本发明属于生物技术领域，涉及一种在植物器官或组织中对激素进行整体定位检测的方法及应用。
背景技术：
植物激素生长素(auxin)在植物发育中起着至关重要的作用，是调控植物胚胎发育和胚后发育的关键影响因子，调节包括雌配子体图式形成、胚胎发育、器官发生、分生组织活动，以及对环境刺激和其他的生长反应等许多的过程。生长素作用的一个关键方面是它依赖于局部生长素生物合成和定向、细胞间的生长素运输呈梯度分布(生长素梯度)。这一极性运输在大部分生长素调控的过程中起至关重要的作用，生长素在不同细胞和组织间极性运输，由此产生的生长素峰值和梯度对植物器官发生和形态建成起着决定性作用。不仅如此，生长素在诱导分生细胞产生、维持细胞干性方面也发挥重要作用：在茎端分生组织(sam)发育过程中，干细胞的维持机制则是由生长素与细胞分裂素的平衡来共同完成的(moubayidinetal.,2009；zhaoetal.,2010)，生长素浓度梯度分布模式决定了叶原基的发生位置和叶序的形成(fleming,2005；heisleretal.,2005)。在根的发育过程中，生长素能够通过诱导中柱鞘细胞成为奠基细胞从而对侧根的发生位置起决定作用(dubrovskyetal.,2008)，生长素通过极性运输在根端分生组织(ram)中积累维持干细胞的活性(terpstraandheidstra,2009)。生长素还参与到维管束发育、蔽荫反应、向性反应、生物与非生物胁迫的过程(santnerandestelle,2009)。此外，生长素还可以调控细胞的分裂与伸长：已知生长素可以调控细胞周期蛋白cdka/cycd复合体的形成从而参与细胞g1/s期的转换；同时生长素还可以调节细胞壁的松弛程度导致细胞膨大，引起细胞的伸长(perrot-rechenmann,2010)。所有侧生器官的发生都是生长素浓度梯度和转录因子表达区域相互作用的结果(benkovaetal.,2003；fleming,2005)。之所以生长素在植物生长发育中的呈现出如此重要和复杂的作用，除了与生长素需要以形成特定的浓度梯度发挥作用以外，生长素时空特异性的原位合成和稳态调节以及快速而有效地信号响应机制也是保证其精细调控不同发育事件的重要因素。因此生长素在植物组织或器官中的分布是大家关心的热点之一。
植物激素作用的组织定位，成为深入研究激素调控机理的瓶颈，其挑战主要来自于激素类小分子物质在植物体内的流动性强，原位固定难。激素影响植物发育已是不争的事实，但激素如何影响及其调控的部位和机理人们并不清楚，主要原因是人们不能有效地确定激素作用的具体部位。要确定激素作用的靶位置，必须对激素进行原位的定量和定位。激素的定量测定在技术上已经比较成功，但激素的定位，特别是整体水平的定位，目前尚无成熟的技术。因此要深入研究激素调控植物发育的机理，建立一套有效的激素原位定位技术，并利用该技术来研究激素的分布和变化，具有特别重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种在植物器官或组织中对激素进行整体定位检测的方法。
本发明所提供的在植物器官或组织中对激素进行整体定位检测的方法，不包括将待测植物的器官或组织制成切片的步骤；所述方法可包括如下步骤：
(a)将所述待测植物的器官或组织置于交联液中进行处理，所述交联液中含有能够与靶标激素交联从而形成半抗原的物质；
(b)将经步骤(a)处理过的所述待测植物的器官或组织置于渗透液中进行处理，增加渗透性；
(c)对经步骤(b)处理过的所述待测植物的器官或组织进行一抗孵育和二抗孵育，所用一抗为抗所述靶标激素的抗体，所用二抗为抗所述一抗的抗体，然后进行显色反应，从而实现在所述待测植物的器官或组织中对所述靶标激素的整体定位检测。
在步骤(a)中，所述交联液的组成如下：每100ml所述交联液中含有3g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，余量为pbst。edc可以交联生长素成为半抗原。
其中，所述pbst为在1×pbs溶液中添加0.1％(体积百分含量)吐温-20后所得溶液(注：下文出现的pbst配方与此相同)。所述1×pbs溶液的溶剂为水，溶质及浓度如下：0.13mnacl，3mmkcl，7mmna2hpo4.2h2o，3mmkh2po4；ph7.2。
在步骤(a)中，将所述待测植物的器官或组织置于所述交联液中进行处理具体可按照包括如下步骤的方法进行：将所述待测植物的器官或组织置于所述交联液中，抽气直到所述待测植物的器官或组织下沉，2-8℃(如4℃)黑暗中处理40-60分钟。
在步骤(a)和步骤(b)之间还可包括对所述待测植物的器官或组织进行固定和/或脱色素处理的步骤。
其中，所述固定可为利用4％pfa多聚甲醛固定液(ph7.2pbs配制)对所述待测植物的器官或组织进行固定。所述脱色素处理可为利用甲醇对所述待测植物的器官或组织进行脱色素。
进一步地，所述固定具体可按照包括如下步骤的方法进行的：将所述待测植物的器官或组织置于4％pfa多聚甲醛固定液(ph7.2pbs配制)中，抽气直至所述待测植物的器官或组织下沉，然后换新的4％pfa多聚甲醛固定液(ph7.2pbs配制)，4℃固定12-16h；
其中，所述4％pfa多聚甲醛固定液的配制方法如下：4克多聚甲醛溶于所述1×pbs溶液(配方见上文)中，65℃下搅拌，加50μl新配的1n的naoh，冷却后加4mlnp-40和15mldmso。
进一步地，所述脱色素处理具体可按照包括如下步骤的方法进行：为了防止材料直接进入甲醇引起细胞形态剧烈变化，将所述待测植物的器官或组织依次置于如下溶液中进行梯度置换：(a1)2％pfa多聚甲醛固定液，20min；(a2)pbst，20min；2次；(a3)pbst中添加体积百分含量为25％的甲醇后所得溶液，20min；(a4)pbst中添加体积百分含量为50％的甲醇后所得溶液，20min；(a5)pbst中添加体积百分含量为75％的甲醇后所得溶液，20min；(a6)100％甲醇，室温(20-25℃)，直到所述待测植物的器官或组织由绿色变为无色为止；(a7)甲醇：乙醇依次按体积比为3:1、2:1、1:1、1:2和1:3的比例混合后所得五份溶液，以及纯乙醇进行梯度置换，每级20min。至此步可以将材料放于-20℃长期保存。
在(a1)中，所述2％pfa多聚甲醛固定液的配制方法如下：2克多聚甲醛溶于所述1×pbs溶液(配方见上文)中，65℃下搅拌，加50μl新配的1n的naoh，冷却后加4mlnp-40和15mldmso。
在步骤(b)中，所述渗透液具体可按照如下进行配置：25ml20×ssc，0.1ml吐温-20，3gsds，用水定容到100ml；然后在65℃放置至少30分钟。
进一步地，所述20×ssc的溶剂为水，溶质及浓度如下：3mnacl，300mm柠檬酸钠；ph7.0。
在步骤(b)中，将所述待测植物的器官或组织置于渗透液中进行处理具体可按照包括如下步骤的方法进行：将所述待测植物的器官或组织置于所述渗透液中，65℃，2小时。此步进行完后，材料会变得比较软，此步可利于抗体进入材料。可根据材料的状况调整渗透时间，如果材料较难渗透时间可延长。
在步骤(b)和步骤(c)之间还可包括对所述待测植物的器官或组织进行再固定、蛋白酶k消化和/或预封闭的步骤。
其中，进行所述再固定时采用的固定液可为4％pfa/pbst。所述4％pfa/pbst的溶剂为水，溶质及浓度为：4％(体积百分含量)多聚甲醛，0.13mnacl，3mmkcl，7mmna2hpo4.2h2o，3mmkh2po4，0.1％(体积百分含量)吐温-20；ph7.2。进行所述蛋白酶k消化时采用的消化液可为向每毫升pbst中加入20微升10mg/ml的蛋白酶k后所得的溶液。进行所述预封闭时采用的封闭液可为pbst中添加体积百分含量为5％的甘氨酸后所得的溶液。
进一步地，所述再固定具体可按照包括如下步骤的方法进行：将所述待测植物的器官或组织置于所述固定液中，室温(20-25℃)固定30min，pbst洗两次，每次20min。
进一步地，所述蛋白酶k消化具体可按照包括如下步骤的方法进行：将所述待测植物的器官或组织置于所述消化液中，37℃，1小时，可轻微震荡；
进一步地，所述预封闭具体可按照包括如下步骤的方法进行：将所述待测植物的器官或组织置于所述封闭液中，室温(20-25℃)封闭4小时。
在“所述蛋白酶k消化”和“所述预封闭”之间，还可包括如下步骤：用所述封闭液(pbst中添加体积百分含量为5％的甘氨酸后所得的溶液)处理5min以终止反应，用10％dmsopbst(pbst中添加体积百分含量为10％的dmso)处理10min至30min。
在步骤(c)中，进行所述一抗孵育和所述二抗孵育时采用的抗体稀释液均可为前文所述的封闭液(即pbst中添加体积百分含量为5％的甘氨酸后所得的溶液)；进行所述一抗孵育的反应条件具体可为4℃反应12h；进行所述二抗孵育的反应条件具体可为20-25℃反应4h。
在步骤(c)中，进行所述显色反应时采用的显色液具体可为dab显色液。
进一步地，所述dab显色液的制备方法具体可如下：量取3.6ml500mmtris-hcl(ph8.0)，2ml0.2％(0.2g/100ml)nicl用蒸馏水定容至40ml作为贮液。用时加入24mgdab以及80μlh2o2。dab显色液需要现用现配。
在步骤(c)之后，还可包括对所述待测植物的器官或组织进行透明的步骤。
进一步地，进行所述透明时采用的透明液可为将三氯乙醛、甘油和水按照8:1:2的体积比混合后所得溶液。
更加具体地，在本发明中，所述在植物器官或组织中对激素进行整体定位检测的方法包括如下步骤：
(1)激素交联：将所述待测植物的器官或组织置于所述交联液(配方见上文)中，抽气直到所述待测植物的器官或组织下沉，4℃下黑暗中固定40-60分钟。
(2)过渡：用所述1×pbs溶液(配方见上文)清洗，每次10分钟，洗3遍。
(3)材料固定：换所述4％多聚甲醛固定液(配方见上文)继续抽气直至所述待测植物的器官或组织下沉，然后换新的所述4％多聚甲醛固定液(配方见上文)4℃固定12-16h。
(4)脱去色素：将所述待测植物的器官或组织依次置于如下溶液中进行梯度置换：(a1)2％pfa多聚甲醛固定液(配方见上文)，20min；(a2)pbst，20min；2次；(a3)pbst中添加体积百分含量为25％的甲醇，20min；(a4)pbst中添加体积百分含量为50％的甲醇，20min；(a5)pbst中添加体积百分含量为75％的甲醇，20min；(a6)100％甲醇，室温(20-25℃)，直到所述待测植物的器官或组织由绿色基本变为无色为止；(a7)甲醇：乙醇依次按体积比为3:1、2:1、1:1、1:2、1:3，纯乙醇进行梯度置换；每级20min。
(5)增加通透性：提前配制所述渗透液(配方见上文)，将所述待测植物的器官或组织放于所述渗透液(配方见上文)中，65℃，2小时。
(6)将所述待测植物的器官或组织置于4％pfa/pbst(配方见上文)中，室温(20-25℃)固定30min，pbst洗两次，每次20min。
(7)将所述待测植物的器官或组织置于含有蛋白酶k的所述消化液(配方见上文)中，37℃，1小时。用所述封闭液(即pbst中添加体积百分含量为5％的甘氨酸后所得的溶液)处理5min以终止反应，10％dmso/pbst(即pbst中添加体积百分含量为10％的dmso)处理10min至30min。
(8)pbst洗3次，每次10min。
(9)预封闭：在所述封闭液(即pbst中添加体积百分含量为5％的甘氨酸后所得的溶液)室温(20-25℃)封闭4小时。
(10)加一抗反应：用所述封闭液(配方见上文)稀释抗所述靶标激素的抗体，然后4℃反应12-16h。
(11)pbst洗3次，每次10min。
(12)加二抗反应：用所述封闭液(配方见上文)稀释抗所述靶标激素的抗体，然后20-25℃反应4h。
(13)pbst洗3次，每次10min。
(14)配制所述dab显色液(配方见上文)，向所述待测植物的器官或组织上加所述dab显色液，直至在所述待测植物的器官或组织的位置上出现浅褐色背景，将所述待测植物的器官或组织浸入去离子水终止反应，并漂洗几次。
(15)将所述待测植物的器官或组织置于载玻片上，滴上所述透明液(配方见上文)封片，在显微镜下拍照观察并记录
在本发明的一个实施例中，所述靶标激素具体为生物素iaa。当然所述靶标激素也可为生物素iaa以外的其他激素。
在本发明的一个实施例中，所述待测植物的器官或组织具体为拟南芥的侧根或雄蕊。当然所述待测植物的器官或组织也可以为拟南芥外的其他植物的任何器官或组织。
本发明所提供的在植物器官或组织中对激素进行整体定位检测的方法在研究激素调控植物发育中的应用也属于本发明的保护范围。
实验证明，本发明所提供的方法无需制备切片，可以在植物器官和组织中对激素进行整体原位检测。本发明方法更加快速便捷，对研究植物体内激素的分布和变化，具有特别重要的意义。
附图说明
图1为生长素iaa在拟南芥侧根生长过程中的分布。
图2为生长素iaa在拟南芥雄蕊发育过程中的分布。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
bsa：a7906amresco。
多聚甲醛paraformaldehyde：p6148sigma。
甘氨酸glycine(aminoaceticacid)：g-7403amresco。
tween-20(polyoxyethylenesorbitanmonolauratel)：p-9416amresco。
蛋白酶k：merck。
anti-mouseigg,ap偶联：promegas372b。
iaa抗体(phytodetekiaa)：agdia，pdm09346/0096。
dmso：sigma,cat.no.d5879。
edc，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐：e6383sigma。
dab，3'3-二氨基联苯胺四盐酸盐：0430amresco。
实施例1、拟南芥中生长素iaa的整体定位检测
拟南芥种植：将拟南芥种子先用70％乙醇浸泡30s，用清水清洗2-3遍；再用1％naclo溶液(10％naclo溶液稀释10倍)处理12-15min，在超净台中用无菌水清洗3遍；播种于ms培养基上。幼苗一般在ms培养基上生长14天。植物培养条件：16hrs/8hrs(光照/黑暗)光周期，22℃恒温培养。
试剂配方：ms培养基(1l)：4.4gms粉(sigmam5519)，30g蔗糖，调ph至5.8，定容至1l。加入10g琼脂粉，121℃、0.1mpa灭菌15min。
下面将详述拟南芥中生长素iaa的整体定位检测方法，以拟南芥的侧根和雄蕊分别作为检测材料。
(1)激素交联：选择要研究的材料，立即放入提前预冷的3％(edc)的交联液中，抽气直到材料下沉，4℃下黑暗中固定40-60分钟。edc可以交联生长素成为半抗原。
(2)过渡：用1×pbs溶液(ph7.2)清洗，每次10分钟，洗3遍。
(3)材料固定：换4％pfa多聚甲醛固定液(ph7.2pbs配制)继续抽气直至没有气泡冒出，材料沉入底部，然后换新的固定液4℃固定过夜(12-16h)。
10×pbs溶液：溶剂为水，溶质及浓度如下：1.3mnacl，30mmkcl，70mmna2hpo4.2h2o，30mmkh2po4；ph7.2。
pbst：1×pbs溶液中添加0.1％(体积百分含量)吐温-20。
3％edc溶液：每100ml所述交联液中含有3g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，余量为pbst。
4％pfa多聚甲醛固定液：4克多聚甲醛溶于1×pbs溶液中，65℃下搅拌，加8-10滴(50μl)新配的1n的naoh，冷却后加4mlnp-40和15mldmso。
(4)脱去色素：利用甲醇脱去材料中的叶绿素。为了防止材料直接进入甲醇引起细胞形态剧烈变化，按照如下进行梯度置换：(a1)2％pfa多聚甲醛固定液，20min；(a2)pbst，20min；2次；(a3)pbst中添加体积百分含量为25％的甲醇后所得溶液，20min；(a4)pbst中添加体积百分含量为50％的甲醇后所得溶液，20min；(a5)pbst中添加体积百分含量为75％的甲醇后所得溶液，20min；(a6)100％甲醇，室温(20-25℃)，直到所述待测植物的器官或组织由绿色变为无色为止；(a7)甲醇：乙醇依次按体积比为3:1、2:1、1:1、1:2和1:3的比例混合后所得五份溶液，以及纯乙醇进行梯度置换，每级20min。至此步可以将材料放于-20℃长期保存。
2％pfa多聚甲醛固定液：2克多聚甲醛溶于所述1×pbs溶液(配方见上文)中，65℃下搅拌，加50μl新配的1n的naoh，冷却后加4mlnp-40和15mldmso。
(5)增加通透性：提前配制渗透液，材料放于渗透液中，65℃，2小时。此步进行完后，材料会变得比较软，此步可利于抗体进入材料。可根据材料的状况调整渗透时间，如果材料较难渗透时间可延长。
渗透液：25ml20×ssc，0.1ml吐温-20，3gsds，用水定容到100ml；然后在65℃放置至少30分钟。
其中，20×ssc的溶剂为水，溶质及浓度如下：3mnacl，300mm柠檬酸钠；ph7.0。
(6)将所述待测植物的器官或组织置于4％pfa/pbst【配方：溶剂为水，溶质及浓度为：4％(体积百分含量)多聚甲醛，0.13mnacl，3mmkcl，7mmna2hpo4.2h2o，3mmkh2po4，0.1％(体积百分含量)吐温-20；ph7.2】中，室温(20-25℃)固定30min，pbst洗两次，每次20min。
(7)蛋白酶k消化(每毫升pbst中加入20微升10mg/ml的蛋白酶k)，37℃，1小时，可轻微震荡。用添加体积百分含量为5％甘氨酸的pbst处理5min以终止反应，10％dmso/pbst(pbst中添加体积百分含量为10％的mdso)处理10min至30min。
(8)pbst洗3次，每次10min。
(9)预封闭：在添加体积百分含量为5％甘氨酸的pbst中进行封闭，室温(20-25℃)4小时。
(10)加一抗反应：在添加体积百分含量为5％甘氨酸的pbst中加入iaa抗体(鼠源抗体，biorbyt公司产品，其产品目录号为orb10859)，稀释比例1：100，4℃反应过夜(12-16h)。
(11)pbst洗3次，每次10min。
(12)加二抗反应：在添加体积百分含量为5％甘氨酸的pbst中加入二抗(anti-mouseigg,ap-linkedantibody(cellsignalingtechnology7056s))稀释比例1：500，室温(20-25℃)反应4小时。
(13)pbst洗3次，每次10min。
(14)配置dab显色液，向样品上加dab显色液进行染色，直至在材料的位置上出现浅褐色背景，将样品浸入去离子水终止反应，并漂洗几次。
dab显色液：量取3.6ml500mmtris-hcl(ph8.0)，2ml0.2％(0.2g/100ml)nicl用蒸馏水定容至40ml作为贮液。用时加入24mgdab以及80μlh2o2。dab显色液需要现用现配。
(15)将样品置于载玻片上，滴上透明液封片，在显微镜下拍照观察并记录。
透明液：三氯乙醛/甘油/水按照8:1:2的体积比混匀。
生长素iaa在拟南芥侧根生长过程中的分布如图1所示；生长素iaa在拟南芥雄蕊发育过程中的分布如图2所示。由图可见，本发明所提供的方法成功的在拟南芥的侧根和花蕊中对生长素iaa进行了整体原位检测。