一种软胶囊标志性成分的检测方法与流程

本发明涉及一种高效液相分析方法，特别是涉及一种人参蜂胶软胶囊中7种标志性成分的高效液相测定方法。

背景技术：

人参蜂胶软胶囊是由人参提取物、酒制蜂胶粉为主要原料制成的软胶囊，用于辅助降血糖。其中人参中的标志性成分为人参皂苷，蜂胶中的标志性成分为黄酮类化合物。

文献报道的总皂苷测定方法有：香草醛比色法、薄层色谱法、GC法、HPLC法、LC-MS法，CE法等。保健食品评价与技术规范(2003年版)提供的保健食品中总皂苷的测定方法，是目前保健食品中总皂苷的经典测定方法。但是用此法测定含有蜂胶原料的保健食品时，由于受蜂胶、填充剂等辅助物料的影响，产品中总皂苷难以被有效提取，总皂苷含量测定结果往往与实际配方量不符，准确度差。

CN201310035767.3公开了一种以蜂胶为原料的保健食品中总皂苷的测定方法。包括标准曲线制作工序、样品处理工序、试液过柱工序、显色工序和总皂苷计算工序，标准曲线制作工序中，采用吸光度值和人参皂苷的质量做曲线，得到标准曲线，样品处理工序中，取以蜂胶为原料的保健食品0.3g得到待测试液，试液过柱工序中，采用层析柱对待测试液进行过柱操作，得到待测试液挥干蒸发皿，显色工序中，得到待测试液的吸光度值，总皂苷计算工序中，得到以蜂胶为原料的保健食品中总皂苷的含量。

由于比色法未经色谱分离，专属性差，如果采用紫外分光光度法测定人参蜂胶软胶囊或类似产品的总皂苷和总黄酮含量，因此很容易出现假阳性，不能准确、有效的控制产品质量。因此需要建立一种准确可控的质量分析方法用于检测人参蜂胶软胶囊中的标志性成分，以克服上述现有技术的缺点。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述缺陷，采用高效液相色谱法同时测定白杨素、高良姜素、乔松素、咖啡酸苯乙酯、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1等7种标志性成分，为人参蜂胶软胶囊质量标准制定提供依据。

本发明的技术方案如下：

采用HPLC法，色谱条件如下：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm；5μm，载碳量9～11％)；流动相A为0.15％磷酸溶液；流动相B为乙腈；梯度洗脱条件为0-35min，19％B；35-55min，19％B→29％B；55-70min，29％B；70-80min，29％B→37％B；80-110min，37％B；体积流量1.0ml/min，人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1检测波长为203nm，白杨素、高良姜素检测波长为270nm，乔松素检测波长为289nm，咖啡酸苯乙酯检测波长为329nm，进样量10μl。

供试品溶液的制备：取人参蜂胶软胶囊10粒，剪开，将内容物混合均匀，精密称取1.5g置于具塞锥形瓶中，精密加入乙醇50ml，称重，超声40min取出，放凉，用乙醇补足重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

混合对照溶液的制备：取白杨素、高良姜素、乔松素、咖啡酸苯乙酯、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每1ml含白杨素、高良姜素、乔松素各1mg，咖啡酸苯乙酯0.4mg，人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1各0.7mg的混合对照品储备液，精密量取上述混合对照品储备溶液加乙醇醇稀释制成混合对照溶液，其中每1ml含白杨素、高良姜素、乔松素各100μg，咖啡酸苯乙酯40μg，人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1各70μg。

蜂胶阴性对照溶液：取人参提取物，按软胶囊制备方法制得软胶囊内容物，按供试品溶液制备方法，制得蜂胶阴性样品溶液。

人参阴性对照溶液：取酒制蜂胶，按软胶囊制备方法制得软胶囊内容物，按供试品溶液制备方法，制得人参阴性样品溶液。

人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1检测波长为203nm，处于末端吸收。蜂胶中的成分复杂，在此波长条件下，对人参皂苷的检测带来很大的干扰，需要严格的分离条件；对于蜂胶中的白杨素、高良姜素、乔松素、咖啡酸苯乙酯而言，其附近也有其他峰干扰(如图3所示峰4白杨素前面的干扰峰，峰5高良姜素前面的干扰峰，如图2所示峰6乔松素后面的干扰峰，以及峰5和峰6之间的相互干扰，图4所示峰7咖啡酸苯乙酯前面及后面的干扰峰)，在选择多波长检测的前提下，进一步优化色谱系统(如选择载碳量低的色谱柱，载碳量9～11％)，从而降低其他峰的干扰。

本发明检测结果表明：各主成分色谱峰之间有良好的分离度，人参皂苷Rg1进样量在0.14～1.41μg(R²＝0.9993)；人参皂苷Re进样量在0.14～1.39μg(R²＝0.9992)；人参皂苷Rb1进样量在0.14～1.44μg(R²＝0.9996)；白杨素进样量在0.20～2.04μg(R²＝0.9994)；高良姜素进样量在0.20～2.01μg(R²＝0.9992)；乔松素进样量在0.21～2.11μg(R²＝0.9995)；咖啡酸苯乙酯进样量在0.08～0.82μg(R²＝0.9991)与峰面积呈良好线性关系；各组分平均回收率在97.35％～100.75％，RSD均小于2.0％；该检测方法结果准确可靠，可以作为人参蜂胶软胶囊质量标准的含量测定方法。

附图说明

图1：检测波长203nm条件下供试品溶液、混合对照溶液及人参阴性对照溶液HPLC图；

图2：检测波长289nm条件下供试品溶液、混合对照溶液及蜂胶阴性对照溶液HPLC图；

图3：检测波长270nm条件下供试品溶液、混合对照溶液及蜂胶阴性对照溶液HPLC图；

图4：检测波长329nm条件下供试品溶液、混合对照溶液及蜂胶阴性对照溶液HPLC图；

图1-4中：峰1为人参皂苷Rg1；峰2为人参皂苷Re；峰3为人参皂苷Rb1；峰4为白杨素；峰5为高良姜素；峰6为乔松素；峰7为咖啡酸苯乙酯。

具体实施例

实施例1 专属性

色谱条件

Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6mm×250mm；5μm，载碳量10％)；流动相A为0.15％磷酸溶液；流动相B为乙腈；梯度洗脱条件为0-35min，19％B；35-55min，19％B→29％B；55-70min，29％B；70-80min，29％B→37％B；80-110min，37％B；体积流量1.0ml/min，人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1检测波长为203nm，白杨素、高良姜素检测波长为270nm，乔松素检测波长为289nm，咖啡酸苯乙酯检测波长为329nm。

供试品溶液的制备：取人参蜂胶软胶囊10粒，剪开，将内容物混合均匀，精密称取1.5g置于具塞锥形瓶中，精密加入乙醇50ml，称重，超声40min取出，放凉，用乙醇补足重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

蜂胶阴性对照溶液：取人参提取物，按软胶囊制备方法制得软胶囊内容物，按供试品溶液制备方法，制得蜂胶阴性样品溶液。

人参阴性对照溶液：取酒制蜂胶，按软胶囊制备方法制得软胶囊内容物，按供试品溶液制备方法，制得人参阴性样品溶液。

混合对照溶液的制备：取白杨素、高良姜素、乔松素、咖啡酸苯乙酯、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每1ml含白杨素、高良姜素、乔松素各1mg，咖啡酸苯乙酯0.4mg，人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1各0.7mg的混合对照品储备液，精密量取上述混合对照品储备溶液加乙醇醇稀释制成混合对照溶液，其中每1ml含白杨素、高良姜素、乔松素各100μg，咖啡酸苯乙酯40μg，人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1各70μg。色谱图见图1～4。结果表明，阴性样品无干扰。

实施例2 线性

精密吸取按“实施例1”项下方法制备的混合对照品储备液0.5、1.0、2.0、2.5、3.0、4.0ml，分别置于5mL量瓶中，用乙醇定容，摇匀，与储备液一起作为系列质量浓度的混合对照品溶液。分别吸取上述系列混合对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积(Y)对浓度(X)进行线性回归，得回归方程，

人参皂苷Rg1：Y＝5991.7X+111244，R²＝0.9993，线性范围14.12μg/ml～141.20μg/ml；

人参皂苷Re：Y＝10125X+12378，R²＝0.9992，线性范围13.92μg/ml～139.20μg/ml；

人参皂苷Rb1：Y＝3366.2X+45705，R²＝0.9996，线性范围14.39μg/ml～143.90μg/ml；

白杨素：Y＝50068X+491441，R²＝0.9994，线性范围20.42μg/ml～204.20μg/ml；

高良姜素：Y＝29078X+282400，R²＝0.9992，线性范围20.14μg/ml～201.40μg/ml；

乔松素：Y＝51476X-73619，R²＝0.9995，线性范围21.08μg/ml～210.80μg/ml；

咖啡酸苯乙酯：Y＝25315X+180598，R²＝0.9991，线性范围8.22μg/ml～82.16μg/ml。

实施例3 仪器精密度

精密吸取线性关系考察项下中间质量浓度的混合对照品溶液，连续进样6次，按上述色谱条件注入液相色谱，记录色谱图，测定各待测物质峰面积值。结果人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、白杨素、高良姜素、乔松素、咖啡酸苯乙酯峰面积的RSD(n＝6)分别为0.30％、0.31％、0.33％、0.22％、0.29％、0.37％、0.38％，表明仪器精密度良好。

实施例4 溶液稳定性

取同一份供试品溶液，设置进样器温度为4℃，分别于0、2、4、6、8、12、24h按上述色谱条件注入液相色谱仪，记录色谱图，测定各待测成分峰面积。结果供试品溶液在24h内色谱峰面积无明显变化，人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、白杨素、高良姜素、乔松素、咖啡酸苯乙酯峰面积的RSD分别为1.04％、1.11％、0.93％、1.03％、1.07％、0.92％、1.48％，表明供试品溶液在制备后置于4℃条件下24h内稳定性良好。

实施例5 重复性

取同一批样品6份，按“实施例1”项下方法制备供试品溶液，依法测定各物质的含量。结果人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、白杨素、高良姜素、乔松素、咖啡酸苯乙酯的平均质量分数分别为0.22％、0.31％、0.51％、0.94％、0.49％、0.32％、0.55％，RSD分别为1.37％、1.31％、1.19％、1.25％、1.06％、1.14％、1.65％。

实施例6 回收率

取的样品6份，每份约1.0g，精密称定，分别精密加入对照品溶液适量，按“实施例1”项下方法制备供试品，照上述色谱条件注入液相色谱仪，记录色谱图，计算回收率。结果人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、白杨素、高良姜素、乔松素、咖啡酸苯乙酯的平均回收率为97.35％、98.47％、99.26％、100.75％、100.69％、99.34％，98.17％。

实施例7 含量测定

取3批不同批次人参蜂胶软胶囊，按“实施例1”项下方法制备供试品，并照上述色谱条件注入液相色谱，记录色谱图，计算含量。结果见表1。

表1 样品测定结果

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。