用于测定烤烟叶挥发油溶液浓度的线性标准曲线建立方法与流程

本发明属于烟叶挥发油测定技术领域，尤其涉及一种用于测定烤烟叶挥发油溶液浓度的线性标准曲线建立方法。

背景技术：

烟叶挥发油是具有挥发性的植物性油状物，其成分包括：醇类、酯类、酸类、醛类、酮类、酚类、醚类和萜烯烃、芳香烃类等许多成分，其中萜类、烯类等物质能吸收紫外光。烟叶挥发油易溶于有机溶剂、能随水蒸气蒸馏挥发而不被破坏，可以通过蒸馏萃取的方法提取获得。烟叶挥发油是体现烟叶优良商品特性的重要物质。了解烤烟叶中挥发油含量的高低对于认识烟叶品质有重要帮助。“称重法”是目前应用较多的挥发油定量方法，其过程是将烟叶挥发油经水蒸气蒸馏和有机溶剂萃取后进行脱水干燥和有机溶剂挥发，最后称出残余物的重量。具体步骤如下：

1)首先用同时蒸馏萃取法获得溶解于二氯甲烷中的烟叶挥发油并将其转移到已知重量的容器内(重量w1)；

2)在室温常压条件下挥发或在减压条件下蒸馏使二氯甲烷溶剂挥发散尽；

3)称量出容器与挥发油的共同重量(重量w2)；

4)用“w2-w1”计算出提取得到的挥发性半挥发性物质量。

但上述方法都具有测定周期时间长、操作环节干扰因素较多、测定结果重复性欠佳等不足。紫外分光光度法在多种植物挥发油研究中有较为广泛应用，表现出简便、快速、准确、低成本等优势；但利用紫外分光光度法测定烤烟叶挥发油溶液浓度的方法尚未见报道。

综上所述，现有技术存在的问题是：目前的“称重法”烟叶挥发油测定方法的不足在于：工作量大、工作时间周期长通常需要8个小时以上，工作环节多、易产生误差。原因如下：

步骤1)和3)的称重操作都涉及到物体的恒重测定，需要对物体进行烘干除水，此操作耗时2-3小时、期间易发生控温不当造成挥发油受热挥发、导致重量损失；若采用在常温下、装有硅胶干燥剂的干燥器中进行平衡干燥法除水，则耗时在24小时左右。

其步骤2)中若以“室温常压条件下使二氯甲烷挥发散尽”则耗时可长达24小时，测定周期时间长；若以“减压条件下蒸馏使二氯甲烷挥发散尽”则易使挥发油组分挥发、导致重量损失。

因此，采用“称重法”测定挥发油时必须设置多个重复样本才能有效降低测定误差，但这样会大大增加工作量。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于测定烤烟叶挥发油溶液浓度的线性标准曲线建立方法。

本发明是这样实现的，以分光光度法测定出不同浓度烤烟挥发油溶液的紫外光谱，找出特征吸收峰所在的波长范围224nm-245nm；再以梯度溶液的浓度作自变量、以其在224nm-245nm内各波长下对应的紫外吸光度作因变量，求二者间的线形式拟合模型，发现当以波长为239nm处的吸光度为因变量时，其拟合模型决定系数r²最高，宜作为标准曲线；从而确定了建立最佳线性拟合模型的条件。

所述用于测定烤烟叶挥发油溶液浓度的线性标准曲线建立方法包括以下具体步骤：

步骤一，提取烤烟挥发油：以二氯甲烷作为溶剂、用同时蒸馏萃取法提取烤烟挥发油，经无水硫酸钠脱水和室温常压条件下二氯甲烷溶剂挥发后，再将待测物放入常温下、装有硅胶干燥剂的干燥器中24小时、以去除其微量水，最后称得烤烟挥发油重量；

步骤二，梯度溶液的制备：将上步所获得的烤烟挥发油用二氯甲烷进行复溶、定容得到母液并计算出其准确的浓度，母液再经分取、稀释、定容，得到由5-6个不同浓度烤烟挥发油溶液组成的梯度溶液；

步骤三，测定梯度溶液的od239：用紫外分光光度计逐一测定上步中配制的梯度溶液在239nm波段处的吸光度；

步骤四，建立线性标准曲线：将各烤烟叶挥发油梯度溶液的浓度作为自变量、对应的od239作为因变量，求得二者的线性回归相关曲线；以此作为标准曲线可用于求得烤烟挥发油梯度溶液的浓度。

进一步，所述用于测定烤烟叶挥发油溶液浓度的线性标准曲线建立方法以各梯度溶液的浓度作自变量、以其在波长239nm处的吸光度od239作因变量，求二者间的线性回归拟合模型y＝ax+b，作为测定烤烟叶挥发油溶液浓度的标准曲线。公式中

y：挥发油溶液在239nm处的吸光度(因变量)

x：挥发油溶液的浓度(自变量，单位mg/ml)

a：线性回归方程的斜率(常数)

b：线性回归方程的截距(常数)

本发明的优点及积极效果为：按此法制备好测定烤烟叶挥发油溶液浓度的线性标准曲线后，当要测定其它烤烟叶样品的挥发油时，则无须对每个提取得到的挥发油溶液进行干燥和称重操作，只须用紫外分光光度计测定其239nm处的吸光度、再将其代入标准曲线就可求出其浓度，进而求得挥发油的物质量。由此可使每个烟叶样品的挥发油含量测定工作时间缩短少则5-6小时以上，可提高工作效率约200％；同时可以减少烘干和称重操作所引起的误差。

附图说明

图1是本发明实施例提供的用于测定烤烟叶挥发油溶液浓度的线性标准曲线建立方法流程图。

图2是本发明实施例提供的标准曲线示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的用于测定烤烟叶挥发油溶液浓度的线性标准曲线建立方法包括以下步骤：

s101：提取烤烟挥发油：以二氯甲烷作为溶剂、用同时蒸馏萃取法提取烤烟挥发油，经脱水和二氯甲烷溶剂挥发、称得烤烟挥发油重量；

s102：梯度溶液的制备：将上步所获得的烤烟挥发油用二氯甲烷进行复溶、定容得到母液并计算出其准确的浓度，母液再经分取、稀释、定容，得到由5-6个不同浓度烤烟挥发油溶液组成的梯度溶液；

s103：测定梯度溶液的od239：用紫外分光光度计逐一测定上步中配制的梯度溶液在239nm波段处的吸光度；

s104：建立线性标准曲线：将各烤烟叶挥发油梯度溶液的浓度作为自变量、对应的od239作为因变量，求得二者的线性回归相关曲线；以此作为标准曲线可用于求得烤烟挥发油梯度溶液的浓度。

本发明实施例提供的用于测定烤烟叶挥发油溶液浓度的线性标准曲线建立方法包括以下步骤：

(1)按同时蒸馏萃取法提取调制后烤烟叶的挥发油；

(2)用二氯甲烷配制至少5种浓度的烤烟挥发油梯度溶液；

(3)测定挥发油梯度溶液在239nm波段处的吸光度；

(4)以各梯度溶液的浓度作自变量、以其在波长239nm处的吸光度(od239)作因变量，求二者间的线性回归拟合模型(y＝ax+b)，以此作为测定烤烟叶挥发油溶液浓度的标准曲线。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。

本发明实施例提供的用于测定烤烟叶挥发油溶液浓度的线性标准曲线建立方法包括以下步骤：

(1)提取烤烟挥发油：将烟叶置于40℃烘箱内烘干，用粉碎机粉碎；分别取上中下5g混合烤烟样品、150ml蒸馏水和20g氯化钠加入同时蒸馏萃取装置一端，另一端加入25ml二氯甲烷于有机溶剂容器中进行蒸馏萃取，保持微沸，萃取时间3h；回收二氯甲烷，加入适量的无水硫酸钠干燥过夜，过滤，滤液用已称重的具塞刻度试管(50ml)收集，去塞，于25℃下挥干溶剂后，用天平精确称取此时试管重量，得到烟叶挥发油重量(0.036g)。

(2)梯度溶液的制备：将上述烟叶挥发油(0.036g)用二氯甲烷复溶后无损转移到10ml容量瓶中定容，作为母液(7.2mg/ml)。从母液中精密分量取不等量的6份，用二氯甲烷在6个容量瓶中准确稀释成6种浓度(1.440mg/ml、0.960mg/ml、0.720mg/ml、0.480mg/ml、0.360mg/ml、0.288mg/ml)。

(3)测定梯度溶液的od239：用紫外分光光度计对上步中配制的梯度溶液逐一测定239nm波段吸光度。

表1不同浓度下烤烟挥发油在od239吸光度

(4)建立线性标准曲线：求出烤烟叶挥发油溶液浓度与所测得的od239值做线性相关回归分析，得到线性标准曲线，如图2所示。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。