但是如果是其他肉类的肌纤维参数测量，如果这些肉类的肌纤维形态与猪肉的类似，则本发明的方法同样适用，因此应视为本发明所涵盖的范围。
本发明所指的肌纤维参数，主要指肌纤维横断面的面积和直径测量。
如上所述，对本发明的实施实例进行了详细的说明，但只要实质上没有脱离本发明的特点及效果，是可以有很多变形的，这对本领域的技术人员来说是显而易见的，因此，这些变形的实例也全部包含在本发明的保护范围之内。