本发明涉及分光光度法检测领域，特别是涉及一种基于吸光度的高准确度核酸浓度测定方法。
背景技术：
计量是实现单位统一、量值准确可靠的活动，研究建立高准确度的测量方法是计量学研究的重要内容之一。含量(浓度)描述了单位质量或体积中被测对象的数量，是化学与生物计量中的基本量值。紫外分光光度法是测量核酸含量(浓度)的常用方法，它基于核酸在紫外区的光吸收根据朗伯比尔定律对核酸含量(浓度)进行测定，朗伯比尔定律的数学表达式如下：
a＝εlc(1)
其中：
a——吸光度；
ε——吸光系数；
l——光程；
c——浓度。
在测定时，通常选取260nm核酸最大吸收波长处进行测定，并根据1个吸光度单位(1od)约等于50μg/ml的换算系数，对核酸进行定量。这种测定方式虽然简单，但是定量的误差较大。
为了实现核酸含量的准确测定，可进一步采用核酸标准物质对未知样品的核酸浓度进行测定，首先将标准物质用合适的缓冲溶液稀释成一定的梯度比例，然后分别测定各个不同梯度水平下核酸标准物质的吸光度，据此绘制标准曲线。接着测定未知样品的吸光度，并根据标准曲线计算出待测样品的浓度。这种测定方式采用了标准物质进行量值的传递，大大提高了核酸含量测定的准确度，但是该方法在设计时没有将不确定度的影响考虑进去，同时采用标准曲线的计算方式导致将不同浓度梯度水平的线性误差引入到了测量结果中，因此要实现基于吸光度的核酸浓度的准确测定，必须解决上述两个问题。
技术实现要素：
本发明针对在方法设计中未考虑不确定影响及标准曲线法定量引入了过大的线性拟合的不确定度的问题，建立了一种基于吸光度测定的高准确度核酸定量方法，包括如下步骤：
(1)准备核酸标准物质和核酸样品，以及对应的空白缓冲溶液；
(2)用空白缓冲溶液将核酸标准物质进行梯度稀释，以空白缓冲液作为空白，采用紫外-可见分光光度计或微量紫外-可见分光光度计分别测定稀释后的各个浓度水平标准物质以及待测样品的吸光度，使得样品的吸光度位于各个浓度水平标准物质吸光度的中值附近；如果样品浓度较高，可用空白缓冲液进行稀释，通过重量法称量的方式确定准确的稀释比；将测定的各个水平核酸标准物质溶液的吸光度与其对应浓度进行线性拟合，根据标准曲线和样品的吸光度，计算出样品的初测浓度c0；
(3)根据初测浓度，用核酸标准物质配制k1c0和k2c0的一对标准采用括号法对核酸样品浓度进一步测定，其中0.90≦k1≦1.00，1.00≦k2≦1.10；根据配制过程，计算出这一对标准品各自的标准不确定度u1和u2，并进一步计算出测定结果的合成标准不确定度uc；
(4)求解非线性规划minuc，使其满足0.90≦k1≦1.00，1.00≦k2≦1.10的条件，得到k1和k2的具体值；
(5)根据计算出的k1和k2的值，配制出高标和低标，并采用括号法对样品进行测定，得到样品的准确结果c。
本发明所述的基于吸光度的高准确度核酸浓度测定方法，其中，所述步骤(1)中：当核酸标准物质与待测样品溶液基体相同时，测定时采用与之对应的缓冲溶液作为空白；当核酸标准物质与待测样品溶液基体不同时，测定时分别采用标准物质的空白溶液和样品的空白溶液进行吸光度0点校正。
本发明所述的基于吸光度的高准确度核酸浓度测定方法，其中，所述步骤(2)具体要求包括：采用最小二乘法或加权最小二乘法进行线性拟合得到标准曲线，且线性相关系数r≧0.999；绘制标准曲线的数据点个数不少于5个并且在最低和最高浓度之间均匀分布；待测样品吸光度位于标准曲线的中段附近。
本发明所述的基于吸光度的高准确度核酸浓度测定方法，其中，所述步骤(3)采用括号法测定并计算样品浓度及标准合成不确定度计算公式如下：
公式1为
公式2为
本发明所述的基于吸光度的高准确度核酸浓度测定方法，其中，所述步骤(4)具体包括：求解非线性规划：minuc＝f(k1,k2)，0.90≦k1≦1.00，1.00≦k2≦1.10，得到k1和k2的具体值。
本发明的基于吸光度测定的高准确度核酸测定方法与现有技术相比，其突出效果在于：
(1)本发明建立的方法严格按照gum不确定度评定标准的要求，对基于吸光度测定的核酸定量方法的不确定度进行了详细的考察，并在方法优化的环节按照建立的数学模型，以取得最小的测量不确定度为目标，进行优化，从而保证了检测结果的不确定度能够达到最小，即测量结果具有最高的准确度。
(2)传统的基于吸光度的核酸定量方法采用标准曲线进行定量，过多的引入了在其它浓度水平的线性误差。本发明的方法采用括号法对样品进行测定，通过在微小区间内不断逼近样品的方式，获得高准确度的定量结果。
下面结合具体实施例对本发明的高准确度技术作进一步说明。
具体实施方式
实施例
一种基于吸光度测定的高准确度核酸定量方法，包括如下步骤：
(1)取某质粒标准物质，其储备液浓度为50.0ng/μl，相对扩展不确定度为3％，k＝2；同时取待测核酸样品溶液，以及对应的空白缓冲溶液。
(2)用空白缓冲溶液将核酸标准物质进行梯度稀释，得到50.0、40.0、30.0、20.0、10.0和0ng/μl的质粒dna标准溶液，以空白缓冲液作为空白，采用紫外-可见分光光度计测定稀释后的各个浓度水平标准溶液以及待测样品的吸光度，将标准溶液的吸光度与其对应的浓度进行线性拟合，将样品的吸光度带入到标准曲线方程中，得到样品的初测浓度为20.1ng/μl。
(3)对以下公式进行简化：
考虑到高标和低标的空白溶液是一样的，因此它们的吸光度近似相等，即存在：
ab＝alb＝ahb
同时考虑到高标和低标与样品的浓度非常接近，因此在这个小的区间内存吸光度和溶液的浓度之间遵循朗伯比尔定律，即存在：
al＝k1c0
ah＝k2c0
将以上两式代入到公式(3)中，得到：
根据(2)式和(4)式，可以得到测定结果不确定度uc2为：
将uc0＝0.21×3.5％、ua＝0.0025、a＝0.412、c0＝0.21代入(5)中，得到测定结果不确定度uc2为：
(4)求解非线性规划minuc2，使其满足0.90≦k1≦1.00，1.00≦k2≦1.10的条件，得到k1和k2的具体值分别为0.918和1.018。
(5)根据计算出的k1和k2的值，采用重量法配制出计算出的低标和高标，采用括号法对样品进行测定，得到样品的准确结果为0.202ng/μl，重复20次测定，测定结果的相对标准偏差为0.3％。在此条件下的测量结果具有最小的测量不确定度。
为突出本发明实施例的突出效果，进行以下普通外标法的对比例试验：
对比例
(1)取某质粒标准物质，其储备液浓度为50.0ng/μl，相对扩展不确定度为3％，k＝2；同时取待测核酸样品溶液，以及对应的空白缓冲溶液。
(2)用空白缓冲溶液将核酸标准物质进行梯度稀释，得到50.0、40.0、30.0、20.0、10.0和0ng/μl的质粒dna标准溶液，以空白缓冲液作为空白，采用紫外-可见分光光度计测定稀释后的各个浓度水平标准溶液以及待测样品的吸光度，将标准溶液的吸光度与其对应的浓度进行线性拟合，将样品的吸光度带入到标准曲线方程中，计算得到样品浓度为20.1ng/μl。重复20次测定，测定结果的相对标准偏差为3.2％。
以上对比例和实施例进行试验结果对比，得出以下结论：
(1)相对于普通的外标法定量，该方法具有较高的测量准确度和测量重复性。
(2)方法中使用的标准品的浓度是通过求解非线性规划方程进行最优化处理的，因此在优化的条件下测量结果具有最小的不确定度。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。