一种利用鸡胚血管系统检测和评价结膜刺激性及粘膜刺激性的方法与流程

本发明属于结膜刺激性及粘膜刺激性
技术领域：
，具体涉及一种利用鸡胚血管系统检测和评价结膜刺激性及粘膜刺激性的方法。
背景技术：
：随着生活水平的提高，越来越多的人开始使用个人护理和清洁用品，前者如皮肤用和眼用产品，后者如口腔清洁和护理产品。大多数消费者在使用这些产品过程中都非常关心其安全性问题，其中包括使用产品后无意接触眼睛产生的结膜和角膜刺激问题；以及口腔护理品对口腔粘膜和牙龈的刺激；女性护理产品对阴道粘膜的刺激等。因此，个人护理和清洁产品的监管要求必须对产品的健康危害进行检测。同时，在这些产品的研发过程中，粘膜刺激性的检测和评估也贯穿其中。例如对于候选原料(如植物提取物、合成化学品)和配方，通常需要反复测试其眼结膜刺激性和口腔粘膜刺激性，并希望能够精确定量不同配方或产品的刺激程度。此外，对于大量未知毒性特征的化学品，也需要准确了解包括结膜刺激性和粘膜刺激性在内的毒性特点，以用于危险化学品的分类和标识。化学品、个人护理品或其它眼睛接触物质引起的结膜刺激性，主要指的是这些物质有意或无意直接接触眼睛后引起的眼结膜及其周围粘膜的可逆性炎性变化，这些物质如淋洗类化妆品、眼部和面部用化妆品、眼部药物、喷酒类农药、空气清新剂、空气颗粒物和漂浮物、pm2.5等。消费者通常希望购买的产品是符合产品安全标准要求的，而且更加希望产品无任何刺激性的或者是温和的，能够适用于皮肤敏感、婴幼儿等特殊人群。个人护理和清洁用品引起口腔粘膜的刺激性，主要指的是用于牙齿、口腔、口唇等部位的产品，接触到口腔粘膜后引起的粘膜、口唇、牙龈及其周围组织的可逆性炎性变化，这些物质包括牙膏、漱口水、牙贴膜、牙胶等由于卫生清洁、个人护理等产品使用频率的增加，上述粘膜刺激相关的不良反应的发生越来越普遍。另一方面，消费者对于产品安全性的要求也越来越高，因此有必要在现有的检测方法的基础上，建立一些更快速和更敏感的检测和评估方法。现有的外源物质粘膜刺激性的方法可分为动物模型、细胞法和人体试验三类。传统的动物模型检测结膜刺激性，也是将一定量的受试物滴入实验动物(通常为家兔)的眼睛内，经一定时间间隔后，观察受试动物眼睛结膜、角膜和虹膜的变化，以评估该受试物是否有眼刺激性。同样，传统检测口腔粘膜刺激性，是将一定量的受试物通过手术埋入实验动物(通常为金黄地鼠)的口腔颊囊内，经一定时间间隔后，处死动物，收集口腔颊囊组织，观察口腔粘膜的病理变化，以评估该受试物是否有口腔粘膜刺激性。采用动物作为试验对象检测消费品的安全性，其缺点是成本高、周期长，很少使用现代生物科技发展的成果，还给动物带来了极大痛苦，存在道德和伦理上的问题。除此之外，动物实验环境条件苛刻(动物需要饲养在恒温恒湿的室内环境)、动物质量要求严格(要求符合质量等级的要求)、检测门槛高(检测机构需要取得实验动物使用许可证)，又与人的实际使用情况相差太远，而且由于动物和人之间存在种属差异，使用动物皮肤评价人体皮肤的安全风险使结果的可信度降低。随着大量新的物质用于药品和化妆品，我们需要更多的方法来评价这些物质的安全性。同时，为了遵循生命和医学研究中的3r原则(减少、优化和代替动物实验)，以及把现代生物科技的成果应用于人类健康危害评估(如细胞培养、组织工程、组学和基因技术等)。从10年前开始，全球范围内开展了面向21世纪的毒性测试为核心的毒理学的现代化计划。大量的非动物的替代方法应用于健康危害的检测和安全评估中，有的方法已被世界经济合作的发展组织(oecd)、欧洲替代方法验证中心(ecvam)和美国替代方法部门间协调验证中心(iccvam)等机构认可并定为检测指南。目前的体外检测化学物质结膜刺激性的方法主要有oecd指南435、437、460、492等，其中435是早期认可的替代方法，以离体兔眼为测试对象，已逐渐被不使用实验动物材料的方法取代。437是检测眼刺激的牛角膜混浊和渗透性试验，以屠宰场的废弃材料为试验系统检测化学品和产品的眼刺激性，其优点是适用于几乎所有原料和产品的检测，缺点是国内材料来源困难，主要评估角膜的损伤，无法检测结膜的刺激性。460是采用单层细胞培养的方法，主要适用于表面活性剂等化学品的检测，其缺点是不适用于检测难溶解、有颜色的化学物，也不适用于测试剂型和成份复杂的提取物、配方和成品。492是组织工程角膜的方法，需要使用商品化的人工角膜模型，目前国内尚无法生产类似产品，也无法有效进口，其次人工角膜模型价格昂贵，不适用于大量日常检测。目前的体外检测化学物质粘膜刺激性的方法还不成熟，例如有人采用原代人的口腔粘膜上皮细胞或细胞系培养的方法检测口腔粘膜的刺激性，其缺点是体系单一，培养的细胞无血管分布，也无分泌粘液的功能，而且不适用于检测难溶解、有颜色的化学物，也不适用于测试剂型和成份复杂的提取物。组织工程构建的口腔粘膜上皮细胞还无法实现商品化供应。人体志愿者试验是评价产品安全性的最直接的方法。例如人体眼结膜刺激试验需要把产品滴入人眼结膜，测试是否具有刺激性。人体试验结果最为真实，但是代价太高，对志愿者存在健康危害，在伦理学上存在一定的问题。受精鸡胚胎血管系统是非常理想的测试化学品和消费品安全性的方法，首先鸡胚是非哺乳动物，符合各国的动物福利法规要求和3r原则；其次是活的生物体，其生长发育的不同阶段都适合用于毒性或生物活性测试；第三，成本低、标准化程度高，培养和实验条件简单，适合大规模检测和研究。已有大量的基于鸡胚的研究应用于生命科学领域，如胚胎发育毒性测试、促进和抑制血管生成作用研究、评估生物材料的组织相容性等。利用鸡胚发育过程中血管系统丰富的特点可建立检测和评估毒性的方法。鸡胚发育过程中，血管网络是连续发展的生物学过程，4-5天时，卵黄囊血管膜是单层血管膜，血管网刚成型，类似蛛网的形态，对外源物质刺激反应敏感，可以用来进行光毒性、促血管生成作用、胚胎致畸等实验研究。鸡胚发育10天时，形成绒毛尿囊膜血管系统，是三层的血管系统，血管网络已经形成，其结构类似人的结膜，可以用于结膜和粘膜刺激性的评估。因此，本发明对利用鸡胚血管系统检测和评价结膜刺激性及粘膜刺激性的方法方面进行了深入的研究。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种利用鸡胚血管系统检测和评价结膜刺激性及粘膜刺激性的方法，该方法快速、简便、成本低、标准化程度高，适用范围广泛，可以对结膜刺激性和粘膜刺激性物质进行快速有效的检测和评估。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：一种利用鸡胚血管系统检测和评价结膜刺激性及粘膜刺激性的方法，包含以下步骤：(1)绒毛尿囊膜的制备选取spf级受精鸡胚，制备具有绒毛尿囊膜的受精鸡胚备用；(2)结膜刺激试验2.1受试物制备选取受试物，用溶剂溶解后，配制一组具有浓度梯度的稀释液备用，并设置阳性对照、阴性对照和基准对照；2.2筛查试验选取受试物，用溶剂溶解后，重新配制一组具有浓度梯度的稀释液，进行受试物结膜刺激范围筛查试验，确定引起鸡胚反应的大概浓度范围；2.3结膜刺激性rc50确定试验选取受试物，用溶剂溶解后，再重新配制一组具有浓度梯度的稀释液，取步骤(1)中制备的受精鸡胚，在所述受精鸡胚的鸡胚尿囊膜上放置特富龙“о”形环，将该组具有浓度梯度的稀释液、阳性对照、阴性对照和基准对照分别加入到特富龙“о”形环，恒温培养箱孵育后，观察录血管的各种变化，并与环外血管相比较，血管的变化按照表1进行判定和分级，血管反应分级在1级以上为血管反应阳性，按对数图计算结膜刺激性rc50的值，即使半数鸡胚出现阳性反应的受试物浓度；表1光毒性和结膜刺激的血管反应观察及分级分级观察描述0观察不到血管褪色或者出血，血管膜正常1血管白色无血液，管壁清晰；或/和毛细血管充血2毛细胞血管可见细小出血点，出血面积＜20％3明显的血管出血，散在或出血区域＞20％，＜50％4严重出血，出血区域超过50％(3)粘模刺激试验3.1受试物制备液体受试物以原液未稀释的形式进行试验，膏状、微粒状或颗粒样产品以原样进行试验或采用纯净水稀释后进行试验，并设置阳性对照、阴性对照和基准对照；3.2粘膜刺激试验取步骤(1)中制备的受精鸡胚，在所述受精鸡胚的鸡胚尿囊膜上放置特富龙“о”形环，将受试物、阳性对照、阴性对照和基准对照分别加入到特富龙“о”形环，作用后冲洗去除受试物，直接观察结果，记录每种毒性效应变化的程度，每次试验6只鸡胚，并与环外血管相比较，血管的变化按照表2进行判定和分级，血管反应分值在1分和1分以上为血管反应阳性；表2粘膜刺激血管反应评分表(4)预测模型和分类4.1结膜刺激性预测模型从浓度-反应关系计算受试物的rc50，根据以下条件作出结膜刺激判断：rc50≥50％，预测“无刺激性”，10.0％＜rc50且＜50％，预测“无刺激性”，3.0％≤rc50且＜10.0％，预测“弱刺激性”，1.0％≤rc50且＜3.0％，预测“中度刺激性”，rc50＜1.0％，预测“重度刺激性或腐蚀性”；4.2口腔粘模刺激性预测模型计算每只鸡胚3种反应的总评分，再计算6只鸡胚反应的平均总评分aes；根据以下条件作出口腔粘模刺激判断：aes≤6：预测“无口腔粘膜刺激性”；6＜aes且≤12：预测“轻度口腔粘膜刺激性”；12＜aes且＜16：预测“中度口腔粘膜刺激性”aes≥16：预测“严重口腔粘膜刺激性”。在上述利用鸡胚血管系统检测和评价结膜刺激性及粘膜刺激性的方法中：步骤(1)中选取胎龄0天的spf级受精鸡胚放入恒温培养箱中孵育10～14天后，获得具有绒毛尿囊膜的受精鸡胚备用。步骤(1)中所述的spf级受精鸡胚的种类优选为白莱杭鸡、星杂288、白洛克、麻黄或岭南黄鸡。步骤(1)～(4)优选在恒温培养箱中进行，恒温培养箱孵育时温度优选为37℃±1℃，相对湿度优选为65％±5％。步骤(2)中所述受试物包括个人护理产品、洗漱用品、口腔护理用品、家用洗涤产品、化妆品或纺织品浸提物。步骤(2)中所述受试物进一步优选包括：(a)单一成份化学物质，包括化学品、药物或农药；或(b)以单一成份为主的原料，包括植物精提物、粗提物、生物活性原料或多肽；或(c)简单配方，指由3～5种原料复配的半成品或成品，包括防晒剂或抗氧化剂。步骤(2.2)中选取受试物，用溶剂溶解后，重新配制一组具有浓度梯度的稀释液，进行受试物结膜刺激范围筛查试验时，筛查方法优选包括自上而下、自下而上或上下法进行筛查。步骤(2.1)和步骤(2.3)中阳性对照优选为十二烷基肌氨酸钠sls、naoh、乙酸或菌多糖(pls)等，阴性对照优选为溶解受试物的溶剂等，基准对照优选为与受试物相近或相同的已知产品。本发明通过标准化的鸡胚为测试系统，其发育不同阶段的血管系统与人体眼结膜和口腔粘膜下组织类似，鸡胚标准化程度高、来源稳定且批间差异小，血管系统具有生物学活性和功能，测试系统简单、廉价，无需特殊设备，检测方法快速、灵敏、通用。进一步的，上述利用鸡胚血管系统检测和评价粘膜刺激性的方法，包括以下步骤：一、鸡胚血管试验系统1.1天然绒毛尿囊膜制备购买0-9d龄以内的鸡胚，气室朝上贮存于蛋架转移至实验室，应进行照蛋检查，无活性或有缺陷的鸡胚应弃去。将鸡胚气室端向上置于孵化温度37.5℃±0.5℃，相对湿度55％-70％的条件下孵化至10-14d龄。10-14d龄鸡胚照蛋检查，在蛋壳表面标记气室位置；用牙科锯齿弯镊剥去蛋壳部分，暴露白色蛋膜，可用吸管滴加1-2ml0.9％nacl溶液使蛋膜湿润，将0.9％nacl溶液倾出。小心用镊子去除内膜，暴露天然绒毛尿囊膜。1.2人工绒毛尿囊膜的制备购买胎龄0天的spf级受精鸡胚放入温度为37℃±1℃、相对湿度为65％±5％的恒温培养箱中孵育。第3-4天，将鸡胚水平放置。第4-5天，将鸡胚对光检查，弃去没有受精或发育不良的鸡胚。对正常发育的鸡胚，从鸡蛋的非气室端开一个小孔，用酒精棉球擦去粉尘，用注射器从小孔中抽出2.5-3ml蛋清以降低胚胎形成人工绒毛尿囊膜。用石蜡将小孔封闭。然后在鸡蛋顶端上方开一个边长0.8-1cm的矩形小窗，用酒精棉球擦去粉尘。用保鲜膜将小窗封闭，用于每天观察鸡胚活力。将鸡胚水平旋转于温度为37℃±1℃、相对湿度为65％±5％的恒温培养箱孵育。第10-14天，可以开始进行试验。二、结膜刺激试验2.1受试物制备2.1.1水或pbs为溶剂制备受试物配制受试物贮备液前，先了解物质的溶解性。对于水或pbs可溶解的物质，称取一定量的受试物加入到玻璃管，然后加入一定体积的纯净水、双蒸水或pbs，使其混匀，先配制储备液，再按实验阶段要求，分别配制3-5个不同浓度(w/v)的稀释液。2.1.2油为溶剂制备受试物对于水和pbs不溶解的物质，可选择玉米油或橄榄油为溶剂，制备成混悬液，尽量使受试物在溶解体系中均匀分布。先配制储备液，再按实验阶段要求，分别配制3-5个不同浓度(w/v)的稀释液，2.1.3阳性对照、基准对照和阴性对照阳性对照：可选择0.1％-3％的sls(十二烷基硫酸钠)、0.1-0.5mol/lnaoh或3％乙酸；基准对照：可选择与测试物相同剂型、相近刺激性或相近配方的已知结果的化学品、配方或产品；阴性对照：以100％溶剂作为对照。2.2筛查实验正式实验前，先进行受试物结膜刺激范围确定试验，即先进行筛查实验，确定引起鸡胚反应的大概浓度范围。筛查实验的浓度稀释因子在1.2-2.5之间，浓度之间的间隔可以不等距。针对不同的产品类型，可选择自上而下、自下而上法或上下增减法选择筛查实验的浓度范围。2.2.1自上而下法对于预期结膜刺激性“轻微”的产品，筛查浓度从70％、50％、30％、15％和10％(w/v)五个浓度中从高浓度到低浓度选择三个浓度进行测试。2.2.2自下而上法对于预期结膜刺激性“中度或严重”的产品，筛查浓度从30％、15％、10％、5％和2％(w/v)五个浓度中从低浓度到高浓度选择三个浓度进行测试。如果低浓度测试结果仍为刺激性，则从2％再往下稀释为1％、0.5％、0.25％、0.1％等。2.2.3上下增减法对于预期结膜刺激性为“不确定”的产品，筛查浓度从可从50％开始，分步测试，上一步的测试结果决定下一步测试浓度的选择，分别向上或向下增减。如果测试结果为严重刺激，则下一个浓度选择30％，如果测试结果为无刺激，则下一个浓度选择70％；依此类推。2.3筛查实验过程取步骤1中制备获得的鸡胚，用镊子沿开好的窗口将蛋壳剥开至2×2.5cm2大小。在鸡胚尿囊膜表面放置小号(外径9-11mm、内径8-10mm)特富龙“о”形环，用移液枪吸取40μl上述各浓度梯度的溶液，加入到“о”形环内。放入温度为37℃±1℃、相对湿度为65％±5％的恒温培养箱孵育30min±1min，孵育结束后，立即观察记录血管的各种变化。并与环外血管相比较。每个浓度3只鸡胚。血管的变化按照表1进行判定和分级，血管反应分级在1级和1级以上为血管反应阳性。按照反应的严重程度调整正式实验的浓度设置。2.4rc50确定试验rc50确定试验要求比筛查实验使用相同或更小的稀释因子，可选择稀释因子1.2～2之间。稀释浓度3-5个，应覆盖2.3预实验确定的浓度范围，每个浓度10只鸡胚。取步骤1中制备获得的鸡胚，用镊子沿开好的窗口将蛋壳剥开至2×2.5cm2大小。在鸡胚尿囊膜表面放置小号(外径9-11mm、内径8-10mm)特富龙“о”形环，用移液枪吸取40μl上述各浓度梯度的溶液，加入到“о”形环内。放入温度为37℃±1℃、相对湿度为65％±5％的恒温培养箱孵育30min±1min，孵育结束后，立即观察记录血管的各种变化。并与环外血管相比较。血管的变化按照表1进行判定和分级，血管反应分级在1级和1级以上为血管反应阳性。按对数图计算刺激性rc50的值，即使半数鸡胚出现阳性反应的受试物浓度。表1结膜刺激的血管反应观察及分级分级观察描述0观察不到血管褪色或者出血，血管膜正常1血管白色无血液，管壁清晰；或/和毛细血管充血2毛细胞血管可见细小出血点，出血面积＜20％3明显的血管出血，散在或出血区域＞20％，＜50％4严重出血，出血区域超过50％三、粘膜刺激试验3.1受试物制备液体受试物以原液未稀释的形式进行试验；膏状，微粒状或颗粒样受试物或产品以原样进行试验或与纯净水1:1稀释；固体受试物试验前应研磨成细微的颗粒(粉状)，粉状受试物可用少量0.9％nacl或橄榄油/玉米油润湿。如受试物为膏状物，应将受试物涂布于塑料薄膜(如封口膜)表面成薄层，再将其覆盖于cam膜上使受试物与cam膜直接接触，作用时间结束后去除薄膜。3.2阳性对照、基准对照和阴性对照阳性对照：可选择1-3％的sls(十二烷基磺酸钠)、菌多糖pls；基准对照：可选择与测试物相同剂型、相近刺激性或相近配方的已知结果的化合物、配方或产品。阴性对照：以100％溶剂作为对照。3.3粘膜刺激实验取步骤1中制备获得的鸡胚，用镊子沿开好的窗口将蛋壳剥开至2×2.5cm2大小。在鸡胚尿囊膜表面放置大号(外径13-15mm、内径11-13mm)特富龙”о”形环，用粘液枪直接吸取100μl固体受试物(牙膏)，加入到“о”形环内。分别作用30秒和1min后冲洗去除受试物，直接观察结果，记录每种毒性效应变化的程度，并与环外血管相比较。每个时间6只鸡胚。血管的变化按照表2进行判定和分级，血管反应分级在1分和1分以上为血管反应阳性。如果观察表明全部6只鸡胚至少1种反应的评分为中度以上(总评分≥12)，试验应重复一次。表2粘膜刺激血管反应评分表四、预测模型和分类4.1结膜刺激性预测模型4.1.1血管阳性反应分级观察血管膜血管反应，分级描述如表1。4.1.2预测模型从浓度-反应关系计算受试物的rc50。推荐采用以下2种方法进行统计分析，其它专业统计学方法也可应用。①图表法或对数-概率单位法计算rc50。②用非线性的回归方程计算rc50，推荐采用probit回归模型，该模型是毒理学、药理学领域计算半数致死量和半数有效剂量等剂量关系统计指标的常用统计模型。统计学软件(例如，spss20.0)进行。4.1.3结膜刺激性分类根据上述4.1.2预测模型得出受试物受试物结膜刺激的rc50值，根据以下条件判断结膜刺激分类：如果：rc50≥≥50％，预测“无刺激性”，适用于“温和性”“敏感皮肤适用”等类似宣称rc50＞10.0％，且＜50％，预测“无刺激性”rc50≥3.0％，且＜10.0％，预测“弱刺激性”rc50≥1.0％，且＜3.0％，预测“中度刺激性”rc50＜1.0％，预测“重度刺激性或腐蚀性”4.2口腔粘膜刺激性预测模型4.2.1血管阳性反应分级根据表2所述，观察绒毛尿囊膜血管反应。4.2.2预测模型计算每只鸡胚3种反应的总评分，再计算6只鸡胚反应的平均总评分(averageendpointscore，aes)。4.2.3口腔粘膜刺激性分类根据上述预测模型得出总评分，根据以下条件作出口腔粘膜刺激性判断：如果：aes＜6：预测“无口腔粘膜刺激性”；aes≥6，且≤12：预测“轻度口腔粘膜刺激性”；aes＞12，且＜16：预测“中度口腔粘膜刺激性”aes≥16：预测“严重口腔粘膜刺激性”。在该利用鸡胚血管系统检测和评价粘膜刺激性的方法中：步骤(一)中所述的鸡胚为育龄为0-9天的spf级(无特定病原微生物)的白莱杭鸡(whiteleghornchicken)或星杂288(shaverstarcross)受精鸡胚，也可选用白洛克(whiteplymouthrock)、麻黄(spotted-brownchickens)或岭南黄鸡(lingnanyellowchicken)等品种受精鸡胚。步骤(一)、(二)、(三)中所述的检测结膜和粘膜刺激性使用的是10-14天龄鸡胚，指鸡胚发育至第10-14天时，由绒毛膜体壁中胚层和尿囊膜脏层中胚层融合而成的绒毛尿囊膜。步骤(一)、(二)、(三)中所述的检测结膜和粘膜刺激性使用的绒毛尿囊膜实验系统可以是天然气室端的绒毛尿囊膜系统，或人工气室的绒毛尿囊膜系统。步骤(二)中所述的受试物的结膜刺激性是指受试物质直接接触眼睛后引起的眼结膜及其周围粘膜的可逆性炎性变化，这些物质如淋洗类化妆品、眼部和面部用化妆品、眼部药物、喷酒类农药、空气清新剂、空气颗粒物和漂浮物、pm2.5等可能有意或无意接触到眼睛的物质。步骤(三)中所述的受试物的粘膜刺激性是指受试物质直接接触口腔后引起的粘膜、口唇、牙龈及其周围组织的可逆性炎性变化，这些物质包括牙膏、漱口水、牙贴膜、牙胶、牙粉等。步骤(二)和步骤(三)中所述的受试物的制备，所选溶剂可以为超纯水、pbs或玉米油。溶剂与受试物的混匀可借助研磨、加热、震荡、搅拌等方式，直到受试物与溶剂完全混匀。步骤(二)和步骤(三)所述的用于加样并使之固定的特富龙环，是可从市场购买的无毒性、不与样品反应和粘附、可高压灭菌重复使用的白色环，用于结膜刺激性的外径9-11mm、内径8-10mm，加样量为40μl；用于粘膜刺激性的直径为外径13-15mm、内径11-13mm，加样量为100μl。步骤(二)和步骤(三)所述的鸡胚血管阳性反应，是指鸡胚发育10-14天形成的绒毛尿囊膜。可能发生的刺激性反应，包括鬼影血管、充血、出血，并根据不同反应涉及的面积、严重程度进行分级，分级步骤(二)、(四)所述的rc50，是指使鸡胚血管系统发生阳性反应的受试物的稀释浓度。经过统计得出的化学品和植物提取物的rc50值精确到小数点后3位，原料和成品的rc50值精确到小数点后2位。步骤4.1所述的rc50的意义除了用于结膜刺激程度的判定以外，还可用于不同工艺配方之间、不同供应商相同原料之间、不同配方和产品之间、以及不同品牌相似配方之间结膜刺激性的比较。步骤(二)、(三)所述的眼结膜和口腔粘膜刺激试验的阳性对照物为5％sls，也可选择其它已知刺激性的对照物。如果检测和评估的目的是用于鉴定受试物是否具有结膜或粘膜刺激性，或只是用于化学物质的标识和刺激性分类，则阳性对照物通常选1-3％sds、0.1-0.5mol/lnaoh、3％乙酸。如果是为了配方之间的比较和做优化，可选择增加基准对照。步骤(二)、(三)所述的眼结膜和口腔粘膜刺激试验的基准对照，其目的是用于证明试验方法的有效性、检查每批鸡胚的反应性，以及作为检测和评价某一特定配方的基准参考。基准对照应当是来源稳定可靠、结构和功能与受试物的化学分类相似、物理/化学特性已知、结果及预期反应程度明确肯定。例如检测评估之目的是为了开发适用于婴儿的温和配方产品，则可选择市售的已知品牌和结果的对应产品为基准对照。步骤(四)的4.1和4.2所述的结膜和粘膜刺激性分类，可用于法规要求的产品毒性分类和标识。无刺激性以下的具体数值也适用产品温和、低刺激、敏感皮肤使用等功效的宣称。与现有技术相比，本发明具有如下优点：(1)本发明使用的spf级受精胚，是标准化程度高，无病原微生物污染，批次质量稳定的活性生物系统；(2)本发明使用绒毛尿囊膜为试验系统检测物质的结膜/粘膜刺激性，适用于任何原料、混合物、配方和产品的测试，且不受样品溶解性、颜色等物理性状的影响；(3)本发明使用鸡胚绒毛尿囊膜为试验系统利用了不同生长阶段发育程度不同的鸡胚血管系统来检测物质的结膜/粘膜刺激性，方法敏感，与体内实验的一致性程度高，可直接代替动物实验进行初步筛查，减少动物使用；(4)本发明使用的鸡胚胎血管系统及建立的检测评估方法，解决了单层细胞培养只能检测可溶解原料而不能检测不溶解原料、产品和有色物质的局限性，解决了体外构建三维组织工角膜和皮肤模型成本昂贵、批次不稳定的局限性，更加稳定、经济和快速；(5)本发明建立的方法可以代替活体动物和人类皮肤，直接用于化学品、化妆品、药品等产品的结膜刺激性的法规性试验，以及粘膜刺激性的预测；附图说明图1是实施例1中用于眼科制剂原料磺胺醋酰钠的结膜刺激性，其中a图是空白对照的绒毛尿囊膜；b：评分为1级的血管反应；c：评分为2级的血管反应；d：评分为3级的血管反应；图2是实施例1中用于眼霜的结膜刺激性，其中a图是空白对照的绒毛尿囊膜；b：评分为1级的血管反应；c：评分为2级的血管反应；d：阳性对照乙醇，评分为3级的血管反应；图3是实施例1中用于洗发水结膜刺激性，其中a图是空白对照的绒毛尿囊膜；b：评分为1级的血管反应；c：评分为2级的血管反应；d：阳性对照乙醇，评分为3级的血管反应；图4是实施例4中用于漱口水粘膜刺激，其中a图是空白对照的绒毛尿囊膜；b：评分为1级的血管反应；图5是实施例5中用于婴儿按摩油结膜刺激性，其中a图是空白对照的绒毛尿囊膜；b：评分为1级的血管反应；图6是实施例6中用于牙膏粘膜刺激性，其中a图是空白对照的绒毛尿囊膜；b：评分为1级的血管反应。具体实施方式实施例1利用鸡胚血管系统检测和评价磺胺醋酰钠结膜刺激性的方法1、天然绒毛尿囊膜的制备购买7d龄鸡胚，气室朝上贮存于蛋架转移至实验室，照蛋检查，弃去无活性和有缺陷的鸡胚。将鸡胚置于孵化温度37.5℃±0.5℃，相对湿度60％-70％的条件下孵化至10d龄。10d龄时照蛋检查鸡胚，在蛋壳表面标记气室位置；用牙科锯齿弯镊剥去蛋壳部分，暴露白色蛋膜，滴加1-2ml0.9％nacl溶液使蛋膜湿润，然后将溶液倾出，小心用镊子去除内膜，暴露天然绒毛尿囊膜。2、受试物制备2.1所测产品为可溶于水的药品，称取一定量的市售磺胺醋酰钠药品到玻璃管，然后加入一定体积的纯净水，制备成均匀溶液。2.2阳性对照为3％sls2.3根据药品原料预期结膜刺激性可能为“中度”的经验，配制预备实验的浓度为30％、15％、5％和1％(w/v)四个浓度，按照从高浓度到低浓度的顺序进行测试。正式实验根据预实验的结果调整。3.结膜刺激实验3.1预试验确定毒性范围取10天龄鸡胚，在鸡胚尿囊膜表面放置外径9-11mm、内径8-10mm的特富龙“о”形环，用移液枪吸取40μl上述各浓度梯度的溶液，加入到“о”形环内。放入温度为37℃±1℃、相对湿度为65％±5％的恒温培养箱孵育30min±1min，孵育结束后，立即观察记录血管的各种变化。并与环外血管相比较。每个浓度3只鸡胚。血管的变化按照表1进行判定和分级，血管反应分级在1级和1级以上为血管反应阳性。按照反应的严重程度调整正式实验的浓度设置。预实验结果如下。浓度30％(n＝3)15％(n＝3)5％(n＝3)1％(n＝3)阳性反应比例(≥1级)3/33/33/32/33.2结膜刺激性rc50确定试验根据3.1结果，正式实验选择的浓度范围为15％、5％、1％共3个浓度，每个浓度10只鸡胚。取10天龄鸡胚，用镊子沿开好的窗口将蛋壳剥开至2×2.5cm2大小。暴露绒毛尿囊膜，在鸡胚尿囊膜表面放置外径9-11mm、内径8-10mm的特富龙“о”形环，用移液枪吸取40μl上述各浓度梯度的溶液，加入到“о”形环内。放入温度为37℃±1℃、相对湿度为65％±5％的恒温培养箱孵育30min±1min，孵育结束后，立即观察记录血管的各种变化。如图1所示，并与环外血管相比较。血管的变化按照表1进行判定和分级，血管反应分级在1级和1级以上为血管反应阳性。按对数图计算刺激性rc50的值，正式实验鸡胚反应结果及rc50值如下：结膜刺激性的rc50为8.82％。3.3结膜刺激性预测及分类根据实验结果，经对数-概率单位法计算，得出该样品的rc50为43.32％，根据结膜刺激分类的判断标准，如果rc50＞10.0％，且＜50％，预测“无刺激性”，本实验得出rc50＝8.82≥3.0％，且＜10.0％，预测为结膜“弱刺激性”。实施例2利用鸡胚血管系统检测和评价眼霜结膜刺激性的方法1、人工绒毛尿囊膜的制备购买胚龄0天的spf级受精鸡胚放入温度为37℃±1℃、相对湿度为65％±5％的恒温培养箱中孵育。第3天，将鸡胚水平放置。第4天，将鸡胚对光检查，弃去没有受精或发育不良的鸡胚。对正常发育的鸡胚，从鸡蛋的非气室端开一个小孔，用酒精棉球擦去粉尘，用注射器从小孔中抽出2.5-3ml蛋清以形成人工绒毛尿囊膜。用石蜡将小孔封闭。然后在鸡蛋顶端上方开一个边长0.8-1cm的矩形小窗。用保鲜膜将小窗封闭，用于每天观察鸡胚活力。将鸡胚放回温度为37℃±1℃、相对湿度为65％±5％的恒温培养箱孵育。第14天，可以开始进行试验。2、受试物制备2.1所测产品为不溶于水的膏状样品，称取一定量的眼霜(来源于市售国产产品)加入到玻璃管，然后加入一定体积的玉米油，制备成混悬液，尽量使受试物在溶解体系中均匀分布。2.2阳性对照为30％乙醇，基准对照为同类市售进口眼霜。2.3根据眼霜结膜刺激性的经验预测，估计该眼霜对血管无反应的最高浓度约在70％，rc的范围在40-60％之间，因此配制预备实验的浓度为70％、50％、30％、10％共4个浓度(w/v)。正式实验根据预实验的结果调整。3、结膜刺激预测3.1预试验确定毒性范围取14天龄鸡胚，用镊子沿开好的窗口将蛋壳剥开至2×2.5cm2大小，暴露人工绒毛尿囊膜，在表面放置外径9-11mm、内径8-10mm的特富龙“о”形环，用移液枪吸取40μl上述各浓度梯度的溶液，加入到“о”形环内。放入温度为37℃±1℃、相对湿度为65％±5％的恒温培养箱孵育30min±1min，孵育结束后，立即观察记录血管的各种变化。并与环外血管相比较。血管的变化按照表1进行判定和分级，血管反应分级在1级和1级以上为血管反应阳性。按照反应的严重程度调整正式实验的浓度设置。预实验结果如下。3.2结膜刺激性rc50确定试验根据3.1结果，正式实验选择的浓度范围为50％、30％、15％共3个浓度，每个浓度10只鸡胚。取14天龄鸡胚，用镊子沿开好的窗口将蛋壳剥开至2×2.5cm2大小，暴露绒毛尿囊膜，在表面放置外径9-11mm、内径8-10mm的特富龙“о”形环，用移液枪吸取40μl上述各浓度梯度的溶液，加入到“о”形环内。放入温度为37℃±1℃、相对湿度为65％±5％的恒温培养箱孵育30min±1min，孵育结束后，立即观察记录血管的各种变化。结果如图2所示，并与环外血管相比较。血管的变化按照表1进行判定和分级，血管反应分级在1级和1级以上为血管反应阳性，结果如图2所示，按对数图计算刺激性rc50的值，即使半数鸡胚出现阳性反应的受试物浓度。正式实验鸡胚反应结果及rc50值如下：样品结膜刺激性的rc50为45.32％。3.3结膜刺激性预测及分类根据实验结果，经对数-概率单位法计算，得出该样品的rc50为45.32％，根据结膜刺激分类的判断标准，如果rc50＞10.0％，且＜50％，预测“无刺激性”，本实验得出rc50＝45.32≥3.0％，且＜10.0％，预测为结膜“无刺激性”。基准对照＞70％。实施例3利用鸡胚血管系统检测和评价洗发水的结膜刺激性的方法1、人工绒毛尿囊膜的制备购买胚龄0天的spf级受精鸡胚放入温度为37℃±1℃、相对湿度为65％±5％的恒温培养箱中孵育。第3天，将鸡胚水平放置。第4天，将鸡胚对光检查，弃去没有受精或发育不良的鸡胚。对正常发育的鸡胚，从鸡蛋的非气室端开一个小孔，用酒精棉球擦去粉尘，用注射器从小孔中抽出2.5-3ml蛋清以形成人工绒毛尿囊膜。用石蜡将小孔封闭。然后在鸡蛋顶端上方开一个边长0.8-1cm的矩形小窗。用保鲜膜将小窗封闭，用于每天观察鸡胚活力。将鸡胚放回温度为37℃±1℃、相对湿度为65％±5％的恒温培养箱孵育。第11天，可以开始进行试验。2、受试物制备2.1所测洗发水产品为可部分溶解于水的粘稠液体样品，称取一定量的洗发水加入到玻璃管，然后加入一定体积的纯净水，制备成混悬液，尽量使受试物在溶解体系中均匀分布。2.2阳性对照为3％sls，2.3根据洗护用品预期结膜刺激性“弱”的经验，配制预备实验的浓度为50％、30％、10％和2.5％(w/v)四个浓度，按照从高浓度到低浓度的顺序进行测试。正式实验根据预实验的结果调整。3.结膜刺激实验3.1预试验确定毒性范围取7天龄鸡胚，用镊子沿开好的窗口将蛋壳剥开至2×2.5cm2大小。在鸡胚尿囊膜表面放置外径9-11mm、内径8-10mm的特富龙“о”形环，用移液枪吸取40μl上述各浓度梯度的溶液，加入到“о”形环内。放入温度为37℃±1℃、相对湿度为65％±5％的恒温培养箱孵育30min±1min，孵育结束后，立即观察记录血管的各种变化。并与环外血管相比较。每个浓度3只鸡胚。血管的变化按照表1(同实施例1)进行判定和分级，血管反应分级在1级和1级以上为血管反应阳性。按照反应的严重程度调整正式实验的浓度设置。预实验结果如下。浓度50％(n＝3)30％(n＝3)10％(n＝3)5％(n＝3)阳性反应比例(≥1级)3/33/33/32/33.2刺激性rc50确定试验根据4.1结果，正式实验选择的浓度范围为10％、5％、2.5％共3个浓度，每个浓度10只鸡胚。取7天龄鸡胚，用镊子沿开好的窗口将蛋壳剥开至2×2.5cm2大小。在鸡胚尿囊膜表面放置在鸡胚尿囊膜表面放置外径9-11mm、内径8-10mm的特富龙“о”形环，用移液枪吸取40μl上述各浓度梯度的溶液，加入到“о”形环内。放入温度为37℃±1℃、相对湿度为65％±5％的恒温培养箱孵育30min±1min，孵育结束后，立即观察记录血管的各种变化。结果如图3所示，并与环外血管相比较。血管的变化按照表1进行判定和分级，血管反应分级在1级和1级以上为血管反应阳性。结果如图3所示，按对数图计算刺激性rc50的值，即使半数鸡胚出现阳性反应的受试物浓度。正式实验鸡胚反应结果及rc50值如下：洗发水样品引起鸡胚反应的rc50为5.66％3.3结膜刺激性预测及分类根据实验结果，经对数-概率单位法计算，得出该样品的rc50为5.66％，根据结膜刺激分类的判断标准，如果rc50≥3.0％，且＜10.0％，预测“弱刺激性”。本实验得出洗发水的rc50＝5.66％≥3.0％，且＜10.0％，预测为“弱刺激性”。实施例4利用鸡胚血管系统检测和评价漱口水的口腔粘膜刺激性的方法1、天然绒毛尿囊膜的制备购买7d龄鸡胚，气室朝上贮存于蛋架转移至实验室，照蛋检查，弃去无活性和有缺陷的鸡胚。将鸡胚置于孵化温度37.5℃±0.5℃，相对湿度60％-70％的条件下孵化至10d龄。10d龄时照蛋检查鸡胚，在蛋壳表面标记气室位置；用牙科锯齿弯镊剥去蛋壳部分，暴露白色蛋膜，滴加1-2ml0.9％nacl溶液使蛋膜湿润，然后将溶液倾出，小心用镊子去除内膜，暴露天然绒毛尿囊膜。2、受试物制备2.1所测漱口水产品(国产某品牌)液体样品，直接吸取原样品用于实验。2.2阳性对照为100％乙醇。2.3基准对照为某进口品牌漱口水。3.粘膜刺激实验3.1实验过程取步骤7天龄鸡胚，用镊子沿开好的窗口将蛋壳剥开至2×2.5cm2大小。在鸡胚尿囊膜表面放置外径13-15mm、内径11-13mm规格的特富龙”о”形环，用粘液枪直接吸取100μl洗发水，加入到“о”形环内。作用30秒后冲洗去除受试物，直接观察结果，记录每种毒性效应变化的程度，并与环外血管相比较。结果如图4所示，每个时间6只鸡胚。血管的变化按照表2进行判定和分级，血管反应分级在1级和1级以上为血管反应阳性。如果观察表明全部6只鸡胚至少1种反应的评分为中度以上(总评分≥12)，试验应重复一次。表2粘膜刺激血管反应评分表3.2粘膜刺激性预测模型计算每只鸡胚3种反应的总评分，再计算6只鸡胚反应的平均总评分(averageendpointscore,aes).样品：aes＝(1+2+2+1+1+1)＝5，阳性对照：aes＝(3+3+3+3+3+3)＝18，基准对照：aes＝(1+0+0+0+1+1)＝2，根据预测粘膜刺激性模型的判断标准，aes＜6：预测“无口腔粘膜刺激性”；aes≥6，且≤12：预测“轻度口腔粘膜刺激性”；aes＞12，且＜16：预测“中度口腔粘膜刺激性”；aes≥16：预测“严重口腔粘膜刺激性”。预测该漱口水“无口腔粘膜刺激性”，但分值高于基准对照产品。实施例5利用鸡胚血管系统检测和评价婴儿按摩油的结膜刺激性的方法1、天然绒毛尿囊膜的制备购买8d龄鸡胚，气室朝上贮存于蛋架转移至实验室，照蛋检查，弃去无活性和有缺陷的鸡胚。将鸡胚置于孵化温度37.5℃±0.5℃，相对湿度60％-70％的条件下孵化至10d龄。10d龄时照蛋检查鸡胚，在蛋壳表面标记气室位置；用牙科锯齿弯镊剥去蛋壳部分，暴露白色蛋膜，滴加1-2ml0.9％nacl溶液使蛋膜湿润，然后将溶液倾出，小心用镊子去除内膜，暴露天然绒毛尿囊膜。2、受试物制备2.1所测按摩油为不溶于水的油状液体样品，吸取一定量的样品加入到玻璃管，然后加入一定体积的玉米油，制备成混悬液，尽量使受试物在溶解体系中均匀分布。2.2阳性对照为3％sls；2.3基准对照：测试目的是为了宣称“温和”和婴儿使用产品，实验增加同类国际品牌产品为基准对照。2.4根据婴儿护肤用品预期结膜刺激性“轻微”的经验，配制预备实验的浓度为70％、50％、30％和10％(w/v)四个浓度，按照从高浓度到低浓度的顺序进行测试。正式实验根据预实验的结果调整。3、结膜刺激实验3.1预试验确定毒性范围取8天龄鸡胚，用镊子沿开好的窗口将蛋壳剥开至2×2.5cm2大小。在鸡胚尿囊膜表面放置外径9-11mm、内径8-10mm的特富龙“о”形环，用移液枪吸取40μl上述各浓度梯度的溶液，加入到“о”形环内。放入温度为37℃±1℃、相对湿度为65％±5％的恒温培养箱孵育30min±1min，孵育结束后，立即观察记录血管的各种变化。并与环外血管相比较。每个浓度3只鸡胚。血管的变化按照表1进行判定和分级，血管反应分级在1级和1级以上为血管反应阳性。结果如图5所示，按照反应的严重程度调整正式实验的浓度设置。预实验结果如下。浓度70％(n＝3)50％(n＝3)30％(n＝3)10％(n＝3)阳性反应比例(≥2级)1/30/3--3.2刺激性rc50确定试验根据结果，正式实验选择的浓度范围为100％、70％、50％共3个浓度，每个浓度10只鸡胚。取8天龄鸡胚，用镊子沿开好的窗口将蛋壳剥开至2×2.5cm2大小。在鸡胚尿囊膜表面放置在鸡胚尿囊膜表面放置外径9-11mm、内径8-10mm的特富龙“о”形环，用移液枪吸取40μl上述各浓度梯度的溶液，加入到“о”形环内。放入温度为37℃±1℃、相对湿度为65％±5％的恒温培养箱孵育30min±1min，孵育结束后，立即观察记录血管的各种变化。结果如图5所示，并与环外血管相比较。血管的变化按照表1进行判定和分级，血管反应分级在1级和1级以上为血管反应阳性。按对数图计算刺激性rc50的值，即使半数鸡胚出现阳性反应的受试物浓度。正式实验鸡胚反应结果及rc50值如下：婴儿按摩油样品引起鸡胚反应的rc50为90.9％3.3结膜刺激性预测及分类据实验结果，经对数-概率单位法计算，得出该样品的rc50为90.9％，根据结膜刺激分类的判断标准，如果rc50≥50％，预测“无刺激性”。据此标准，该婴儿按摩油样品预测为“无刺激性”，可用于“温和性”宣称。实施例6利用鸡胚血管系统检测和评价牙膏的粘膜刺激性的方法1、人工绒毛尿囊膜制备购买胚龄0天的spf级受精鸡胚放入温度为37℃±1℃、相对湿度为65％±5％的恒温培养箱中孵育。第3天，将鸡胚水平放置。第4天，将鸡胚对光检查，弃去没有受精或发育不良的鸡胚。对正常发育的鸡胚，从鸡蛋的非气室端开一个小孔，用酒精棉球擦去粉尘，用注射器从小孔中抽出2.5-3ml蛋清以形成人工绒毛尿囊膜。用石蜡将小孔封闭。然后在鸡蛋顶端上方开一个边长0.8-1cm的矩形小窗。用保鲜膜将小窗封闭，用于每天观察鸡胚活力。将鸡胚放回温度为37℃±1℃、相对湿度为65％±5％的恒温培养箱孵育。第14天，可以开始进行试验。2、受试物制备2.1所测牙膏(市售国产牙膏)为不溶于水易起泡的膏状固体，称取一定量的样品加入到玻璃管，然后加入一定体积的纯净水，制备成混悬液，尽量使受试物在溶解体系中均匀分布。2.2阳性对照为3％sls。基准对照为某品牌进口牙膏。3、粘膜刺激实验3.1实验过程取步骤7天龄鸡胚，用镊子沿开好的窗口将蛋壳剥开至2×2.5cm2大小。在鸡胚尿囊膜表面放置外径13-15mm、内径11-13mm规格的特富龙”о”形环，用粘液枪直接吸取100μl牙膏混合物，加入到“о”形环内。作用30秒后冲洗去除受试物，直接观察结果，记录每种毒性效应变化的程度，并与环外血管相比较。结果如图6所示，每个时间6只鸡胚。血管的变化按照表2进行判定和分级，血管反应分级在1级和1级以上为血管反应阳性。如果观察表明全部6只鸡胚至少1种反应的评分为中度以上(总评分≥12)，试验应重复一次。表2粘膜刺激血管反应评分表3.2口腔粘膜刺激性预测计算每只鸡胚3种反应的总评分，再计算6只鸡胚反应的平均总评分(averageendpointscore,aes)：样品aes＝(1+0+0+1+1+1)＝4，基准对照aes＝(1+0+0+0+1+1)＝3。根据预测粘膜刺激性模型的判断标准，如果：aes≤6：预测“无口腔粘膜刺激性”；该样品aes＝4＜6，预测其为“无口腔粘膜刺激性”。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。例如本发明虽然仅列举了洗发水和按摩油为结膜刺激样品，列举了牙膏为粘膜刺激样品。但本发明中提到的其他物质如化学品(三氯甲烷、甲苯、三丁基氯乙锡等)、个人洗护产品(洗发水、护发素、染发剂、护发精油、沐浴乳、身体乳等)、家用洗涤产品(洗衣液、洗衣粉、肥皂、洗洁精、漂白剂、消毒液、柔顺剂等)、化妆品(护肤类、防晒类、粉底、bb霜、cc爽、眼影、唇彩等)、眼科药品(巴比妥类、氯喹、胍乙啶、溴苄铵、苯妥英钠、磺胺醋酰钠、可卡因、硼酸等)、植物提取物(粗提取物、精提取物及其混合物)、生物活性原料、多肽、其它皮肤接触产品(衣服、内衣等纺织品浸提物)等也可以用本发明所述方法进行结膜或粘膜刺激性检测。淋洗类化妆品、眼部和面部用化妆品、眼部药物、喷酒类农药、空气清新剂、空气颗粒物和漂浮物、pm2.5等也可以用本发明所述方法进行结膜刺激性检测。牙膏、漱口水、牙贴膜、牙胶等可以用本发明所述方法进行口腔粘膜刺激性检测，此处不再一一列举。当前第1页12