本发明涉及一种盐酸吗啉胍纯度标准物质及其制备方法与应用，属于化学计量中标准量值传递
技术领域：
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背景技术：
：禁限用药物在畜牧养殖过程中滥用情况严重，由于其具有较强的毒副作用和毒性作用，且在动物组织中的残留会通过食物链传给人类，长期微量摄入会引起多种疾病，对人类的健康造成危害。禁限用药物已成为农业部农产品质量安全风险评估与监测活动的重要参数，为保证测量结果的一致性、可比性、可溯源性以及量值的准确可靠，急需配套相应的标准物质。盐酸吗啉胍，英文名称：moroxydinehydrochloride，cas：3731-59-7，分子式c6h13n5o·hcl，相对分子量207.66，熔点211-214℃。盐酸吗啉胍是一种白色结晶性粉末，无臭，味微苦；易溶于水，微溶于乙醇、乙醚，几乎不溶于氯仿；适于在密闭，阴凉干燥处储存。盐酸吗啉胍是由吗啉盐酸盐与双氰胺加成而得。将80-85％的吗啉盐酸盐浓溶液与二甲苯一起加热，搅拌回流带水至尽。冷却后加入双氰胺，加热升温，开始激烈反应时，立即停止加热。反应缓和后，继续回流3小时。蒸出二甲苯，加水溶解，用活性炭脱色后，所得粗品再用乙醇浸泡洗涤，干燥，得成品盐酸吗啉胍分子结构式如式1所示。技术实现要素：本发明的目的是提供一种盐酸吗啉胍纯度标准物质及其制备方法与应用，本发明能作为标准物质用于畜禽产品中药物残留的检测，为国家农产品质量安全风险评估与监测溯源体系的建立提供技术支持与物质保证。本发明提供的盐酸吗啉胍纯度标准物质的制备方法，包括如下步骤：1)对盐酸吗啉胍原料粉末取样，采用高效液相色谱面积归一化法测定所述盐酸吗啉胍原料粉末中盐酸吗啉胍的质量百分含量，得到所述盐酸吗啉胍原料粉末的纯度定值；2)测定所述盐酸吗啉胍原料粉末中水分质量百分含量、非挥发性杂质质量百分含量和有机挥发性杂质质量百分含量，结合步骤1)中测定的所述盐酸吗啉胍原料粉末的纯度定值，按照如下公式ⅰ计算，即得到定值的盐酸吗啉胍纯度标准物质；p＝p0×[100％-xw-xn-xv]×100％公式ⅰ；其中，p为盐酸吗啉胍纯度标准物质的定值，p0为盐酸吗啉胍原料粉末的纯度定值，xw为水分质量百分含量，xn为非挥发性杂质质量百分含量，xv为有机挥发性杂质质量百分含量。上述的方法中，所述盐酸吗啉胍原料粉末的纯度为99.3～99.9％；采用多个实验室联合测定所述盐酸吗啉胍原料粉末中盐酸吗啉胍的质量百分含量；步骤1)中还包括对所述盐酸吗啉胍原料粉末取样采用jjg1006-1994《一级标准物质技术规范》的要求采用方差分析法进行均匀性检验和采用直线拟合法进行稳定性检验的步骤。本发明中，所述均匀性检验的如下公式所示：记v1＝m-1，v2＝n-m；其中，q1代表组间差方和，q2代表组内差方和，代表第i组的平均值，代表总平均值，xij代表第i组的第j个数值，v1代表组间自由度，v2代表组内自由度，s1代表组间标准偏差，s2代表组内标准偏差。根据自由度(v1，v2)及给定的显著性水平α，可查得临界fα值。本发明中，制备所述盐酸吗啉胍原料粉末包括如下步骤：经过定性和纯度初步确认后，放置入研磨仪中充分研磨，对研磨后的原料放入真空烘箱中，在45℃的条件下，低压(-0.1mpa以下)干燥24小时，将减压干燥后的盐酸吗啉胍纯品原料置于一干净的玻璃器皿中，充分搅拌、混匀。上述的方法中，所述高效液相色谱面积归一化法的色谱条件如下：色谱柱：sb-aq(250mm×4.6mm,5.0μm)；流动相：戊烷磺酸钠和甲醇组成，戊烷磺酸钠与甲醇的体积份数比为90：10，戊烷磺酸钠采用三乙胺调节ph值至3.7；流速：1.0ml/min；进样量：10μl；uv波长：237nm；所述盐酸吗啉胍原料粉末测定时配制为100～1000mg/l的盐酸吗啉胍甲醇溶液，具体可为100mg/l、500mg/l、1000mg/l。本发明中，所述色谱条件中hplc采用waters2695-waters4889系统。上述的方法中，步骤1)中还包括对剔除数组中的可疑值的所述盐酸吗啉胍原料粉末的纯度定值进行正态性检验的步骤。上述的方法中，步骤1)中还包括对所述盐酸吗啉胍原料粉末的纯度定值采用科克伦准则剔除数组中的可疑值的步骤；所述科克伦准则的计算公式：查表得c(α，m，n)；其中，c为所述盐酸吗啉胍原料粉末的纯度定值的统计量，smax为测量组中最大的标准偏差；si为第i组测量值的标准偏差；c(α，m，n)为科克伦检验值；当c＞c(α，m，n)时，为可疑值数组，应被剔除；当c＜c(α，m，n)时，无可疑数组，应保留；采用狄克逊准则对多个实验室联合测定所述盐酸吗啉胍原料粉末的纯度定值数据进行统计检验，该检验通过极差法剔除可疑值。本发明中，多个实验室联合测定所述盐酸吗啉胍原料粉末的纯度定值数据首先采用达戈斯提诺法检验数据的正态性，然后进行所述科克伦准则剔除数组中的可疑值和采用狄克逊准则剔除可疑值。上述的方法中，采用卡尔费休法测定所述盐酸吗啉胍原料粉末中的水分含量；所述盐酸吗啉胍原料粉末中非挥发性杂质质量百分含量采用微波消解-电感耦合等离子体质谱法、微波消解-电感耦合等离子体发射光谱法和离子色谱法测定；所述微波消解-电感耦合等离子体质谱法测定非挥发性杂质中的as、se、cd、mn、sn、li、cr、cs、ni、pb、sr、rb、ti和ba中至少一种的含量；所述微波消解-电感耦合等离子体发射光谱法测定所述非挥发性杂质中的cu、ca、mg、k、na、p、mn、mo、zn、fe和co中至少一种的含量；所述离子色谱法测定氯离子、硝酸根离子和硫酸根离子的含量；采用顶空气相色谱测定所述盐酸吗啉胍原料粉末中所述有机挥发性杂质质量百分含量。上述的方法中，步骤2)中还包括对所述盐酸吗啉胍纯度标准物质的定值进行不确定度分析的步骤；所述盐酸吗啉胍纯度标准物质的不确定度由三部分组成：标准物质的不均匀引入的不确定度、标准物质的不稳定引入的不确定度和标准物质的定值过程引入的不确定度。本发明中，所述盐酸吗啉胍纯度标准物质的定值不确定度的分析采用本领域常规的方法进行分析，对所述盐酸吗啉胍纯度标准物质定值的不确定度分析，目的是对定值结果的分散性进行合理的表征。本发明还提供了上述的方法得到的定值的所述盐酸吗啉胍纯度标准物质。本发明所述阿昔洛韦纯度标准物质的质量分数99.9％，其不确定度(k＝2)为0.4％。本发明所述盐酸吗啉胍纯度标准物质在如下1)-6)任一项中的应用：1)用于农产品生产流通领域中兽药、饲料产品中盐酸吗啉胍成分检测；2)食品领域中畜禽产品中盐酸吗啉胍药物残留检测；3)检测实验室质量控制；4)作为标准物质对分析仪器校准；5)分析方法确认评价；6)对给定材料赋值。本发明具有以下优点：本发明采用高效液相色谱(uv检测器)分析方法、多家实验室合作定值方式对标准物质的纯度进行定值，通过使用满足计量学特性要求的制备方法、测量方法和计量器具，保证了标准物质特性量值的溯源性，标准值的不确定度综合考虑了纯品纯度定值、样品不均匀和不稳定引入的不确定度分量。附图说明图1为盐酸吗啉胍6个月稳定性监测结果。图2为盐酸吗啉胍短期稳定性结果，其中图2(a)为20℃条件下短期稳定性结果，图2(b)为40℃条件下短期稳定性结果，图2(c)为60℃条件下短期稳定性结果。图3为非挥发性杂质含量测，其中图3(a)为氯离子的标准曲线，图3(b)为硝酸根的标准曲线，图3(c)为硫酸根离子的标准曲线。图4为盐酸吗啉胍(1000mg/l)的离子色谱图。图5为盐酸吗啉胍纯度标准物质定值不确定度来源分析及评定流程图。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中，标准物质候选物盐酸吗啉胍购于tci公司，产品批号为lot：m2uae，标签纯度为99.9％(hplc)和99.3％(nonaqueoustitration)，候选物的包装规格为50g。实施例1、盐酸吗啉胍纯度标准物质的定值盐酸吗啉胍原料粉末的制备：盐酸吗啉胍纯品原料经过通过红外和核磁进行定性和纯度初步确认后，放置入研磨仪中充分研磨，对研磨后的原料放入真空烘箱中，在45℃的条件下，低压(-0.1mpa以下)干燥24小时，将减压干燥后的盐酸吗啉胍纯品原料置于一干净的玻璃器皿中，充分搅拌、混匀。采用液相色谱法(紫外检测器，uv)对该原料进行均匀性的初步检验，检验合格后，将盐酸吗啉胍候选物分装至干净的西林瓶中，西林瓶规格为5.0ml，在分装前采用严格的洗涤措施清洗，每个包装单元为100mg，本次研制共分装盐酸吗啉胍纯品419瓶。低温(4℃)、避光储存以备后续使用。本发明盐酸吗啉胍纯度标准物质的定值步骤如下：1、均匀性检验根据jjg1006-1994《一级标准物质技术规范》的要求，对标准物质进行了均匀性检验。本研究采用方差分析法统计检验盐酸吗啉胍纯度标准物质的均匀性，从分装的盐酸吗啉胍中随机抽取15个包装，充分摇匀后，在瓶中不同部位取平行三次，重量-容量法配制1000mg/l甲醇溶液，采用定值时的液相条件，采用液相色谱-面积归一化法检验，获得的均匀性数据采用方差分析法，通过组间方差和组内方差的比较来判断各组测量值之间有无系统性差异，如果两者的比小于统计检验的临界值，则认为样品是均匀的。均匀性检验公式如下：记v1＝m-1(组间自由度)，v2＝n-m(组内自由度)其中，q1代表组间差方和，q2代表组内差方和，代表第i组的平均值，代表总平均值，xij代表第i组的第j个数值，v1代表组间自由度，v2代表组内自由度，s1代表组间标准偏差，s2代表组内标准偏差。根据自由度(v1，v2)及给定的显著性水平α，可查得临界fα值。表1.1盐酸吗啉胍纯度标准物质均匀性检验结果(％)根据表1.1数据分析，本次分装的盐酸吗啉胍纯度标准物质的瓶间和瓶内测定结果的标准偏差无显著性差异，可以判定分装的纯度标准物质是均匀的，对均匀性检验的数据进行统计分析，结果对均匀性标准偏差sh计算如下：2、稳定性检验：标准物质的稳定性包括长期稳定性和短期稳定性。长期稳定性是指在规定储存条件下标准物质特性的稳定性。短期稳定性是指在运输条件下标准物质在运输过程中的稳定性。根据导则35，稳定性可以通过直线拟合法进行统计检验。具体公式如下所示：斜率可用下式计算：截距可用下式计算：直线上每点的标准偏差可用下式计算：与斜率相关的不确定度可用下式计算：若∣b1∣<t0.95,n-2·s(b1)，则认为标准物质是稳定的。其中，稳定性引入的不确定度为：(1)长期稳定性考察根据jjg1006-1994《一级标准物质技术规范》中的要求，标准物质长期稳定性考察按照先密后疏的原则。本研究从2016年5月开始，采用液相色谱法分别在第0、1、3、6个月进行稳定性考察。每次抽取2个包装，采用重量-容量法配制溶液，每个包装平行测定3次，如表1.2和图1所示，本发明标准物质的稳定性检验结果表明，在4℃避光保存的条件下，六个月内标准物质的纯度量值稳定。表1.2盐酸吗啉胍纯度标准物质长期稳定性监测结果(％)(2)短期稳定性考察将样品置于20℃、40℃和60℃恒温箱中(模拟运输条件)保存，分别在第1、3、5、7、9天进行稳定性监测，检测方法与长期稳定性监测相同。采用趋势分析进行数据考察，结果如表1.3和图2所示，显示本标准物质在60℃及以下的运输条件下9天内可保证纯度量值稳定。表1.3盐酸吗啉胍纯度标准物质短期稳定性考察结果(％)综上所述，盐酸吗啉胍纯度标准物质在4℃保存下，6个月内特性量值稳定，在模拟20℃、40℃、60℃的运输温度，9天内特性量值稳定。3、标准物质定值根据盐酸吗啉胍的性质分析和实验结果，按照《国家一级标准物质技术规范》(jjf1006-1994)的要求，盐酸吗啉胍纯度标准物质定值采用10家经资格认可的实验室联合定值，定值方法为经过优化的高效液相色谱面积归一化法。经过主成分纯度联合定值后，再对纯度标准物质中的水分，非挥发性杂质、挥发性杂质进行准确测定，利用质量平衡法最后确定本纯度标准物质的量值。10家实验室定值用到的测量仪器和玻璃仪器均均经过了计量检定。10家实验室分别为农业部水产品质量监督检验测试中心(上海)、上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所、江苏省畜产品质量检验测试中心、农业部农产加工品监督检验测试中心(南京)、河南省兽药饲料监察所、河南省农业科学院质标所、四川省畜产品安全检测中心、四川省农业科学院质标所和农业部农产品质量监督检验测试中心(昆明)。经过优化，最终确定的盐酸吗啉胍液相色谱定值条件如下：色谱柱：agilentzorbaxsb-aq(250mm×4.6mm,5.0μm)；流动相：戊烷磺酸钠和甲醇组成，戊烷磺酸钠与甲醇的体积份数比为90：10，戊烷磺酸钠采用三乙胺调节ph值至3.7；流速：1.0ml/min；进样量：10μl；uv波长：237nm；hplc：waters2695-waters4889系统。定值浓度为100mg/l、500mg/l、1000mg/，的盐酸吗啉胍甲醇溶液，在同一色谱条件下分别进样。比较发现，不同浓度条件下杂质检出数量和含量相同。因此，选用1000mg/l的溶液做进一步的色谱条件优化。本次各实验室用于定值的仪器见表1.4，定值结果见表1.5。表1.4各参与定值实验室及其高效液相色谱型号序号实验室液相型号1农业部农产品质量标准研究中心waters26952农业部水产品质量监督检验测试中心(上海)agilent12003上海市农业科学院质标所waters2690-24874江苏省畜产品质量检验测试中心waters2695-29985农业部农产加工品监督检验测试中心(南京)agilent11006河南省兽药饲料监察所waters2695-29987河南省农业科学院质标所岛津spd-20av8四川省畜产品安全检测中心agilent12009四川省农业科学院质标所agilent120010农业部农产品质量监督检验测试中心(昆明)waters2695-2998表1.5盐酸吗啉胍纯度标准物质多家合作定值原始结果因为多家定值数据n＝90，首先采用达戈斯提诺法检验数据的正态性。表1.6多家合作定值原始结果达戈斯提诺法检验统计表kxkxn+1-kxn+1-k-xkn+1/2-kkxkxn+1-kxn+1-k-xkn+1/2-k199.8899.980.1044.52499.9299.960.0421.5299.8899.980.1043.52599.9299.960.0420.5399.8999.980.0942.52699.9299.960.0419.5499.8999.980.0941.52799.9299.960.0418.5599.9099.980.0840.52899.9299.960.0417.5699.9099.980.0839.52999.9399.960.0316.5799.9099.980.0838.53099.9399.960.0315.5899.9099.980.0837.53199.9399.950.0214.5999.9099.980.0836.53299.9399.950.0213.51099.9199.980.0735.53399.9399.950.0212.51199.9199.970.0634.53499.9399.950.0211.51299.9199.970.0633.53599.9399.950.0210.51399.9199.970.0632.53699.9399.950.029.51499.9199.970.0631.53799.9399.950.028.51599.9199.970.0630.53899.9399.950.027.51699.9299.970.0529.53999.9399.950.026.51799.9299.970.0528.54099.9399.950.025.51899.9299.970.0527.54199.9399.950.024.51999.9299.970.0526.54299.9499.940.003.52099.9299.970.0525.54399.9499.940.002.52199.9299.970.0524.54499.9499.940.001.52299.9299.960.0423.54599.9499.940.000.52399.9299.960.0422.5由表1.6数据得：经差达格斯提诺检验临界区间，y值介于相应的区间α-α(-2.57～1.28)之间，故该组数据为正态分布。根据《gb/t4883-2008数据的统计处理和解释-正态样本离群值的判断和处理》，采用科克伦准则判断这11组数据有无哪一组是可疑数据，根据科克伦准则，计算统计量查表得c(α，m，n)＝c(0.05，10，9)＝0.2541，因为c<c(0.05，10，9)，无可疑数据组。采用狄克逊准则对10个实验室定值数据进行统计检验，将定值结果按照由小到大的顺序排列：x(1)＝99.91％,x(2)＝99.91％,x(3)＝99.93％,x(4)＝99.94％......,x(n-2)＝99.95％,x(n-1)＝99.96％,x(n)＝99.96％n＝10，由狄克逊检验表查f(0.05,10)＝0.635又因为r1和r2<f(0.05,10)，故全部数据均应保留。表1.7盐酸吗啉胍纯度标准物质多家合作定值结果4、杂质含量的测定1)水分含量测定采用卡尔费休法测定固体物质尤其是纯品中的水分含量。对实验选取的用于定值的3个包装单元采用mettlertoledodl39串联mettlertoledostromboli仪，依国标(gb/t606化学试剂水分测定通用法卡尔-费休法)测定水分，每个单元测三次取平均值。结果如表1.8所示。表1.8盐酸吗啉胍水分含量测定结果(％)(2)非挥发性杂质含量测定1)电感耦合等离子体质谱法本发明采用微波消解-电感耦合等离子体质谱法(microwave-assistedicp-ms)检测盐酸吗啉胍纯度标准物质中的as,se,cd,mn,sn,li,cr,cs,ni,pb,sr,rb,ti,ba含量，具体实验过程如下。实验仪器及试剂：电感耦合等离子体质谱仪(icp-ms)赛默飞世尔有限公司icp-msxseries2，万分之一分析天平，纯度>99.99％高纯氩气，cem微波消解仪(marssystem)，超纯水，硝酸(优级纯)，双氧水(优级纯)，as,se,cd,mn,mo,co,cu,cs,ni,pb,sr,rb,ti,ba混合标准溶液(10mg/l)。实验方法：标准工作曲线的建立：标准工作曲线的制作通过配置不同浓度的混标溶液(0.01ppm、0.1ppm、1.0ppm、10.0ppm、50.0ppm)。内标液(in114)：以超纯水作介质，配成溶液浓度为1μg/l。样品前处理：微波消解法。称取均匀干样0.100g，精确至0.0001g，于55ml消解管中，加5ml硝酸，浸泡过夜，加入1ml双氧水，盖上溶样盖，置于高压罐内，再放入微波溶样装置内，设置微波系统消解程序，开始消解试样。消解完全结束后，取出内罐，放置于赶酸仪上，以100℃加热赶酸至溶液剩余1ml，取下冷却至室温，用水转移入10ml容量瓶中，定容，混匀备用。同时做试剂空白。仪器条件：雾化器流量1.02l/min；吹扫次数45次；辅助气流量0.80l/min；冷却气流量13l/min。2)电感耦合等离子体发射光谱法本研究采用微波消解-电感耦合等离子体发射光谱法(microwave-assistedicp-aes)检测盐酸吗啉胍纯度标准物质中的cu,ca,mg,k,na,p,mn,mo,zn,fe,co含量，实验过程如下。实验仪器及试剂电感耦合等离子体发射光谱仪(icp-aes)上海聚光科技仪器公司icp-5000，万分之一分析天平，纯度>99.99％高纯氩气，空气压缩机，循环冷却水，cem微波消解仪(marssystem)，超纯水，硝酸(优级纯)，双氧水(优级纯)，cu,ca,mg,k,na,p,mn,mo,zn,fe,co标准溶液(100mg/l)实验方法：标准工作曲线的建立：标准工作曲线的制作通过配置不同浓度的混标溶液(0.1ppm、1.0ppm、5.0ppm、10.0ppm)。样品前处理：微波消解法。称取均匀干样0.100g，精确至0.0001g，于55ml消解管中，加5ml硝酸，浸泡过夜，加入1ml双氧水，盖上溶样盖，置于高压罐内，再放入微波溶样装置内，设置微波系统消解程序，开始消解试样。消解完全结束后，取出内罐，放置于赶酸仪上，以100℃加热赶酸至溶液剩余1ml，取下冷却至室温，用水转移入10ml容量瓶中，定容，混匀备用。同时做试剂空白。仪器条件：水平观测方式；冲洗泵速100rpm；rf功率：1150w；分析泵速50rmp；雾化器流量0.6slm；分析时间25s；辅助气流量1.0slm；冷却气流量12slm。通过以上两种方法测得的盐酸吗啉胍中各个元素的含量见表1.9所示。表1.9盐酸吗啉胍纯度标准物质中非挥发性无机元素杂质测定结果3)离子色谱法仪器与试剂：ics-3000型离子色谱仪(美国dionex公司)，配有eg40淋洗液自动发生器、电导检测器和chromeleon6.80色谱工作站；ionpacas11-hc型分离柱(250mm×4mm)；ionpacag11-hc型保护柱(50mm×4mm)；asrs-ultra阴离子抑制器；onguardrp柱(美国dionex公司)，0.45过滤膜(milipore公司)；超纯水系统(pine-tree公司)；kq100-de超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。亚硝酸钠和己酸等其他有机酸盐标准样品为sigma公司高纯试剂，所用溶液均用电阻率为18.2mω·cm超纯水配制。色谱条件：色谱柱：ionpacas11-hc型分离柱(250mmx4mm)，ionpacag11-hc型保护柱(50mm×4mm)；流动相：15mmkoh等度淋洗18min；流速：1.0ml/min；抑制器再生模式：外加水电抑制；电导检测器检测；进样量：25μl。以峰面积定量。实验结果：配制氯离子、硝酸根离子和硫酸根离子的标准曲线，结果如下：表1.10离子色谱标准溶液配制浓度及测定结果标准溶液浓度/ppm氯离子峰面积硝酸根峰面积硫酸根峰面积0.10.0360.0190.08520.50.09840.05810.137410.17430.11340.201850.93160.63010.8015101.93811.32981.7156203.97212.78543.4592由上述测定的积分结果计算得出盐酸吗啉胍纯品中氯离子质量分数为17.03％，硝酸根离子质量分数为0.000095％，硫酸根离子质量分数为0.000079％。盐酸吗啉胍中的氯离子的理论计算值为17.22％。因此认为氯离子与吗啉胍是以接近1:1的摩尔比存在。盐酸吗啉胍中其他非挥发性杂质质量分数很小。(3)挥发性杂质含量测定盐酸吗啉胍合成过程中，不可避免会用到有机溶剂。为了验证纯品中是否存在有机溶剂残留，实验采用顶空气相色谱进行盐酸吗啉胍纯品中有机挥发性成分的检测，检测结果显示：含量很低，对盐酸吗啉胍纯度的定值结果影响极小，故可以忽略。主要仪器与试剂：agilent6890型气相色谱仪，氢火焰离子化检测器(fid)(美国agilent公司)，agilent1888型顶空自动进样仪(美国agilent公司)，10ml顶空瓶美国agilent公司)，甲醇(gbw06111)、乙醇(gbw06112)、丙酮(gbw06115)、乙腈(gbw06113)、正己烷(gbw06116)、乙酸乙酯(gbw06114)纯度标准物质(中国计量科学研究院)；异丙醇、二氯甲烷标准品(默克公司)。仪器工作条件：色谱柱：db-624(60m×0.25mm，1.40μm)；载气流速：氢气40ml/min、空气400ml/min；程序升温条件：初始45℃保持5min，以每分钟7℃的速率升温至120℃，以每分钟15℃的速率升温至230℃，保持15min进样量：1ml，分流比：不分流。加热箱：70℃；环路：90℃；传输线：110℃实验步骤：分别取10μl甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇、乙腈、正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷溶液标准物质分别溶于990μl纯水中并准确记录其质量，置于顶空瓶中立即用压盖器封好制备单标，待测定。分别称取50.00mg(精确至0.01mg)盐酸吗啉胍于10ml顶空瓶中立即用压盖器封好，待测定。表1.11单标的质量与含量记录表单标名称单标质量/mg水质量/mg单标含量甲醇9.651202.230.80％乙醇8.661224.050.70％乙腈9.541230.000.77％丙酮9.061222.600.74％正己烷6.371236.920.51％异丙醇8.191223.000.67％三氯甲烷9.311232.950.75％乙酸乙酯9.541240.180.76％有上述实验测得结果：未检出上述溶剂残留。5、盐酸吗啉胍纯度标准物质的定值结果纯度定值的结果主成分纯度采用10家实验室联合定值的结果，扣除水分、非挥发性、挥发性杂质等。定值公式如下：p＝p0×[100％-xw-xn-xv]×100％。其中，xw为水分含量，xn为非挥发性杂质含量，xv为挥发性杂质含量。表1.12盐酸吗啉胍定值结果(％)项目主成分纯度水分非挥发性杂质纯度计算纯度定值结果99.940.0800.0075799.85399.96、不确定度评价盐酸吗啉胍纯度标准物质的不确定度由三部分组成：标准物质的不均匀引入的不确定度；标准物质的不稳定引入的不确定度；标准物质的定值过程引入的不确定度。盐酸吗啉胍纯度标准物质不确定度来源分析及评定流程如图5所示。(1)均匀性引入的不确定度采用单因素方差分析法进行均匀性评估。则均匀性的标准偏差sh可以用公式计算：式中：sh为均匀性标准偏差；为组间方差；为组内方差；n为组内测量次数。在这种情况下，sh等同于瓶间不均匀性导致的不确定度分量ubb，即为公式ubb＝sh＝0.0098％。(2)稳定性引入的不确定度根据上述表1.2的数据，有效期为6个月的长期稳定性引入的不确定度ults计算如下：ults＝s(b1)·x＝0.00089％×6＝0.00196％≈0.00537％根据上述表1.3的数据，短期稳定性引入的不确定度usts计算如下：在20℃下：usts1＝s(b1)·x＝0.00315％×9＝0.028％在40℃下：usts2＝s(b1)·x＝0.00277％×9＝0.025％在60℃下：usts3＝s(b1)·x＝0.00014％×9＝0.031％所以：采用最大不确定度usts1＝0.031％为短期稳定性的不确定度。(3)定值引入的不确定度1)主成分纯度定值引入的不确定度将合作定值的结果的平均值作为一组新的测量值，取该组测量值的标准偏差作为多家定值的不确定度，各成分在不同检测波长下响应差异引入的不确定度：式中，bimaxλ为在5个检测波长下杂质成分i的最大百分比含量；bi定值λ为定值波长下杂质成分i的百分比含量；u2-i为杂质成分i的不确定度分量。各波长的响应与不确定度评定结果，见表1.13。表1.13盐酸吗啉胍检测波长引入不确定度的评定波长杂质成分的百分比含量(％)190nm-210nm-237nm0.03250nm0.0063270nm-u2-i0.0237u20.014液相色谱测定合成标准不确定度:2)水分引入的不确定度天平称样引入的不确定度分量很小，所以水分测量的主要不确定来源是测量的重复性ua，水分的测量结果xw为0.080％，相对标准偏差为0.010％，因此水分测定的不确定性较大，因此，水分测定引入的不确定度:u(xw)＝0.080％。3)其他杂质引入的不确定度天平称样引入的不确定度分量很小，所以非挥发性杂质测量的主要不确定来源是测量的重复性ua，非挥发性杂质的测量结果xn为0.00757％，由于部分无机元素受环境、仪器的本底影响较大，因此，将非挥发性杂质的测量结果记为非挥发性杂质测定的不确定度:u(xn)＝0.00757％4)纯度定值引入的相对不确定度5)纯度定值引入的标准不确定度uchar＝99.9％×uchar,rel＝0.082％(4)标准物质的不确定度盐酸吗啉胍纯度标准物质定值结果的不确定度由定值方法、标准物质的不均匀性及不稳定性带来的不确定度三部分组成。标准物质的总体不确定度计算公式如下：扩展不确定度为：ucrm＝k×ucrm＝0.4％(k＝2)。7、盐酸吗啉胍标准物质定值结果综上所述，本发明盐酸吗啉胍纯度标准物质的量值和不确定度如表1.14所示。表1.14盐酸吗啉胍纯度标准物质的纯度、不确定度成分量值/％不确定度/％(k＝2)盐酸吗啉胍纯度99.90.4应用：1、用于评价方法：准确称量盐酸吗啉胍纯度标准物质，采用重量-容量法配制成标准工作溶液，在空白动物源食品(鸡肉、鸡蛋)等中添加该标准工作溶液，制备成阳性样品。称取试料2.0g(0.01g)于50ml离心管中，加入4ml20g/l三氯乙酸溶液和1ml乙腈，漩涡2min，3500r/min离心10min上清液转入另一50ml离心管中，再重复提取一次合并两次上清液备用。依次用3ml甲醇、3ml水活化mcx萃取小柱移取10ml备用液；依次用3ml水、3ml甲醇淋洗mcx柱；然后真空抽干5min，用3.5ml洗脱液(氨化甲醇溶液：准确量取2.5ml氨水和2.5ml乙酸铵溶液(5mol/l，ph7.0)加入90ml的甲醇中，用甲醇定容至100ml，混匀后备用)洗脱至5ml玻璃管中，在45℃氮气吹干。用1ml乙腈-甲醇-水(体积比为90:5:5)溶液溶解残渣，过0.22μm滤膜，取上清液供液相色谱-串联质谱测定。回收率(添加浓度300μg/kg、500μg/kg、1000μg/kg)分别为85.6％、89.7％、91.2％。表明本发明所述盐酸吗啉胍纯度标准物质适用于动物源食品中盐酸吗啉胍残留量的检测。2、用于实际样品中盐酸吗啉胍残留的准确测定采用上述经过评价的方法，准确称量盐酸吗啉胍纯度标准物质，采用重量-容量法配制一系列浓度的标准溶液，采用上述前处理方法结合外标法对实际样品进行测定，对畜禽产品专项检测的2037个样品检测中，盐酸吗啉胍检出率为0.8％，检出浓度范围为1.21ng/g-69.84ng/g。当前第1页12