本发明属于微藻胞内色素的快速无损检测技术，特别涉及一种基于荧光检测技术的快速无损检测三角褐指藻胞内岩藻黄素的方法。
背景技术：
：岩藻黄素是一种参与光合作用的类胡萝卜素，占自然界总类胡萝卜素的10％以上，广泛存在于褐藻、硅藻和金藻等藻类中。岩藻黄素在藻类细胞中与叶绿素和蛋白组合成一个fcp复合体，在光合作用的光捕获、光能传递、光保护等生理作用中扮演重要的角色。岩藻黄素具有一个独特的丙二烯结构和5,6-环氧结构(化学结构式如下)，区别于其他常见的类胡卜素(如β-胡萝卜素、番茄红素、虾青素等)。研究证明，岩藻黄素具有显著的抗氧化、消炎、抗癌、减肥等医学功效，并对治疗糖尿病、保肝护肝、抗辐射、保护皮肤、抑制血管增生、脑血管疾病治疗、骨骼保护、保护视力、和抗疟疾等方面具有显著疗效。岩藻黄素强大的抗氧化性能被证明是以食用褐藻中dpph(1,1-二苯基-2-苦基肼)清除自由基的形式体现的。海洋硅藻(尤其是三角褐指藻)在混合营养连续培养条件下生物量可高达10g·l-1～25g·l-1，经诱导后积累的天然岩藻黄素约占干重的1.5～3％，其含量高于远远高于大型海藻，是岩藻黄素的新来源，安全无毒，有利于降低生产成本。目前分析测定岩藻黄素的传统方法是高效液相色谱法(hplc)、紫外光检测法(uv)。hplc法样品干燥、提取、分析流程时间长，用于岩藻黄素的生产工艺和质量控制费时费力。由于通常岩漠黄质样品自身含有大量的杂色素，而uv法前处理方法又过于简洁，没有对杂色素的干扰采取任何相应的预处理措施，因此存在很大的局限性。开发一种可提高检测效率、简化检测工序、杂色素干扰少的三角褐指藻岩藻黄素检测方法非常有必要。技术实现要素：针对现有技术的以上缺陷，本发明提供一种快速无损检测三角褐指藻胞内岩藻黄素的方法，该方法检测速度快，检测工序简单，且杂色素干扰少。本发明的技术目的是通过以下技术方案来实现的：本发明所述的快速无损检测三角褐指藻胞内岩藻黄素的方法,包括如下步骤：s1：建立标准曲线：取含量已知的三角褐指藻悬浮液已知样品，重悬从所述已知样品中收集的藻细胞，调整重悬液中藻细胞的细胞密度，用流式细胞仪检测藻细胞在533nm或585nm发射波长下的平均荧光强度值；将所述三角褐指藻悬浮液样品的岩藻黄素含量的对数值和相应测得的平均荧光强度值的对数值作线性回归,即得标准曲线；s2：制备待测样品：重悬从待测三角褐指藻悬浮液样品中收集的藻细胞成待测品重悬液，调整所述待测品重悬液中藻细胞的细胞密度，即得待测样品；s3:用流式细胞仪检测待所述待测样品中藻细胞在在533nm(fl1通道)或585nm(fl2通道)发射波长下的平均荧光强度值，根据步骤s1建立的标准曲线，计算所述待测样品中的岩藻黄素含量。本发明优选地，所述步骤s1和s2中藻细胞的细胞密度均需调整至6×105～2×106cfu/ml之间。本发明具地，所述步骤s1中，在533nm发射波长下的平均荧光强度值，获得的线性回归曲线为y＝2.2378x–7.1675(r2＝0.8787)，y表示三角褐指藻胞内岩藻黄素含量(mg/g干燥粉)的常用对数值，x表示流式细胞术测定在533nm发射波长下的平均荧光强度的常用对数值；在585nm发射波长下的平均荧光强度值，获得的线性回归曲线为y＝2.438x–6.3187(r2＝0.9267)，y表示三角褐指藻胞内岩藻黄素含量(mg/g干燥粉)的常用对数值，x表示流式细胞术测定在585nm发射波长下的平均荧光强度的常用对数值。本发明更具体地，所述步骤s1和s2中重悬采用磷酸盐缓冲液，其浓度为10mm，ph为6.8～7.6。本发明更具体地，，所述流式细胞仪在检测样品的荧光强度值时的进样流速在14～100ul/min之间；优选流速为35ul/min。更进一步地，所述步骤s1中的已知样品及步骤s2中待测样品在用流式细胞仪检测前还需用孔径5～40μm的水相滤膜或有机相滤膜过滤；所述步骤s1和s3中的对数值是以10为底的对数。本发明具体地，所述步骤s1中所述已知样品的岩藻黄素含量采用hplc法或紫外可见分光光度计法测定。本发明更具体地，所述步骤s1中已知样品的岩藻黄素含量通过hplc法测定,包括以下测定步骤：a)、已知样品的峰面积测定：将三角褐指藻悬浮液样品冻干为藻粉,从所述藻粉中提取获得岩藻黄素提取物,用甲醇和甲基叔丁基醚按照体积比1：9～9:1混合后溶解所述岩藻黄素提取物，然后用高效液相仪测定其液相峰面积；b)、建立hplc法标准曲线：用甲醇和甲基叔丁基醚按照体积比1：9～9:1的混合溶剂将岩藻黄素标准品配制若干浓度梯度的岩藻黄素标准品溶液，测定所述若干个浓度梯度的岩藻黄素标准品溶液的液相峰面积，将标准溶液的液相峰面积与相应的标准品溶液浓度做线性回归，绘制hplc法标准曲线；c)、根据步骤b)中建立的hplc法标准曲线,计算步骤a)测定的已知样品的峰面积所对应的已知样品的岩藻黄素含量。更进一步地，所述步骤a)中，用液相色谱仪检测时，柱温箱温度为25～35℃，洗脱液流速控制为0.5～1.5ml/min；所述液相色谱仪还配备有pda检测器，在检测时，检测器在440nm进行岩藻黄素的检测，同时在300～800nm对样品进行全波长扫描；液相色谱检测条件：检测波长为440nm，色谱柱为ymctmc30；甲醇、甲基叔丁基醚分别为流动相a、b，以流动相a、b组成的洗脱液进行梯度洗脱，流动相梯度洗脱程序及各流动相的体积百分比为：0～6min，流动相a95％→80％，流动相b5％→20％；6～12min，流动相a80％→60％，流动相b20％→40％；12～19min，流动相a60％→55％，流动相b40％→45％；19～20min，流动相a55％→95％，流动相b45％→5％；20～23min，流动相a95％，流动相b5％。本发明更进一步地，所述步骤a)中岩藻黄素提取物通过如下步骤获得：a1)、将藻粉加入甲醇和丙酮1：9～9:1混合提取溶剂中，振荡，冷却，离心收集上清液；a2)、所得沉淀加入至所述混合提取溶剂中，振荡，置于冷却，离心收集上清液；a3)、重复该步骤a2)直至藻粉呈无色为止合并所有上清液，用氮气吹干。与现有的岩藻黄素的含量检测技术相比较，本发明具有以下显著优点：本发明实现了三角褐指藻胞内岩藻黄素的快速无损检测，极大地简化了检测步骤，在建立标准曲线后，检测样品时无需对样品进行提取操作，样品前处理简单，缩短了检测时间，同时非常适宜用于微藻细胞尤其是三角褐指藻细胞内岩藻黄素的快速无损检测分析。附图说明图1为本发明所述的三角褐指藻(p.tricornutum)在不同条件下培养过程中干重的变化情况。图2为本发明所述的三角褐指藻(p.tricornutum)在不同条件下培养过程中od值的变化情况。图3为本发明所述的三角褐指藻(p.tricornutum)在不同条件下培养过程中细胞密度的变化情况。图4为本发明所述的三角褐指藻(p.tricornutum)的荧光光谱图。图5为本发明所述的三角褐指藻(p.tricornutum)在不同条件下培养过程中fl1(533nm)平均荧光强度值的变化情况。图6为本发明所述的三角褐指藻(p.tricornutum)在不同条件下培养过程中fl2(585nm)平均荧光强度值的变化情况。图7为本发明所述的三角褐指藻细胞的平均荧光强度fl1与hplc法测定的胞内岩藻黄素含量的线性回归分析。图8为本发明所述的三角褐指藻细胞的平均荧光强度fl2与hplc法测定的胞内岩藻黄素含量的线性回归分析。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加明确，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。流式细胞术(flowcytometry)可在488nm下激发三角褐指藻胞内的岩藻黄素发射荧光，并分别检测三角褐指藻细胞在533nm(fl1通道)和585nm(fl2通道)发射波长下的平均荧光强度。本申请发明人发现这两个特定发射波长下的平均荧光强度与三角褐指藻胞内岩藻黄素含量之间存在高度正相关性。通过测定该平均荧光强度，并与hplc测定结果相匹配，可以准确、快速、无损地反映岩藻黄素积累情况。该方法与常规方法相比，可以大大提高检测灵敏度，检测速率也更快。流式细胞术对发射荧光的细胞可以进行快速无损分析测定，在岩藻黄素快速检测方面有着重要的应用价值。一、三角褐指藻胞内岩藻黄素含量的变化趋势进行研究。1.1菌种活化及种子液制备将三角褐指藻p.tricornutum菌种转接到f/2人工海水培养基的斜面上进行培养，其中人工海水通过人工海盐instantocean进行配置。盐度25‰，ph值8.0，培养温度20℃，光照强度1000lux，并观察三角褐指藻的生长情况。从斜面上挑取三角褐指藻藻苔置于f/2人工海水培养基中，盐度25‰，ph值8.0，在20℃，1000lux条件下进行培养，培养至8～10天用作种子液。其中f/2培养基配方如表1所示。表1f/2培养基配方组分含量(mg/l)组分含量(mg/l)组分含量(mg/l)nano375na2edta·2h2o4.36×10﹣3cocl2·6h2o10.0×10﹣6nah2po4·h2o5cuso4·5h2o9.8×10﹣6mncl2·4h2o180.0×10﹣6na2sio3·9h2o30na2moo4·2h2o6.3×10﹣6fecl3·6h2o3.15×10﹣3znso4·7h2o22.0×10﹣61.2三角褐指藻在不同条件下培养积累岩藻黄素1.2.1三角褐指藻培养条件设计采用f/2人工海水培养基，盐度25‰、ph8.0、光照强度1500lux，自养时氮源为f倍硝酸钠(图中标记为自养)；分别以0.05、0.1、0.15mol/l的甘油为碳源，以0.01mol/l的硝酸钠为氮源进行培养(图中标记为0.05mol/l、0.1mol/l、0.15mol/l)；以0.1mol/l的甘油为碳源，以含氮量0.01mol/l的尿素和胰蛋白胨为氮源进行培养(图中标记为尿素、硝酸钠)。1.2.2三角褐指藻胞内岩藻黄素的hplc检测方法1.2.2.1三角褐指藻胞内岩藻黄素的提取方法准确称量冻干后的藻粉10mg置入装有陶瓷珠的冻存管中添加适量陶瓷珠。加入事先预冷的提取液(甲醇和丙酮按体积比1:1进行制备)使岩藻黄素全部溶解在甲醇和丙酮中，用量为1ml/次，用震荡器震荡30s，用液氮进行迅速冷却，离心收集上清液至15ml离心管，多次反复进行，直至藻粉变成白色。合并所有上清液后，用氮气在通风橱内将离心管内有机溶剂吹干，用甲醇和叔丁基甲醚(mtbe)混合液(体积比1:1，含0.1％bht)定容至0.50ml，用于后续三角褐指藻中岩藻黄素的hplc分析。全程在无光或弱光条件下进行。1.2.2.2岩藻黄素的hplc测定方法色谱柱：ymccarotenoidcolumnc30柱(4.6×150mm，3μm)；流速为0.80ml/min，柱温为40℃，进样量为20μl。pda检测器检测波长在300～800nm进行全波长扫描以测定色素吸收光谱图，同时在440nm波长下测定岩藻黄素含量。流动相由甲醇(a)和叔丁基甲醚mtbe(b)进行梯度洗脱，洗脱条件为：0～6min，95％→80％a、5％→20％b；6→12min，80％→60％a、20％→40％b；12→19min，60％→55％a、40％→45％b；19→20min，55％→95％a、45％→5％b；20→23min，95％a、5％b。岩藻黄素的定性分析采用保留时间和吸收光谱图进行分析，定量分析采用标准品制作的标准曲线进行分析。岩藻黄素标准曲线的制作：准精确称取1.0mg岩藻黄素标准样品，用甲醇和叔丁基甲醚(mtbe)混合液(体积比1:1，含0.1％bht)定容至10ml，配成质量浓度为100μg·ml-1的标准液。分别取50μl、100μl、200μl、400μl、800μl、1200μl标准液，用甲醇和叔丁基甲醚(mtbe)混合液(体积比1:1，含0.1％bht)定容至2ml，配成质量浓度分别为2.5、5、10、20、40、60μg·ml-1的梯度值。采用hplc测定，以液相峰面积(mau·min)为纵坐标，以色素含量(μg·ml-1)为横坐标并绘制标准曲线：y＝1.0665x+0.3374(r2＝0.9943)，其中x表示岩藻黄素浓度(μg·ml-1)，y表示液相峰面积(mau·min)1.2.3三角褐指藻生物量和胞内岩藻黄素含量的变化规律以干重、od值、细胞密度为指标，反映不同条件下三角褐指藻的生长情况。如图1、2、3所示，分别反映了不同条件下三角褐指藻的干重、od值、细胞密度随时间的变化。通过图可以看出，不同培养条件下三角褐指藻的生长情况不同，以0.1mol/l甘油为碳源，0.01mol/l胰蛋白胨为氮源的条件下，三角褐指藻的生长状况相对较好。在培养至第10天时，干重可达到2.4g/l，高于自养4倍以上。二、三角褐指藻胞内岩藻黄素含量与三角褐指藻细胞的平均荧光强度的相关性岩藻黄素在特定波长激发后，可以分别呈现最大的发射波长，这与其在细胞内的含量是相关的。使用荧光分光光度计测量三角褐指藻的荧光光谱图，测定条件如下：设定激发波长为488nm，检测波长为500～800nm，电压为650v。测定结果如图4所示。三个峰的最大波长值分别为527.2nm、584.6nm、680.8nm，其中680.8nm处为叶绿素。研究表明，岩藻黄素的荧光强度可达525nm。因此岩藻黄素应选用流式细胞仪fl1、fl2通道测其平均荧光强度。2.1流式细胞仪的检测参数：在流式细胞仪的流速控制(fluidics)设置方面，为了实现最好的检测效果，需要对进样流速进行控制优化，进样流速可以设定为14～100μl/min之间。在设定进样流速时，需要保证检测的细胞速率为2500个/秒(events/sec)及以下，否则会影响测定值的准确性。在样品测定过程，为保证实验的准确性，可设定固定的流速为35μl/min。在检测阈值(threshold)设置方面，则设定前向角散射光的峰高参数(fsc-h)为80000。在色彩补偿(setcolorcompensation)的设定方面，可以设置补偿值均为0％。在进样控制(runsettings)设置方面，可分别选择细胞数(events)、进样时间(time)、进样体积(volumn)进行设定，保证最终检测的目标细胞数在10000个以上。2.2流式细胞仪检测所用待测样品的前处理方法待测样品在分析前，采用4500r/m转速分离收集三角褐指藻培养液中的藻细胞，再采用去离子水悬浮，重复两次后重新悬浮。制成的重悬液要保证三角褐指藻细胞密度为6×105～2×106cfu/ml之间，一方面要满足流式细胞仪的进样要求(每ml中细胞数或颗粒数为1×103～5×106)，另一方面过高或过低的细胞密度都会影响荧光值的准确测定。置于2ml离心管中用于样品测定，进样前要摇匀，保证样品检测结果的准确性。2.3样品检测和分析三角褐指藻胞内的岩藻黄素在流式细胞仪配备488nm氩离子激光器的激发下可以发射不同波长的荧光，但荧光强度可能差异很大。通过划门选定所有的三角褐指藻细胞，流式细胞仪自动计算出三角褐指藻细胞在fl1通道和fl2通道的平均荧光强度。将不同条件下，三角褐指藻在第0、2、4、6、8天的fl1、fl2通道的平均荧光强度做成折线图如图5、6所示。图6为三角褐指藻p.tricornutum在不同条件下培养过程中fl1(533nm)平均荧光强度值的变化情况；培养条件为：f/2人工海水培养基，盐度25‰、ph8.0、光照强度1500lux，自养时氮源为f倍硝酸钠(图表中标记为自养)；分别以0.05、0.1、0.15mol/l的甘油为碳源，以0.01mol/l的硝酸钠为氮源进行培养(图表中标记为0.05mol/l、0.1mol/l、0.15mol/l)；以0.1mol/l的甘油为碳源，以含氮量0.01mol/l的尿素和胰蛋白胨为氮源进行培养(图表中标记为尿素、硝酸钠)。三、三角褐指藻细胞平均荧光强度与hplc法测得的岩藻黄素含量的线性回归分析为了实现对于三角褐指藻胞内岩藻黄素含量的快速准确分析，本实验通过流式细胞仪测定不同条件、不同培养阶段细胞的平均荧光强度，并与三角褐指藻胞内的岩藻黄素含量进行线性回归分析，从而确定了流式细胞术快速准确无损检测方法。通过hplc法测定不同培养条件、不同培养阶段三角褐指藻的岩藻黄素含量。将这些岩藻黄素含量测得值(单位按mg/g计，表示每克干藻粉中岩藻黄素的含量)的以10为底的常用对数值作为纵坐标，同时分别与相应的在流式细胞术fl1和fl2通道的平均荧光强度值的以10为底的常用对数值作为横坐标，进行作图，并进行线性回归分析，结果如图7、图8所示。如图7所示，针对fl1通道的平均荧光强度值，获得的线性回归曲线为y＝2.2378x–7.1675(r2＝0.8787)，式中y表示三角褐指藻胞内岩藻黄素含量(mg/g干燥粉)的常用对数值，x表示流式细胞术测定fl1通道的平均荧光强度的常用对数值；如图8所示，针对fl2通道的平均荧光强度值，获得的线性回归曲线为y＝2.438x–6.3187(r2＝0.9267)，式中y表示三角褐指藻胞内岩藻黄素含量(mg/g干燥粉)的常用对数值，x表示流式细胞术测定通道fl2的平均荧光强度的常用对数值。由图7、8可知，三角褐指藻胞内岩藻黄素含量与通道fl1和fl2细胞平均荧光强度之间的线性回归系数平均值分别达到0.8787和0.9267，说明两者之间存在高度正相关性，其中来自fl2通道的线性相关性要优于fl1通道。这表明可以采用流式细胞术测定fl1通道、fl2通道的细胞平均荧光强度来快速无损分析检测三角褐指藻胞内岩藻黄素的含量，但是以采用流式细胞术测定fl2通道的细胞平均荧光强度更佳。四、三角褐指藻胞内岩藻黄素的流式细胞术测定法的方法学研究通过第三部分可知，采用流式细胞术测定通道fl2的细胞平均荧光强度与岩藻黄素含量之间存在高度相关性，建立的线性回归方程可以用来快速无损检测分析三角褐指藻胞内岩藻黄素含量。本实施例进一步验证了该流式细胞术测定法的准确度和精密度。4.1线性回归曲线和定量下限采用流式细胞术回归曲线分析可知，采用通道fl2的平均荧光强度值得到的线性回归曲线为y＝2.438x–6.3187(r2＝0.9267)，式中y表示三角褐指藻胞内岩藻黄素含量的常用对数值(以10为底的对数)，x表示流式细胞仪测定通道fl2平均荧光强度的常用对数值(以10为底的对数)。该线性回归曲线的相关系数为r2＝0.9267，这表明采用平均荧光强度值来测定岩藻黄素含量具有高度相关性。该线性回归曲线测定的最低平均荧光强度(fl2)为632.3，则计算得出的三角褐指藻胞内岩藻黄素含量的定量下限为3.24mg/g干藻粉。4.2精密度试验采用已知岩藻黄素含量为4.29mg/g干藻粉的三角褐指藻细胞进行流式细胞术测定分析，具体是：按照第二部分中2.1设置检测参数、按照实施例2中2.2对样品进行处理，按照实施例2中2.3对样品进行检测分析，取检测样品在fl2通道的平均荧光强度值，然后按照线性回归曲线y＝2.438x–6.3187(r2＝0.9267)计算得岩藻黄素含量的测定值。重复测定5次进行精密度试验，试验结果如表3所示。表35次精密度试验实验结果精密度试验表明，采用流式细胞仪测定法的重复性良好，测定方法比较稳定，精密度良好。以上试验表明，本发明采用流式细胞术测定法可快速无损检测分析三角褐指藻胞内岩藻黄素含量，其线性回归曲线、精密度试验均符合要求。显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。当前第1页12