一种利用牛乳检测奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力的方法与流程

本发明涉及一种利用牛乳检测奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力的方法。

背景技术：

乳品质主要指乳蛋白率和乳脂率，是牛乳的重要经济指标。优良的牛乳具有较高的乳蛋白率和乳脂率，具有更好的乳品加工特性，因此市场价格也较高。在同样的饲养营养环境下，不同品种奶牛和同一品种奶牛的不同个体所生产的原乳的乳蛋白率和乳脂率却相差很大，乳腺合成乳蛋白、乳脂肪的能力是反映不同奶牛品种和个体乳腺的产乳品质差异的重要指标。乳腺合成乳蛋白、乳脂肪的能力由乳腺泌乳的基本单元乳腺上皮细胞中调控乳蛋白和乳脂肪合成的关键基因决定，乳腺细胞中这些基因表达的蛋白是重要的信号分子，能够响应奶牛机体刺激乳腺泌乳的氨基酸等营养信号、催乳素和雌激素等激素信号、生长因子等信号，调控乳蛋白和乳脂肪形成。这些功能基因表达的差异反映了乳腺上皮细胞合成乳蛋白、乳脂肪能力的差异。

因此筛选乳蛋白率和乳脂率高的奶牛品种和个体是奶牛营养和遗传育种的重要任务之一。目前尚没有筛选乳蛋白率和乳脂率高的奶牛品种和个体的有效方法。通过检测原乳的乳蛋白率和乳脂率可以部分反映奶牛品种和个体生产原乳品质的差异，但由于乳蛋白率和乳脂率的差异除与乳腺的合成乳蛋白、乳脂肪等的能力有关外，还可能与泌乳量的不同、奶牛瘤胃微生物的代谢差异、肝脏生物转化的差异、所取牛乳样品的差异等有关，因此单纯检测原乳的乳蛋白率和乳脂率难以准确和全面地反映不同奶牛品种和个体的乳腺的合成乳蛋白和乳脂肪的能力。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现阶段检测原乳的乳蛋白率和乳脂率方法不能准确和全面地反映不同奶牛品种和个体的乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力的问题，提供了一种利用牛乳检测奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力的方法。

本发明一种利用牛乳检测奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力的方法：一、牛乳的预处理：取牛乳于-80℃冻存备用，得到牛乳样品；二、牛乳外泌体的制备：将牛乳样品于0-4℃、2000-2500rpm的条件下离心25-30min，去除沉淀的细胞和漂浮的脂肪球，得到脱脂乳；将脱脂乳于0-4℃、12000-13000rpm的条件下离心30-40min，取上清；将上清于0-4℃、100000-110000rpm的条件下离心2-2.5h，取沉淀；将沉淀用0.01-0.02m的pbs溶解，得到外泌体初次溶液；将外泌体初次溶液于0-4℃、100000-110000rpm的条件下离心2-2.5h，取沉淀，将沉淀用0.01-0.02m的pbs溶液溶解，得到外泌体溶液，检测外泌体溶液纯度，合格后进行下一步操作；其中牛乳样品与0.01-0.02m的pbs溶液的体积比为1:20；三、取外泌体溶液15-20μl用于westernblotting检测；检测蛋白为：glyrs和cap1，根据westernblotting的灰度扫描结果，利用image-proplus图像分析软件进行分析，得到glyrs含量和cap1含量；四、奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力＝glyrs含量/cap1含量，glyrs含量/cap1含量＞0。

外泌体(exosome)是活细胞分泌的来源于晚期核内体(也称为多囊泡体)的膜性囊泡，直径约为30-150nm。外泌体可通过其携带的蛋白质、核酸、脂类等来调节受体细胞的生物学活性，已发现不同外泌体中共计4万多种蛋白质、超3千种microrna、超3千种mrna。乳腺上皮细胞能够分泌外泌体到乳中，甘氨酰trna合成酶(glyrs)和camp结合蛋白1(cap1)在乳外泌体中存在，且和乳腺上皮细胞中的水平正向相关。通过检测乳中外泌体glyrs和cap1含量，结合对原乳的乳蛋白率和乳脂率的分析，可以反映乳腺合成乳蛋白和乳脂肪的能力。

目前外泌体提取最常用的方法是超速离心法，此种方法得到的外泌体量多，但是纯度不足。本发明利用超速离心法制备乳中外泌体，并利用肿瘤易感性基因101(tumorsusceptibilitygene，tsg101)、葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulatedprotein78，grp78)、血管性血友病因子(vonwillebrandfactor，vwf)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，gapdh)进行外泌体纯度检测。本发明首次发现了甘氨酰trna合成酶(glyrs)和camp结合蛋白1(cap1)分别是乳腺调控乳蛋白和乳脂肪合成的正向和负向关键调控因子。乳腺上皮细胞中glyrs含量代表合成乳蛋白、乳脂肪能力，而cap1含量代表抑制合成乳蛋白、乳脂肪的能力。通过对乳腺上皮细胞中glyrs、cap1等关键分子的检测以评价乳腺合成乳蛋白和乳脂肪的功能，可以科学、准确地反映奶牛乳腺的产乳品质潜力。westernblotting检测glyrs和cap1含量，建立了奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力的计算方法：glyrs含量/cap1含量；本方法利用glyrs含量/cap1含量的比值，避免了乳中外泌体纯度不足和制备量对结果的影响，将乳指标和乳腺基因表达能力结合在一起，全面反映了不同奶牛品种和个体合成乳蛋白和乳脂肪的能力。通过试验可知，对乳腺上皮细胞中glyrs和cap1关键分子的检测以评价乳腺合成乳蛋白和乳脂肪的功能，glyrs含量/cap1含量可以反映乳腺合成乳蛋白和乳脂肪的能力，同时可以排除泌乳量的不同、奶牛瘤胃微生物的代谢差异、肝脏生物转化的差异、所取牛乳样品的差异等因素的影响。

附图说明

图1为实施例1中westernblotting检测外泌体溶液纯度结果图；a为细胞裂解液；b为细胞培养液上清；c为制备的牛乳外泌体；

图2为实施例1中westernblotting检测饲喂秸秆型粗饲料奶牛和苜蓿型粗饲料奶牛外泌体中glyrs和cap1含量的结果图；a为细胞裂解液；d为饲喂秸秆型粗饲料奶牛外泌体；e为苜蓿型粗饲料奶牛外泌体；

图3为实施例1中饲喂秸秆型粗饲料奶牛和苜蓿型粗饲料奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力示意图；其中f为饲喂秸秆型粗饲料奶牛，g为饲喂苜蓿型粗饲料奶牛；

图4为实施例1中利用乳成分分析仪检测饲喂秸秆型粗饲料奶牛和苜蓿型粗饲料奶牛乳蛋白率的结果示意图；其中f为饲喂秸秆型粗饲料奶牛，g为饲喂苜蓿型粗饲料奶牛；

图5为实施例1中利用乳成分分析仪检测饲喂秸秆型粗饲料奶牛和苜蓿型粗饲料奶牛乳脂率结果示意图；其中f为饲喂秸秆型粗饲料奶牛，g为饲喂苜蓿型粗饲料奶牛。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式一种利用牛乳检测奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力的方法：一、牛乳的预处理：取牛乳于-80℃冻存备用，得到牛乳样品；二、牛乳外泌体的制备：将牛乳样品于0-4℃、2000-2500rpm的条件下离心25-30min，去除沉淀的细胞和漂浮的脂肪球，得到脱脂乳；将脱脂乳于0-4℃、12000-13000rpm的条件下离心30-40min，取上清；将上清于0-4℃、100000-110000rpm的条件下离心2-2.5h，取沉淀；将沉淀用0.01-0.02m的pbs溶解，得到外泌体初次溶液；将外泌体初次溶液于0-4℃、

100000-110000rpm的条件下离心2-2.5h，取沉淀，将沉淀用0.01-0.02m的pbs溶液溶解，得到外泌体溶液，检测外泌体溶液纯度，合格后进行下一步操作；其中牛乳样品与0.01-0.02m的pbs溶液的体积比为1:20；三、取外泌体溶液15-20μl用于westernblotting检测；检测蛋白为：glyrs和cap1，根据westernblotting的灰度扫描结果，利用image-proplus图像分析软件进行分析，得到glyrs含量和cap1含量；四、奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力＝glyrs含量/cap1含量，glyrs含量/cap1含量＞0。

外泌体(exosome)是活细胞分泌的来源于晚期核内体(也称为多囊泡体)的膜性囊泡，直径约为30-150nm。外泌体可通过其携带的蛋白质、核酸、脂类等来调节受体细胞的生物学活性，已发现不同外泌体中共计4万多种蛋白质、超3千种microrna、超3千种mrna。乳腺上皮细胞能够分泌外泌体到乳中，甘氨酰trna合成酶(glyrs)和camp结合蛋白1(cap1)在乳外泌体中存在，且和乳腺上皮细胞中的水平正向相关。通过检测乳中外泌体glyrs和cap1含量，结合对原乳的乳蛋白率和乳脂率的分析，可以反映乳腺合成乳蛋白和乳脂肪的能力。

目前外泌体提取最常用的方法是超速离心法，此种方法得到的外泌体量多，但是纯度不足。本发明利用超速离心法制备乳中外泌体，并利用肿瘤易感性基因101(tumorsusceptibilitygene，tsg101)、葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulatedprotein78，grp78)、血管性血友病因子(vonwillebrandfactor，vwf)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，gapdh)进行外泌体纯度检测。本发明首次发现了甘氨酰trna合成酶(glyrs)和camp结合蛋白1(cap1)分别是乳腺调控乳蛋白和乳脂肪合成的正向和负向关键调控因子。乳腺上皮细胞中glyrs含量代表合成乳蛋白、乳脂肪能力，而cap1含量代表抑制合成乳蛋白、乳脂肪的能力。通过检测原乳的乳蛋白率和乳脂率，进一步结合对乳腺上皮细胞中glyrs、cap1等关键分子的检测以综合评价乳腺合成乳蛋白和乳脂肪的功能，可以科学、准确地反映奶牛乳腺的产乳品质潜力。westernblotting检测glyrs和cap1含量，建立了奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力的计算方法：glyrs含量/cap1含量；本方法利用glyrs含量/cap1含量的比值，避免了乳中外泌体纯度不足和制备量对结果的影响，将乳指标和乳腺基因表达能力结合在一起，全面反映了不同奶牛品种和个体合成乳蛋白和乳脂肪的能力。通过试验可知，对乳腺上皮细胞中glyrs和cap1关键分子的检测以评价乳腺合成乳蛋白和乳脂肪的功能，glyrs含量/cap1含量可以反映乳腺合成乳蛋白和乳脂肪的能力，同时可以排除泌乳量的不同、奶牛瘤胃微生物的代谢差异、肝脏生物转化的差异、所取牛乳样品的差异等因素的影响。

本实施方式westernblotting检测glyrs和cap1含量的步骤为：

一、样品的制备：取外泌体溶液转移到1.5ml离心管中，加入2×上样缓冲液或5×上样缓冲液，然后进行沸水浴10min；将细胞裂解液进行超声破碎3次，每次15s；分装，于-80℃超低温冰箱冻存备用；

二、分离胶的制备：制备10％的分离胶溶液，temed加入到分离胶溶液后混匀并注入至两个玻璃板之间，用胶7ml，用200ul移液枪加水以隔绝空气，并使胶面平整，静置20min后，倒掉上层水，用滤纸吸干；

三、浓缩胶的制备：制备5％的浓缩胶溶液，temed加入后混匀注入玻璃板之间，将齿梳插入至玻璃板间的溶液中，在室温下将凝胶垂直放置在水平桌面上，50min后浓缩胶聚合，将齿梳匀力拔出，得凝胶板；

四、上样：将制备好的凝胶板垂直固定到电泳槽中，上样，彩色预染marker上样量为5μl/孔，样品上样量为20μl/孔，并用上样缓冲液将空点样孔补齐；

五、电泳：4℃环境下接通电源，浓缩胶在80v恒压下电泳，25min后调节电压至120v，继续电泳，待溴酚蓝迁移至分离胶底部时停止电泳，取出凝胶；

六、转膜：使用湿转电泳仪进行转膜，由正极至负极的顺序为：滤膜、nc膜、凝胶、滤膜，赶尽每层之间的气泡，依蛋白大小和膜面积不同确定转膜时间；

七、染色：转膜结束后，用1×丽春红s染转有目的蛋白的nc膜1min，然后用去离子水冲洗，检验被染为红色的蛋白条带，比对蛋白marker剪下目的条带所在范围膜，并将所剪下含目的蛋白的nc膜放入1×tbs/t中进行清洗至膜上看不出有丽春红为止；

八、抗体结合：将nc膜放入5％脱脂乳赶尽气泡，37℃摇床封闭1.5h，然后放入配好的含一抗的5％脱脂乳溶液中，4℃摇床过夜，取出nc膜，于1×tbs/t中进行清洗，3次，每次5min，将nc膜放入含二抗的5％脱脂乳溶液中，37℃摇床中摇1h，取出nc膜，于1×tbs/t中进行清洗，3次，每次5min；其中用于曝光：按照1:1比例混合化学发光液a液与b液，利用化学发光成像仪进行曝光；

九、灰度扫描：利用image-proplus图像分析软件对westernblotting目的条带进行灰度值分析。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：采用westernblotting检测外泌体溶液纯度。其他与具体实施方式一相同。

本实施方式westernblotting检测外泌体溶液纯度的步骤为：

一、样品的制备：取外泌体溶液转移到1.5ml离心管中，加入2×上样缓冲液或5×上样缓冲液，然后进行沸水浴10min；将细胞裂解液进行超声破碎3次，每次15s；分装，于-80℃超低温冰箱冻存备用；

二、分离胶的制备：制备10％的分离胶溶液，temed加入到分离胶溶液后混匀并注入至两个玻璃板之间，用胶7ml，用200ul移液枪加水以隔绝空气，并使胶面平整，静置20min后，倒掉上层水，用滤纸吸干；

三、浓缩胶的制备：制备5％的浓缩胶溶液，temed加入后混匀注入玻璃板之间，将齿梳插入至玻璃板间的溶液中，在室温下将凝胶垂直放置在水平桌面上，50min后浓缩胶聚合，将齿梳匀力拔出，得凝胶板；

四、上样：将制备好的凝胶板垂直固定到电泳槽中，上样，彩色预染marker上样量为5μl/孔，样品上样量为20μl/孔，并用上样缓冲液将空点样孔补齐；

五、电泳：4℃环境下接通电源，浓缩胶在80v恒压下电泳，25min后调节电压至120v，继续电泳，待溴酚蓝迁移至分离胶底部时停止电泳，取出凝胶；

六、转膜：使用湿转电泳仪进行转膜，由正极至负极的顺序为：滤膜、nc膜、凝胶、滤膜，赶尽每层之间的气泡，依蛋白大小和膜面积不同确定转膜时间；

七、染色：转膜结束后，用1×丽春红s染转有目的蛋白的nc膜1min，然后用去离子水冲洗，检验被染为红色的蛋白条带，比对蛋白marker剪下目的条带所在范围膜，并将所剪下含目的蛋白的nc膜放入1×tbs/t中进行清洗至膜上看不出有丽春红为止；

八、抗体结合：将nc膜放入5％脱脂乳赶尽气泡，37℃摇床封闭1.5h，然后放入配好的含一抗的5％脱脂乳溶液中，4℃摇床过夜，取出nc膜，于1×tbs/t中进行清洗，3次，每次5min，将nc膜放入含二抗的5％脱脂乳溶液中，37℃摇床中摇1h，取出nc膜，于1×tbs/t中进行清洗，3次，每次5min；其中用于曝光：按照1:1比例混合化学发光液a液与b液，利用化学发光成像仪进行曝光；

九、灰度扫描：利用image-proplus图像分析软件对westernblotting目的条带进行灰度值分析。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：用于外泌体纯度检测的蛋白有：tsg101、grp78、vwf和gapdh。其他与具体实施方式一或二不同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：westernblotting检测外泌体溶液纯度中所用的一抗为：anti-tsg101，anti-grp78，anti-vwf和anti-gapdh；二抗为hrp标记山羊抗兔、hrp标记山羊抗鼠或hrp标记兔抗山羊igg。其他与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：westernblotting检测奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力所用一抗为：anti-glyrs和anti-cap1；二抗为hrp标记山羊抗兔、hrp标记山羊抗鼠或hrp标记兔抗山羊igg。其他与具体实施方式一至四之一相同。

为验证本发明的有益效果进行了以下实验：

实施例一：本实施例一种利用牛乳检测奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力的方法：一、牛乳的预处理：取牛乳于-80℃冻存备用，得到牛乳样品；二、牛乳外泌体的制备：将牛乳样品于4℃、2000rpm的条件下离心30min，去除沉淀的细胞和漂浮的脂肪球，得到脱脂乳；将脱脂乳于4℃、12000rpm的条件下离心30min，取上清；将上清于4℃、110000rpm的条件下离心2h，取沉淀；将沉淀用0.01m的pbs溶解，得到外泌体初次溶液；将外泌体初次溶液于4℃、110000rpm的条件下离心2h，取沉淀，将沉淀用0.01m的pbs溶液溶解，得到外泌体溶液，检测外泌体溶液纯度，合格后进行下一步操作；其中牛乳样品与0.01m的pbs溶液的体积比为1:20；三、取外泌体溶液20μl用于westernblotting检测；检测蛋白为：glyrs和cap1，根据westernblotting的灰度扫描结果，利用image-proplus图像分析软件进行分析，得到glyrs含量和cap1含量；四、奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力＝glyrs含量/cap1含量，glyrs含量/cap1含量＞0。

本实施例westernblotting检测glyrs和cap1含量的步骤为：

一、样品的制备：取外泌体溶液转移到1.5ml离心管中，加入2×上样缓冲液或5×上样缓冲液，然后进行沸水浴10min；将细胞裂解液进行超声破碎3次，每次15s；分装，于-80℃超低温冰箱冻存备用；

二、分离胶的制备：制备10％的分离胶溶液，temed加入到分离胶溶液后混匀并注入至两个玻璃板之间，用胶7ml，用200ul移液枪加水以隔绝空气，并使胶面平整，静置20min后，倒掉上层水，用滤纸吸干；

三、浓缩胶的制备：制备5％的浓缩胶溶液，temed加入后混匀注入玻璃板之间，将齿梳插入至玻璃板间的溶液中，在室温下将凝胶垂直放置在水平桌面上，50min后浓缩胶聚合，将齿梳匀力拔出，得凝胶板；

四、上样：将制备好的凝胶板垂直固定到电泳槽中，上样，彩色预染marker上样量为5μl/孔，样品上样量为20μl/孔，并用上样缓冲液将空点样孔补齐；

五、电泳：4℃环境下接通电源，浓缩胶在80v恒压下电泳，25min后调节电压至120v，继续电泳，待溴酚蓝迁移至分离胶底部时停止电泳，取出凝胶；

六、转膜：使用湿转电泳仪进行转膜，由正极至负极的顺序为：滤膜、nc膜、凝胶、滤膜，赶尽每层之间的气泡，依蛋白大小和膜面积不同确定转膜时间；

七、染色：转膜结束后，用1×丽春红s染转有目的蛋白的nc膜1min，然后用去离子水冲洗，检验被染为红色的蛋白条带，比对蛋白marker剪下目的条带所在范围膜，并将所剪下含目的蛋白的nc膜放入1×tbs/t中进行清洗至膜上看不出有丽春红为止；

八、抗体结合：将nc膜放入5％脱脂乳赶尽气泡，37℃摇床封闭1.5h，然后放入配好的含一抗的5％脱脂乳溶液中，4℃摇床过夜，取出nc膜，于1×tbs/t中进行清洗，3次，每次5min，将nc膜放入含二抗的5％脱脂乳溶液中，37℃摇床中摇1h，取出nc膜，于1×tbs/t中进行清洗，3次，每次5min；其中用于曝光：按照1:1比例混合化学发光液a液与b液，利用化学发光成像仪进行曝光；所用一抗为：anti-glyrs和anti-cap1；二抗为hrp标记山羊抗兔；

九、灰度扫描：利用image-proplus图像分析软件对westernblotting目的条带进行灰度值分析。

本实施例westernblotting检测外泌体溶液纯度的步骤为：

一、样品的制备：取外泌体溶液转移到1.5ml离心管中，加入2×上样缓冲液或5×上样缓冲液，然后进行沸水浴10min；将细胞裂解液进行超声破碎3次，每次15s；分装，于-80℃超低温冰箱冻存备用；

二、分离胶的制备：制备10％的分离胶溶液，temed加入到分离胶溶液后混匀并注入至两个玻璃板之间，用胶7ml，用200ul移液枪加水以隔绝空气，并使胶面平整，静置20min后，倒掉上层水，用滤纸吸干；

三、浓缩胶的制备：制备5％的浓缩胶溶液，temed加入后混匀注入玻璃板之间，将齿梳插入至玻璃板间的溶液中，在室温下将凝胶垂直放置在水平桌面上，50min后浓缩胶聚合，将齿梳匀力拔出，得凝胶板；

四、上样：将制备好的凝胶板垂直固定到电泳槽中，上样，彩色预染marker上样量为5μl/孔，样品上样量为20μl/孔，并用上样缓冲液将空点样孔补齐；

五、电泳：4℃环境下接通电源，浓缩胶在80v恒压下电泳，25min后调节电压至120v，继续电泳，待溴酚蓝迁移至分离胶底部时停止电泳，取出凝胶；

六、转膜：使用湿转电泳仪进行转膜，由正极至负极的顺序为：滤膜、nc膜、凝胶、滤膜，赶尽每层之间的气泡，依蛋白大小和膜面积不同确定转膜时间；

七、染色：转膜结束后，用1×丽春红s染转有目的蛋白的nc膜1min，然后用去离子水冲洗，检验被染为红色的蛋白条带，比对蛋白marker剪下目的条带所在范围膜，并将所剪下含目的蛋白的nc膜放入1×tbs/t中进行清洗至膜上看不出有丽春红为止；

八、抗体结合：将nc膜放入5％脱脂乳赶尽气泡，37℃摇床封闭1.5h，然后放入配好的含一抗的5％脱脂乳溶液中，4℃摇床过夜，取出nc膜，于1×tbs/t中进行清洗，3次，每次5min，将nc膜放入含二抗的5％脱脂乳溶液中，37℃摇床中摇1h，取出nc膜，于1×tbs/t中进行清洗，3次，每次5min；其中用于曝光：按照1:1比例混合化学发光液a液与b液，利用化学发光成像仪进行曝光；

九、灰度扫描：利用image-proplus图像分析软件对westernblotting目的条带进行灰度值分析。外泌体纯度检测的蛋白有：tsg101、grp78、vwf和gapdh。所用的一抗为：anti-tsg101，anti-grp78，anti-vwf和anti-gapdh；二抗为hrp标记山羊抗兔。

westernblotting检测外泌体溶液纯度结果如图1所示，由图1可知tsg101蛋白呈阳性结果说明所得产物含有外泌体成分；而grp78呈阴性结果说明所得产物不含有内质网成分；vwf呈阴性结果说明所得产物不含有高尔基体成分；gapdh呈阴性结果说明所得产物不含有胞浆蛋白成分，结果表明制备的外泌体未有其它细胞成分污染。

利用本实施例的方法分别检测饲喂秸秆型粗饲料奶牛和苜蓿型粗饲料奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力，westernblotting检测glyrs和cap1含量的结果如图2所示，由图2可知秸秆型粗饲料奶牛乳中外泌体中glyrs含量同苜蓿型粗饲料奶牛乳中外泌体相比显著降低，而cap1含量则显著高于苜蓿型粗饲料奶牛乳中外泌体的含量。用image-proplus图像分析软件对图2进行分析，结果为饲喂秸秆型粗饲料奶牛的glyrs含量为0.376，cap1含量为1.648，比值为0.228；苜蓿型粗饲料奶牛的glyrs含量为1.025，cap1含量为0.843，比值为1.216(图3)。

利用乳成分分析仪检测饲喂秸秆型粗饲料奶牛和苜蓿型粗饲料奶牛乳蛋白率和乳脂率，结果如图4和图5所示，由图4和图5可知饲喂秸秆型粗饲料奶牛的乳蛋白率(2.827％)和乳脂率(3.187％)显著低于苜蓿型粗饲料奶牛的乳蛋白率(3.256％)和乳脂率(3.564％)。和本发明方法作对比，本发明方法以奶牛乳外泌体中glyrs含量/cap1含量代表乳腺的合成乳蛋白和乳脂肪的能力与检测奶牛的乳蛋白率和乳脂率是一致的，说明通过对乳腺上皮细胞中glyrs和cap1关键分子的检测以评价乳腺合成乳蛋白和乳脂肪的功能，glyrs含量/cap1含量可以反映乳腺合成乳蛋白和乳脂肪的能力，同时可以排除泌乳量的不同、奶牛瘤胃微生物的代谢差异、肝脏生物转化的差异、所取牛乳样品的差异等因素的影响。