本发明涉及lta4h作为指示肝内结节及早期预警肝癌的生物标志物。
背景技术：
：肝癌作为人类生命威胁最大的恶性肿瘤之一，备受全球关注。根据全球癌症统计报告，肝癌已成为中国发病率最高的癌症，而肝炎病毒的肆虐使中国成为肝炎和肝癌发病重灾区。因此，如何有效预防肝炎向肝癌恶化成为国内研究者的重要议题之一。最近，已有研究表明，慢性炎症确实可诱发包括肝癌在内的多种癌症的发生。虽然研究者们已提出了不少关于炎症促癌机制的假说，但是慢性肝炎向肝癌恶性转化的机制仍未完全明确。因此，暂时还没有比较精准且可靠的生物标志物实现肝癌早期诊断。目前，主要的诊断方式有两种，一种是基于医学影像检测和医生经验对肝病进行临床诊断分期；另一种是基于组织活检，用少数较精准分子标志物对肝脏肿瘤进行病理分级。然而，这些诊断方法都有缺陷，一方面是病情已极度严重，肿瘤已生长足够大，才可被医学影像仪器分辨；另一方面，组织活检对患者造成创伤，不便于广泛应用。这些诊断缺陷严重影响了病情了解进而影响到治疗质量和效果。因此，本领域仍然急切需要能对慢性炎症向肝癌恶性转化〔内源性(原癌基因激活)和外源性(病毒感染)共同影响引发的慢性炎症向肝癌恶性转化〕进行早期预警的分子标志物和方法。技术实现要素：本发明第一方面提供lta4h和任选的pla2g6以及任选的eps8l2作为分子标志物在诊断对象的肝内结节或诊断对象是否处于肝炎向肝癌恶性转化临界阶段中的应用。在一个或多个实施方案中，本发明提供lta4h与pla2g6作为分子标志物在诊断对象的肝内结节或诊断对象是否处于肝炎向肝癌恶性转化临界阶段中的应用。在一个或多个实施方案中，本发明提供lta4h与eps8l2作为分子标志物在诊断对象的肝内结节或诊断对象是否处于肝炎向肝癌恶性转化临界阶段中的应用。在一个或多个实施方案中，本发明提供pla2g6、lta4h与eps8l2三者作为分子标志物在诊断对象的肝内结节或诊断对象是否处于肝炎向肝癌恶性转化临界阶段中的应用。本发明第二方面提供与lta4h特异性结合的试剂、任选的与pla2g6特异性结合的试剂以及任选的与eps8l2特异性结合的试剂在制备用于诊断对象的肝内结节或诊断对象是否处于肝炎向肝癌恶性转化临界阶段的试剂盒中的应用。在一个或多个实施方案中，本发明提供与lta4h特异性结合的试剂和与pla2g6特异性结合的试剂在制备用于诊断对象的肝内结节或诊断对象是否处于肝炎向肝癌恶性转化临界阶段的试剂盒中的应用。在一个或多个实施方案中，本发明提供与lta4h特异性结合的试剂和与eps8l2特异性结合的试剂在制备用于诊断对象的肝内结节或诊断对象是否处于肝炎向肝癌恶性转化临界阶段的试剂盒中的应用。在一个或多个实施方案中，本发明提供与lta4h特异性结合的试剂、与pla2g6特异性结合的试剂以及与eps8l2特异性结合的试剂在制备用于诊断对象的肝内结节或诊断对象是否处于肝炎向肝癌恶性转化临界阶段的试剂盒中的应用。在一个或多个实施方案中，所述试剂为抗体或其抗原结合片段。本发明第三方面提供一种检测试剂盒，其含有以lta4h作为检测对象的试剂。在一个或多个实施方案中，所述以lta4h作为检测对象的试剂包括lta4h的特异性抗体。在一个或多个实施方案中，所述检测试剂盒中还含有以pla2g6和/或eps8l2作为检测对象的试剂。在一个或多个实施方案中，所述以pla2g6和/或eps8l2作为检测对象的试剂包括pla2g6和/或eps8l2的特异性抗体。在一个或多个实施方案中，所述检测试剂盒还含有采用免疫组化方法检测lta4h所需的试剂。在一个或多个实施方案中，所述检测试剂盒还含有采用免疫组化方法检测pla2g6和/或eps8l2所需的试剂。本发明第四方面提供一种诊断对象是否存在肝内结节，或是否处于肝炎向肝癌恶性转化的临界阶段的方法，所述方法包括检测该对象肝脏组织内的lta4h的表达量的步骤；其中，该表达量高于正常人群肝脏组织内的lta4h表达量提示该患者存在肝内结节或正处于肝炎向肝癌恶性转化的临界阶段。在一个或多个实施方案中，所述方法还包括检测该对象肝脏组织内的pla2g6和/或eps8l2的表达量的步骤。在一个或多个实施方案中，所述肝内结节为高级别不典型增生结节。在一个或多个实施方案中，所述对象是肝炎患者。本发明第五方面提供lta4h和任选的pla2g6以及任选的eps8l2作为分子标志物在制备诊断对象的肝内结节或诊断对象是否处于肝炎向肝癌恶性转化临界阶段用的试剂和/或试剂盒中的应用。在一个或多个实施方案中，本发明提供lta4h与pla2g6作为分子标志物在制备诊断对象的肝内结节或诊断对象是否处于肝炎向肝癌恶性转化临界阶段用的试剂和/或试剂盒中的应用。在一个或多个实施方案中，本发明提供lta4h与eps8l2作为分子标志物在制备诊断对象的肝内结节或诊断对象是否处于肝炎向肝癌恶性转化临界阶段用的试剂和/或试剂盒中的应用。在一个或多个实施方案中，本发明提供pla2g6、lta4h与eps8l2三者作为分子标志物在制备诊断对象的肝内结节或诊断对象是否处于肝炎向肝癌恶性转化临界阶段用的试剂和/或试剂盒中的应用。附图说明图1：whv/c-myc转基因小鼠和作为参照的wt-c57bl/6小鼠的肝脏蛋白质组检测和定量的流程图。图2：基于动态网络生物标志物检测肝炎向肝癌恶性转化的早期预警信号。图3：动态网络生物标志物及其相关的共表达分子在网络结构和表达变异方面的动态变化。图4：he染色的肝组织切片图像。图5：动态网络生物标志物相关的功能网络(dnb-associatednetwork)在炎癌转化过程中的动态变化。a和b：分别统计了网络中与差异表达蛋白(dep)或差异共表达蛋白对(dce)重合的点或边进行统计，并使用超几何检验评估其重合显著性。c和d：一系列的网络图分别展示了在炎癌恶性转化过程中(即3到7月龄之间)转基因小鼠的dnb相关功能网络所涉及的差异表达蛋白(dep)和差异共表达蛋白对(dce)的动态变化。图6：pla2g6、lta4h及eps8l2在肝炎向肝癌恶性转化过程中各时间点(阶段)的表达量变化情况。图7：lta4h应用于临床病人的诊断情况。图8：pla2g6应用于临床病人的诊断情况。图9：eps8l2应用于临床病人的诊断情况。具体实施方式应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。为了尽可能模仿内源性和外源性共同影响引发的炎癌恶性转化的过程，本文使用对c-myc转基因小鼠在土拨鼠肝炎病毒(woodchuckhepatitisvirus，whv)感染下发生肝炎向肝癌病变的动物模型。先前的研究(etiemblej、degottc、renardca等，liver-specificexpressionandhighoncogenicefficiencyofac-myctransgeneactivatedbywoodchuckhepatitisvirusinsertion，oncogene1994，9:727-737)表明，在肝癌发生发展过程中，whv/c-myc小鼠的肝脏先后经历了肝纤维化、肝内结节、良性肿瘤到恶性肿瘤等病理过程，这与乙肝患者病情恶化得肝癌的进程非常类似。因此，基于先前的研究(etiemblej、degottc、renardca等，liver-specificexpressionandhighoncogenicefficiencyofac-myctransgeneactivatedbywoodchuckhepatitisvirusinsertion，oncogene1994，9:727-737)，本发明在不同的病理阶段选取了五个时间点(小鼠出生后的第2、3、5、7、11个月)，分别采集whv/c-myc小鼠和作为参照的wt-c57bl/6小鼠的肝脏样本，利用非标记(label-free)定量技术和串联标记(tandemmasstag，tmt)定量技术对蛋白质组进行质谱分析，获得时序的高通量蛋白质组定量数据。同时，应用寻找动态网络生物标志物(dnb)的方法(chenl、liur、liuzp、lim、aiharak，detectingearly-warningsignalsforsuddendeteriorationofcomplexdiseasesbydynamicalnetworkbiomarkers，scientificreports2012，2:342)，鉴定到肝炎向肝癌恶性转化的关键临界阶段，并挖掘动态网络生物标志物所隐含的预警信号及其潜在的炎癌转化机制。具体而言，本文通过对whv/c-myc转基因小鼠模型在肝炎向肝癌恶性转化过程中不同病征的时序蛋白质组数据分析，发现五月龄的转基因小鼠正处于炎癌转化的关键临界阶段，这与病理组织形态判定结果一致；而且也获得了具有预警该临界阶段的动态网络标志物(dnb)。为了进一步揭示dnb在炎癌转化过程中发挥的作用和潜在的致病机制，本文构建了dnb相关网络(dnb-associatednetwork)，并对其网络结构动态变化进行分析，发现dnb相关网络出现翻转现象，由此推断作为dnb成员的pla2g6、lta4h和/或eps8l2可能诱发了后续炎症反应异常和肝功能失调以至于最终促发了炎症向肿瘤恶化。本文的组化实验结果进一步证实了上述推断。同时，有报道表明，肝结节阶段是人肝炎向肝癌恶性转变的临界阶段。尤其是，高级别不典型增生结节(hgdn)是目前所公认的肝癌的癌前病变，其被定义为“肝组织有异型增生但又未达到恶性肿瘤标准，具有高度恶性潜能的，直径1mm以上的不典型增生结节”。目前，主要通过组织病理检测hgdn。hgdn的主要病理特点有：(1)细胞密度增加，(2)肝板增厚，(3)核浆比增加，(4)假腺管型形成，(5)轻度核异型，(6)胞浆嗜碱性染色增加，(7)无间质及门静脉浸润等。本文基于时序动态性和网络关联性分析找到了炎癌转化的关键临界阶段，为临床应用于肝炎患者早期肝癌诊断(如是否存在肝内结节，尤其是hgdn)、是否处于肝炎向肝癌恶性转化(即炎癌转化)的临界阶段和预防炎癌恶化转变提供了新的方向。因此，本文以pla2g6、lta4h和eps8l2中的任意一个、任意两个(例如pla2g6与lta4h，pla2g6与eps8l2，或lta4h与eps8l2)或全部三个为检测对象，通过检测其在对象肝脏内的蛋白表达量，与正常人群肝脏内的蛋白表达量相比，从而判断对象是否存在肝内结节，尤其是hgdn以及是否处于肝炎向肝癌恶性转化的临界阶段。本文中，pla2g6指磷脂酶a2(vi组)，它是一种85kd的位于胞浆内的不依赖钙的磷脂酶。应理解的是，本文包括各种被本领域技术人员定义为磷脂酶a2(vi组)的pla2g6，例如来自不同物种(如人或鼠或其它动物)的pla2g6。例如，鼠pla2g6的编码基因位于鼠第15号染色体上，具体的染色体区段是15e1，ensembl上的基因编号是ensmusg00000042632，entrez上的基因编号是53357号。而人pla2g6的编码基因位于第22号染色体上，具体的染色体区段是22q13.1，ensembl上的基因编号是ensg00000184381，entrez上的基因编号是8398号。本发明尤其包括人pla2g6蛋白的检测。应理解的是，不同人的pla2g6蛋白可能会存在一个或数个氨基酸残基的差异，但这种差异并不妨碍该pla2g6蛋白作为生物标志物，用于本文所述的用途和方。在某些实施方案中，本文所述的pla2g6蛋白指同一物种基因组中相同位置上的基因编码的pla2g6蛋白。本文中，lta4h指白三烯a4水解酶。本文包括各种被本领域技术人员定义为白三烯a4水解酶的lta4h，例如来自不同物种(如人或鼠或其它动物)的lta4h。例如，鼠lta4h的编码基因位于鼠第10号染色体上，具体的染色体区段是10c3，ensembl上的基因编号是ensmusg00000015889，entrez上的基因编号是16993号。而人lta4h的编码基因位于第12号染色体上，具体的染色体区段是12q22，ensembl上的基因编号是ensg00000111144，entrez上的基因编号是4048号。本发明尤其包括人lta4h蛋白的检测。应理解的是，不同人的lta4h蛋白可能会存在一个或数个氨基酸残基的差异，但这种差异并不妨碍该lta4h蛋白作为生物标志物，用于本文所述的用途和方。在某些实施方案中，本文所述的lta4h蛋白指同一物种基因组中相同位置上的基因编码的lta4h蛋白。本文中，eps8l2指表皮生长因子受体激酶底物8样蛋白2。本文包括各种被本领域技术人员定义为表皮生长因子受体激酶底物8样蛋白2的eps8l2，例如来自不同物种(如人或鼠或其它动物)的eps8l2。例如，鼠eps8l2的编码基因位于鼠第7号染色体上，具体的染色体区段是7f5，ensembl上的基因编号是ensmusg00000025504，entrez上的基因编号是98845号。而人eps8l2的编码基因位于第11号染色体上，具体的染色体区段是11q15.5，ensembl上的基因编号是ensg00000177106，entrez上的基因编号是64787号。本发明尤其包括人eps8l2蛋白的检测。应理解的是，不同人的eps8l2蛋白可能会存在一个或数个氨基酸残基的差异，但这种差异并不妨碍该eps8l2蛋白作为生物标志物，用于本文所述的用途和方。在某些实施方案中，本文所述的eps8l2蛋白指同一物种基因组中相同位置上的基因编码的eps8l2蛋白。本文中，“对象”指各种需要判断其是否发生肝内结节和/或是否处于肝炎向肝癌恶性转化的临界阶段的动物，包括但不限于哺乳动物和啮齿类动物，例如人和鼠。尤其是，在某些实施方案中，本文所述的“对象”指人，更优选是曾感染过肝炎病毒的人、肝炎患者或疑似肝炎患者。可采用本领域周知的方法(如免疫组化方法)检测对象肝脏组织中pla2g6、lta4h和eps8l2中的任意一个、任意两个或全部三个的表达量。任何能检测pla2g6、lta4h或eps8l2的表达量的试剂都可用在本发明的用途、方法或试剂盒中，包括各种能与pla2g6、lta4h或eps8l2特异性结合的试剂，如抗体或其抗原结合片段。免疫组化方法是本领域常规的方法，通常利用抗原与抗体的特异性结合，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色，从而确定组织细胞内抗原的存在和/或含量的方法。可利用pla2g6、lta4h和/或eps8l2各自的特异性抗体来实施本方法或用途。这类特异性抗体可以是已知的市售抗体，例如，来自abcam的抗体。或者，也可根据已知技术(例如杂交瘤技术)自行制备它们各自的特异性抗体。抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体；优选单克隆抗体。示例性的免疫组化方法如本文“材料和方法”部分所述，但不限于该部分所述的方法。因此，本文提供一种检测试剂盒，该检测试剂盒中含有以pla2g6、lta4h和eps8l2中的任意一个、任意两个或全部三个为检测对象的试剂。例如，该检测试剂盒可含有以pla2g6为检测对象的试剂，或含有以lta4h为检测对象的试剂，或含有以eps8l2为检测对象的试剂，或含有任意两类试剂或全部三类试剂。在某些实施方案中，本文的检测试剂盒含有以pla2g6为检测对象的试剂和以lta4h为检测对象的试剂，或pla2g6为检测对象的试剂和以eps8l2为检测对象的试剂，或以lta4h为检测对象的试剂和以eps8l2为检测对象的试剂。如前文所述，这类试剂可以是任何能检测pla2g6、lta4h和eps8l2的表达量的试剂，优选是它们各自的特异性抗体。还包括抗体的保留了与pla2g6、lta4h或eps8l2的结合活性的抗原结合片段。本文的检测试剂盒中还可含有实施本发明所述检测所需的其它试剂，例如实施免疫组化方法所需的其它试剂。例如，当处理的对象是石蜡包埋的组织切片时，本文的检测试剂盒中还可含有：切片脱蜡和水合所需的试剂，如二甲苯、无水乙醇、过氧化氢甲醇溶液等；抗原修复所需的试剂，例如酸性修复液；bsa；缓冲液，如pbs缓冲液；二抗；当利用dab显色时，dab显色液；苏木素；盐酸乙醇溶液；石碳酸；中性树脂等。试剂盒中各种试剂的含量和浓度可按照常规方法予以确定。本文的检测试剂盒可用于检测样品中pla2g6、lta4h和/或eps8l2的表达量，经由该表达量，本领域技术人员可判断该样品对针对的对象是否存在肝内结节，和/或是否处于肝炎向肝癌恶性转化的临界阶段。通常，可将检测结果与正常人群肝脏组织内的pla2g6、lta4h和/或eps8l2的表达量进行一一对比。若发现样品中pla2g6的表达量低于、和/或lta4h和/或eps8l2的表达量高于正常人群肝脏组织内的pla2g6、lta4h和/或eps8l2的表达量，则可做出该对象存在肝内结节，和/或处于肝炎向肝癌恶性转化的临界阶段的判断。正常人群肝脏组织内的pla2g6、lta4h以及eps8l2的表达量可采用本领域周知的方法，包括本文所述的免疫转化方法，进行调查统计。例如，通常，样品中pla2g6的表达量为正常人群肝脏组织中的pla2g6表达量的90％以下、80％以下、70％以下、60％以下、50％以下或40％以下，，则可认为该对象存在肝内结节(尤其是高级别不典型增生结节)，和/或处于肝炎向肝癌恶性转化的临界阶段；和/或通常，样品中lta4h的表达量为正常人群肝脏组织内的lta4h的表达量的至少1.3倍、至少1.5倍、至少1.7倍、至少2倍、至少2.5倍或至少3倍，则认为该对象存在肝内结节(尤其是高级别不典型增生结节)，和/或处于肝炎向肝癌恶性转化的临界阶段；和/或通常，样品中eps8l2的表达量为正常人群肝脏组织内的eps8l2的表达量的至少1.3倍、至少1.5倍、至少1.7倍、至少2倍、至少2.5倍或至少3倍，则认为该对象存在肝内结节(尤其是高级别不典型增生结节)，和/或处于肝炎向肝癌恶性转化的临界阶段。在某些实施方案中，甚至可检测对象疑似患病的肝脏组织中的pla2g6、lta4h和/或eps8l2的表达量，与该对象正常肝脏组织中的pla2g6、lta4h和/或eps8l2的表达量进行一一对比，若疑似患病肝脏组织中pla2g6的表达量低于、和/或lta4h和/或eps8l2的表达量高于其正常肝脏组织中的表达量，例如，若疑似患病肝脏组织中pla2g6的表达量为其正常肝脏组织中的pla2g6表达量的90％以下、80％以下、70％以下、60％以下、50％以下或40％以下、和/或lta4h和/或eps8l2的表达量是其正常肝脏组织中的表达量的至少1.3倍、至少1.5倍、至少1.7倍、至少2倍、至少2.5倍或至少3倍，也可认为该对象存在肝内结节(尤其是高级别不典型增生结节)，和/或处于肝炎向肝癌恶性转化的临界阶段。应理解的是，仅需检测pla2g6、lta4h和eps8l2中的一种的表达量，即可得出诊断结论；但在某些实施方案中，优选检测pla2g6、lta4h和eps8l2中的任意两种、甚至全部三种的表达量。下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非用于限制本发明。实施例中所提到的各种方法和材料，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和材料。一、材料和方法1、实验动物与试剂whv/c-myc转基因小鼠模型和正常对照c57bl-6品系小鼠饲养于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所实验动物中心，一切实验操作严格遵循动物伦理规范。共取5个不同时间点，包括出生后2个月、3个月、5个月、7个月、11个月，每个时间点各取5只whv/c-myc转基因小鼠及5只正常c57小鼠，断头处死后，分离出肝脏组织。用剪刀将肝脏组织剪碎，先用预冷的rpmi1640缓冲液小心洗涤组织小块，加入适量裂解缓冲液裂解细胞,而后用匀浆器对组织小块进行机械性破碎，进一步适量超声破碎细胞并溶解蛋白质，最后4℃，15000g离心60分钟去除dna、rna和不溶性细胞碎片等杂质，所得上清蛋白质溶液小心转移入新的eppendorf管中，采用bradford法(bio-rad)定量蛋白质浓度，根据所需上样量进行分装后，-80℃保存备用。所有缓冲液均用milli-q水(millipore,bedford,ma,usa)配制。尿素(urea)、溴酚兰(bromophenoleblue)、丙烯酰胺(acrylamide)、甲叉双丙稀酰胺(bis)、3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙铵]－丙磺酸(chaps)、三(羟甲基)氨基乙烷(tris)、十二烷基磺酸钠(sds)、过硫酸铵(ap)、四甲基乙二胺(temed)和bradford法定量液等试剂购自bio-rad公司(hercules,ca,usa)；乙二胺四乙酸二钾盐(edta)、苯甲基磺酰氟(pmsf)购自amresco公司(solon,oh,usa)；蛋白酶抑制剂(completeproteaseinhibitorcocktailtablets)购自roche公司(indianapolis,in,usa)。甲酸(formicacid,fa)购自sigma公司(st.louis,mo,usa)；hplc级乙腈(acn)和甲醇(methanol)购自fisher公司(fairlawn,nj,usa)；丙酮(acetone)和乙醇(ethanol)购自shanghaichemicals公司(shanghai,china)；测序级胰蛋白酶(trypsin，sequencinggrade)购自promega公司(madison,wi,usa)。2、小鼠肝脏蛋白质组的非标记定量(lfq定量)非标记定量(lfq定量)实验中，来源于每只小鼠的蛋白质样品进行溶液内酶解。首先，将蛋白质样品补加裂解缓冲液至总体积100μl，加入4μl的1mdtt，混匀后37℃反应2.5小时，然后加入10μl的1miaa，混匀后室温避光反应45分钟。接着用5倍体积的-20℃预冷的蛋白质沉淀液进行沉淀，-20℃静置过夜(16小时)。然后将样品14000g离心40分钟去上清，先用-20℃预冷丙酮清洗沉淀，14000g离心40分钟去上清，再用-20℃预冷的70％乙醇清洗沉淀，14000g离心40分钟后去上清，真空冻干机冻干样品。加入200μl的100mm的碳酸氢铵，充分振荡复溶蛋白，再加入12μg胰蛋白酶，37℃酶解反应4小时后再补加胰蛋白酶12μg，37℃烘箱振荡酶解过夜。酶解完成后用10kd孔径大小的超滤管(millipore)超滤，收取滤过液，冷冻干燥后-80℃保存。采用ph连续梯度洗脱体系(pcog)联合强阳离子交换色谱-反向色谱在线分离肽段混合物，并用lfq质谱仪(thermofinnigan)使用正离子模式采集原始数据。肽段洗脱物经esi喷雾离子源直接进入线性离子阱质谱检测，离子源参数设置为：电喷雾电压，3.0kv；毛细管温度，170℃。ltq质谱仪以agc控制下的data-dependent模式进行数据采集，全扫描质量范围为m/z400～1800，每个全扫描后取10个强度最高的峰进行串联质谱扫描，归一化碰撞能量设置为35.0％，动态排除设置为重复次数为2，重复容忍时间为30秒，动态排除时间为90秒。质谱采集到的原始数据首先利用bioworks软件(thermo-fisher)抽提dta信息，然后利用sequest软件进行数据库搜索，数据库使用实验室内部软件产生的小鼠ipi正反库(v3.82)，搜库参数设置如下：母离子质量偏差3da以内，子离子质量偏差1da以内，蛋白酶设置为胰蛋白酶，最大允许缺失酶切位点为1，固定修饰设置为半胱氨酸的羧甲基化，可变修饰设置为甲硫氨酸的氧化。sequest输出结果进一步使用实验室自主开发的buildsummary软件体系进行数据整合和假阳性控制。3、dnb算法基于数学模型理论推导要求的动态网络标志物预示系统状态即将转变的三个条件，本发明设计了相对应的实现算法，以便应用于针对特定科学问题的时序列高通量数据的研究中。为了可以通过一个综合考虑三个条件的强信号来检测关键临界点(criticalpoint)，本发明定义了以下一个整合指标(acompositeindex,ci)来设计算法：ci＝sdd×pccid/pccod其中，sdd代表着先导分子群(dominantgroup)或动态网络生物标志物(dnb)的所有分子在当下时间点浓度变化标准差的均值与来自对应参照(如，原始时间点的样本或同时间点的阴性对照样本)的浓度变化标准差的均值之比。pccid是分子群内部两分子间的相关性(pcc)分别在当下时间点与来自对应参照的均值之比；而pccod是分子群内部每个分子和分子群外部其相关分子的相关性(pcc)分别在当下时间点与来自对应参照的均值之比。值得注意的是，虽然这里使用ci值作为确定动态网络标志物和检测状态转变关键临界点的有效评价指标，但是也可以构建能综合满足三大条件的其他评价指标。基于整合指标ci来确定动态网络生物标志物的具体算法流程：(1)分子波动变化筛选(deviationtest)：在时间点t下，从同时间点的若干样本数据中，挑选出观测值(基因表达产物浓度，蛋白质含量等)变化波动比对应参照的观测值变化波动大(sd值高)的一组分子集gtd；(2)分子间相关性评价(intra-correlationtest)：在时间点t下，计算gtd中两分子间的相关性(pcc)，并以此划分在当下时间点内部分子间具有高相关性的子集gti；(3)分子与其他相关分子的相关性评价(inter-correlationtest)：在时间点t下，计算分子集gti中的每个分子与该分子群外的其他相关分子的相关性(pcc)，并以此筛选与分子集gti具有低相关性的外部分子集gtc；(4)动态网络生物标志物的确定(dnbtest)：基于前面三步在每个时间点筛选的候选分子集gti与其对应的外部分子集gtc，分别根据公式(3)计算出对应的ci值，利用显著性分析评出其中局部最高ci值所对应的分子集gti即是那个先导分子群(dominantgroup)或动态网络标志物(dynamicalnetworkbiomarker，dnb)，而且所对应的时间点即是状态即将转变的关键临界阶段(criticalpoint或pre-transitionstate)。值得注意的是，当观测的时间点较多的时候，可能存在多个状态转变过程，此时，可能会得到多个不同的标志物和关键临界阶段。参照该数学模型理论推导结果，当系统接近状态转变的关键临界阶段时，sdd和pccid/pccod应该都达到最大值。然而，值得注意的是，在大多数实际情况下，我们通常不能非常精准地获得状态转变的关键临界阶段的数据，仅能观察到临界点附近时间段的样本数据，因而sdd和pccid/pccod不能同时达到全局最大值。4、免疫组化实验本申请中免疫组化实验采用dab显色法。主要操作步骤如下：将石蜡包埋的组织蜡块切成4μm的切片；切片置于60℃烤箱1小时；切片脱蜡及水合(二甲苯一10分钟→二甲苯二10分钟→二甲苯三10分钟→无水乙醇5分钟→95％乙醇5分钟→85％乙醇5分钟→75％乙醇5分钟→去离子水5分钟)；将切片置于浓度为3％的过氧化氢甲醇溶液中，室温静置20分钟，去过氧化物酶；去离子水洗涤5分钟，重复三次；抗原修复(将切片放置于酸性修复液中，大火煮至沸腾后，调至小火，继续煮2分钟，停火待其自然冷却)；去离子水洗涤5分钟，重复三次；向切片上滴加浓度为1％的bsa，置于37℃孵箱封闭30分钟；洗净封闭液，直接滴加相应一抗，置于湿盒中，4℃冰箱过夜；室温环境下复温15分钟；使用pbs缓冲液洗涤5分钟，重复四次；滴加对应二抗(anti-rabbit-hrp，antibodydignosticainc.)至切片上，方置于湿盒中，37℃孵箱孵育45-60分钟；用pbs缓冲液洗涤5分钟，重复四次；运用dab显色液显色3-10分钟，镜下观察，待显色成功后，去离子水终止显色；去离子水洗脱两次，每次5分钟；苏木素复染10分钟，后续操作通he染色；取出切片在自来水中涮洗一两次，之后将其放入盐酸乙醇溶液中涮洗2-3次；在流动的自来水冲洗20-30分钟，取出切片，室温沥干；去离子水洗涤5分钟；在95％乙醇、100％乙醇一、100％乙醇二、二甲苯一中各洗涤10分钟；在二甲苯二和石碳酸中各5分钟；最后滴加适量中性树脂，封片观察。一抗稀释比例：lta4h(abcamab133512)：1:400；eps8l2(abcamab209339)：1:100；pla2g6(abcamab103258)：1:100。实验完成后，使用aperioatrurbo扫描仪(leicabiosystems)及配套软件进行图像产出与图像分析。5、小鼠肝脏蛋白质组的体外稳定同位素标记定量(tmt定量)数据的采集体外稳定同位素标记定量(tmt定量)实验中，每个时间点取来源于同时间点小鼠的肝脏蛋白质等量混合样品各200μg，并采取滤膜辅助酶解方法，酶解流程为：首先加入uabuffer(8murea,0.1mtris/hclph8.5)，5000g离心约1h，重复一次；然后加入50mmiaa(用ua配制)，暗处室温放置30min，然后5000g离心1h；再分别用0.5mteab溶液洗涤三遍；最后按照1:50比例加入trypsin，置于37℃摇床或恒温箱酶解16-20h。酶解完成之后，收取肽段用于tmt，两组tmt试剂分别标记转基因小鼠或对照小鼠的肝组织酶解产物，而后分别混合两组实验的不同标记样品并冷冻干燥。再采用angilent3100offgelfractionator系统(agilenttechnologies)进行分级，50μa恒流，48h左右收取肽段，两个样品每个分级为6个组分，共12个样品进行lfq-orbitrapvelos质谱检测(thermofinnigan,sanjose,ca)，每个样品并重复上样3次。反相柱为实验室自制喷针反相柱，反相洗脱体系的洗脱液为0.1％甲酸的水溶液(a)和0.1％甲酸的乙腈溶液(b)，流速为250nl/min，采用4％b～30％b的线性梯度。从反相柱上洗脱下的肽段进入线性离子阱-静电场轨道阱组合质谱ltqorbitrap-velos质谱仪进行分析，data-dependent的数据采集模式，每张一级谱图后紧跟10张二级谱图，动态排除设置为90秒，母离子碎裂模式采取hcd模式，一级谱图和二级谱图分辨率分别设置为30000和-7500。质谱采集到的原始文件用maxquant1.3.0.5软件的默认参数进行分析，采用的数据库是uniprotmouse数据库(2012年6月下载)。搜库参数设置如下：蛋白酶设置为trypsin，选择tmt标记肽段筛选，固定修饰设置为半胱氨酸的羧甲基化，可变修饰设置为甲硫氨酸的氧化、蛋白质n端乙酰化，蛋白质和肽段的假阳性率均设置为0.01。二、实验结果1、肝癌发生发展过程中whv/c-myc转基因小鼠蛋白质表达水平的动态变化为了获得适于本工作研究目的的高通量蛋白质组数据，如图1所示，本发明在whv/c-myc转基因小鼠在肝癌发生发展过程中所经历的不同病理阶段，设计了五个相应的采样时间点(小鼠出生后的第2、3、5、7和11个月)；在每个时间点下，对同样饲养条件下的5只whv/c-myc转基因小鼠和5只作为参照的wt-c57bl/6小鼠，分别收集了它们的肝脏组织；随后，对每一份肝脏组织样品，经过蛋白质分离纯化并酶解成肽段，非标记(label-free)肽段经过多维液相色谱分级后使用串联质谱(lc-ms/ms)检测(zhouh、daij、shengqh等，afullyautomated2-dlc-msmethodutilizingonlinecontinuousphandrpgradientsforglobalproteomeanalysis，electrophoresis2007，28:4311-4319)，获得最终定量蛋白质数据。在这批定量数据中，通过运行了570次lc-ms/ms检测循环，总共鉴定到高精准度(以0.4％的肽段的假阳性检出率(falsediscoveryrate，fdr)为标准)的8713种蛋白质的42689条不同肽段；但考虑到后续计算和分析的准确性和稳定性，本发明仅选取了在超过总数(总计五个时间点50个样本，其中25只whv/c-myc转基因小鼠和25只wt-c57bl/6小鼠)一半的样本中都鉴定到的3372个蛋白质(即，这些蛋白质在超过25只小鼠肝脏样品中被定量)。2、肝炎向肝癌恶性转化的关键临界阶段的鉴定为了精准地确定炎癌恶性转化的关键临界阶段，本发明使用了寻找动态网络生物标志物(dynamicalnetworkbiomarker，dnb)的方法分析这套时序高通量蛋白质组数据。通过使用本文所述的dnb算法分析后，本发明发现了一个ci值强信号出现在5月龄这个时间点，这表明此时whv/c-myc转基因小鼠正处于肝炎向肝癌恶性转化的临界阶段(即，它预警了炎癌恶性转化即将发生)。这一结果与whv/c-myc转基因小鼠在0至11月龄这段时间上粗略划分的肝脏病理症状相一致。从动态网络生物标志物鉴定的理论推导所要求同时满足的三个标准(参见chenl等，scientificreports2012)来看，组成这个先导分子群的48个蛋白满足了分子间相关性升高(用pccid来衡量)、分子与其他非先导分子群的分子相关性降低(用来pccod衡量)和分子表达波动最大(用sdd来衡量)(见图2)。同时，为了更直观地观察动态网络生物标志物(dnb)在这五个时间点网络结构和表达波动的动态变化，本发明基于实际测得的蛋白质组数据通过计算相应的皮尔森相关系数(pcc)构建蛋白质共表达网络，而非基于数据收集而得的小鼠已知分子间相互作用网络(见图3)。如图3所示，在第五个月(即预测到的炎癌恶性转化的临界阶段)，与参照小鼠相比后，组成dnb的蛋白(排布于内环上的点表示)间相关性升高(内环中点间连线呈红色)而内环的dnb蛋白与外环的其他共表达蛋白的相关性显著降低(内环点与外环点间连线呈蓝色)，同时内环dnb蛋白的表达波动剧烈(内环的点呈红色)。此后，为了从组织病理形态判断上述的炎癌转化关键临界点预测的准确性，本发明对每个时间点采集whv/c-myc转基因小鼠和同龄的wt-c57bl/6小鼠的肝组织样本，分别制备组织切片并对其用苏木精和伊红(hematoxylinandeosin，he)进行染色(见图4)。如图4所示，2月龄的转基因小鼠的肝脏组织形态与参照的正常小鼠相似，都有呈现出经典的肝小叶结构(如，肝细胞以中央静脉为中心呈发射状有序排布，形成肝细胞板)；3到5月龄的转基因小鼠肝组织形态出现肝小叶界板断续间隔并伴随局部碎屑状坏死现象，这表明已出现炎症反应；7月龄的转基因小鼠肝组织则出现桥形坏死且大片坏死区域伴随着肝血窦扩张，这表明初期肝癌病征出现；转基因小鼠11月龄时，肝小叶细胞板结构破坏，中央静脉变窄，肝细胞体积增大，细胞核增大且染色加深，出现空泡，这些现象表明肝组织已发生癌变。这些肝组织病理形态结果表明5月龄的转基因小鼠处于炎癌转化的关键临界期。3、动态网络生物标志物相关功能网络(dnb-associatednetwork)在炎癌转化过程中的翻转现象本发明先前的工作已表明，动态网络生物标志物(dnb)作为一组对状态即将转变具有预警作用的先导分子群，虽然与传统生物标志物(如，差异表达蛋白deps或差异共表达蛋白对dces)不同，但却与它们存在着功能协同关系——即，dnb被认为是在状态即将转化时期发挥诱导作用(inducer或regulator)的分子群，而deps(或dces)是状态改变的生物学功能执行者或体现者。为了探索dnb成员蛋白和deps及dces之间存在的协同关系，根据小鼠已知的分子间相互作用关系的背景网络(数据收集于kegg，biogrid，tred数据库)，本发明通过整合dnb成员蛋白及其一阶邻居蛋白(或功能性连接蛋白)构建dnb相关网络(dnb-associatednetwork，该网络总共涉及164个蛋白和183条边)。然后分别对网络中与差异表达蛋白或差异共表达蛋白对重合的点或边进行统计，并使用超几何检验评估其重合显著性。该统计结果表明，在炎癌转换过程中dnb与差异表达蛋白(见图5，a)和差异共表达蛋白对(见图5，b)之间存在显著的调控关系；同时，也间接地表明该dnb相关网络在炎癌转换过程中发挥了重要作用。然后，本发明绘制相应的网络图用以直观地察看，对于转基因小鼠来说，在炎癌恶性转化过程中，dnb相关功能网络(dnb-associatednetwork)中的蛋白表达量(见图5，c)和dnb与其一阶邻居蛋白间调控(或共表达)关系(见图5，d)的动态变化情况。从图5(c)可观察到，在经历炎癌恶性转化过程中，与dnb有功能性连接的deps其表达水平出现了显著的翻转现象——也就是说，对于转基因小鼠来说，从3(或5)月龄到5(或7)月龄之间，某个dep的表达量发生了从低(高)到高(低)的显著变化。而对于dnb蛋白所涉及的差异共表达关系(即dnb蛋白相关的dces)来说，从图5(d)可看出，在炎癌恶性转化过程中，其调控(或共表达)关系也发生了显著的翻转——即，对于转基因小鼠来说，从3(或5)月龄到5(或7)月龄之间，dnb蛋白与某个蛋白的相关性发生了从正(负)到负(正)的显著变化。综上所述，对于转基因小鼠来说，在炎癌恶性转化过程中，164个dnb的一阶邻居蛋白中有75个蛋白的表达量发生显著变化以及183条dnb的功能性连接边中有86条出现翻转现象(图5，c和d)，这不仅强烈地暗示了dnb成员蛋白(尤其是，pla2g6，lta4h和/或eps8l2)可能通过调控或影响功能性相关的蛋白以介导炎症向癌症恶性转化，而且也可能在临床应用方面为炎癌恶性转化的早期诊断提供了精准的候选分子标志物。4、tmt标记定量对非标记定量蛋白质数据可靠性验证为了验证分析的数据及其结果的可靠性，本发明采用了技术重复方式来批量地检验炎癌恶性转化过程中蛋白质组变化趋势的真实情况，即本发明采用精准度更高的tmt标记定量方法对同批小鼠样本的蛋白质组进行重定量分析。与之前计算使用的非标记定量的样品检测策略不同，本次验证不再是对每只小鼠的肝组织样品进行定量分析，而是为了消除小鼠个体差异带来的影响，对每个时间点的同类小鼠样品进行等量混合成一份样本后，再使用tmt标记定量技术进行分析。如图6所示，在炎癌转化过程中可能发挥了重要作用的dnb相关网络(dnb-associatednetwork)所涉及的蛋白pla2g6、lta4h和eps8l2，在两套数据中表达量水平变化趋势的一致性非常高，具有很高的可靠性。5、pla2g6、lta4h和eps8l2在炎癌转化过程中发挥了重要的生物功能作用虽然已有不少关于炎症促癌机制的假说被提出，但是慢性肝炎向肝癌恶性转化的机制仍未完全明确。为进一步揭示炎癌恶性转化的潜在机制，一方面，本发明重点分析了dnb相关网络所富集的免疫相关功能的异常动态变化。dnb蛋白pla2g6所参与的fcgammar介导的吞噬作用在炎癌即将恶性转化前期(即3到5月龄之间)功能出现异常；而且，本发明发现dnb相关功能网络(尤其是，pla2g6及其相关的差异表达蛋白deps和差异共表达蛋白对dces)所涉及的脂质代谢和trp通道对炎症介质的调控交互影响，可能导致了后续炎症反应异常和肝功能失调以至于最终促发了炎症向肿瘤恶化。同时，本发明鉴定到的对状态即将变化有预警作用的dnb蛋白成员——pla2g6正好是受转基因小鼠模型的致癌驱动者——c-myc转录调控(图6)，这说明基于本发明开发的数学模型找到的dnb离致癌驱动源非常近以至于能更及时有效地预警炎癌转变即将发生的状态。此外，由于本发明认为dnb蛋白作为先导分子优先对系统状态即将变化做出反应，因此，在所涉及的生物途径中以pla2g6影响的生物代谢出发，通过其下游的重要的脂质代谢分子的级联信号传递进而引发炎症反应和肝脏解毒功能的有序异常。在lox通路中，本发明也发现另一dnb成员lta4h(白三烯a4水解酶)参与到花生四烯酸代谢合成白三烯(lt)中。lta4h是促炎酶，生成白三烯b4(ltb4)(snelgrove等，2010)，后者是一重要的炎症介质，能经由mapk和pi-3激酶通路刺激人胰腺癌细胞的生长(tong等，2005)。令人感兴趣的是，转基因小鼠中，在3月到7月这个关键时期，lta4h具有截然相反的表达模式和直接调节模式，但到11月时它的表达被下调，因此lta4h的作用尚不清楚。最近的研究阐明了lta4h的双重作用，即通过产生ltb4而抵抗促炎作用，以及通过pro-gly-pro(pgp)降解而实现抗炎作用(snelgrove等，2010)。本文的结果提示了lta4h的抗炎作用，因为在11月龄的转基因小鼠中，特异性切割肺中的胶原蛋白、从而产生嗜中性趋化肽pgp的脯肽酰内肽酶(prep)(snelgrove等，2010)被上调。所有这些结果提示发现ltla4h的双重功能在预防炎症转化和涉及新治疗策略方面的重要性。同样令人感兴趣的是，本发明发现另一dnb成员eps8l2也参与到c-myc和pla2g6两者起始于生长因子刺激的mapk通路的tf效应的调节中，该通路主要在肌动蛋白细胞骨架的膜波动与重构中起重要作用。一些c-myc靶标如dkc1、mapk3也参与其中。6、组化实验结果由图5可观察到dnb相关网络在炎癌转化临界阶段(whv/c-myc小鼠5月龄)之前和之后的显著翻转现象，它提示pla2g6、lta4h和eps8l2对炎癌恶性转化的早期预警作用可能在临床应用方面有很大前景。高级别不典型增生结节(hgdn)是目前所公认的肝癌的癌前病变，其被定义为“肝组织有异型增生但又未达到恶性肿瘤标准，具有高度恶性潜能的，直径1mm以上的不典型增生结节”。购买抗体并在人hgdn组织中完成了本文所述的组化实验。结果如图7－9和下表1－2所示。其中，表1显示了部分病人的年龄、性别以及健康状况，图7和8分别显示编号为s2-136902患者的抗体组化染色效果，图9显示编号为s10-120093患者的抗体组化染色效果，表2汇总了11名患者的免疫组化数据。这些结果显示，在正常肝脏组织、hgdn和癌组织中存在比较明显的表达差异。其中，lta4h、pla2g2和eps8l2三个蛋白在hgdn组织中表达上调，高于对应癌(hcc)组织和正常肝组织。其中，值得注意的是，虽然pla2g6的表达量在组织切片显示结节部位出现局部升高现象，但在全局的肝组织(即非特定结节区域)获得的高通量数据中，pla2g6的表达量在临界阶段或结节期明显降低(图6)，这种现象可能是该蛋白质调控机制复杂导致的。lta4h和eps8l2在全局肝组织(图6)和特定结节区域的检测都保持一致。表1表2注：“正常”表示该患者的正常肝脏组织；“hgdn”表示来自该患者的hgdn的肝脏组织；“肿瘤”表示来自该患者的肝脏肿瘤的组织；“/”表示该样本蜡块上无hcc组织。“-”表示阴性。“+”表示阳性，其中每增加一个“+”表示表达量至少升高1倍。当前第1页12当前第1页12