本发明属于分析化学领域，具体涉及一种基于高效液相色谱法分离结构近似的黄酮类成分的方法及其应用。
背景技术：
黄酮类化合物是以2-苯基色原酮为母核的一系列化合物，其具有广泛的生理活性，如抗氧化、抗炎、抗过敏、修复受损dna等等。但是因为其母核结构相对简单，取代基类型比较有限，主要是羟基、甲氧基、糖基等，导致结构相近的黄酮类化合物即使借助高效液相系统也难以分离。例如金丝桃苷(结构式如1所示)、异槲皮苷(结构式如2所示)、槲皮苷(结构式如3所示)、紫云英苷(结构式如4所示)、杨梅素(结构式如5所示)、槲皮素(结构式如6所示)和山柰酚(结构式如7所示)；尤其是紫云英苷和槲皮苷在液相分析时容易造成混淆。
本发明人在研究中发现，紫云英苷(又称为黄芪苷)和槲皮苷如果以混合标准品的形式注入高效液相色谱仪，采用如下的色谱条件：
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：乙腈(a)和0.1％磷酸水溶液(b)，采用梯度洗脱：0-60min，10％～35％a，其余为b；紫外检测器，检测波长：360nm。
结果在保留时间27.3min左右仅出现了一个色谱峰(具体见图1a和图1b)。说明上述色谱条件无法实现紫云英苷和槲皮苷的分离。如果将上述条件应用于以黄酮类化合物为活性成分的中药材及其提取物和制剂的质量控制，则会造成检测结果不准确。因此，有必要对黄酮类化合物的高效液相色谱条件做进一步研究，使得各个相近似的成分能够实现分离，达到检测的要求。
另外，中药成分复杂、功效多的作用特点使得利用单一成分难以全面评价中药质量，因此多成分多指标的控制方式成为必然的趋势，但是这种质量控制方式却又带来了检测费用高昂和操作繁琐等问题(王智民，等.一测多评法建立的技术指南[j].中国中药杂志，2011，36(6)：657-658)。研究人员发现，不同物质之间在紫外检测器中的响应-浓度比的比值是一个常数，并将该常数定义为相对校正因子(罗祖良，等.相对校正因子在中药多指标测定中的应用研究进展[j].中草药，2012，43(7)：1448-1452)。在进行多指标质量评价时，以药材中某一典型组分(如有对照品供应者)为内标化合物，建立其他组分与该内标化合物之间的相对校正因子后，就可以通过该相对校正因子计算出其他组分的含量。这种只通过测定一个成分，实现同时对多个成分定量的方法命名为一测多评法。近年来，一测多评技术已成功运用于一些常见中药的多种成分含量测定中，如蓝天凤等报道了利用一测多评法测定丹参中4中丹参酮类成分(蓝天凤，等.一测多评法测定丹参中4种丹参酮类成分[j].中草药，2012，43(12)：2420-2423)。但是一测多评法测定的基础仍然是在适当的条件下能够使所检测的成分实现较好的分离。
柿叶为柿科植物柿(diospyroskakithunb.)的叶，主要含有多种黄酮类化合物，具有止咳定喘，生津止渴，活血止血之功效。以单味柿叶的提取物加工制成的脑心清片有活血化瘀、通络的功效，用于脉络淤阻，眩晕头痛，肢体麻木，胸痹心痛，胸中憋闷，心悸气短；冠心病，脑动脉硬化症见上述症候者。现行《中国药典》脑心清片和柿叶提取物的含量测定项下仅采用hplc测定经盐酸水解后的槲皮素和山柰酚两个苷元的总量作为质控指标，对脑心清片或其中间体(柿叶提取物)尚未建立完善的质量控制方法。
现有技术中，虽然有基于hplc法同时测定柿叶及其提取物和制剂中多个黄酮类成分的报道。但是尚未有同时测定紫云英苷和槲皮苷的技术。如安淼等报道了同时测定芦丁、山柰素、异鼠李素、槲皮素、异槲皮苷、紫云英苷(安淼，等.同时测定6种柿叶黄酮类物质方法的建立[j].山东农业科学，2016，48(5)：131-136)；张梦雨等同时测定了脑心清原料药及其片剂中原儿茶酸、金丝桃苷、山柰酚-3-o-β-d-吡喃葡萄糖苷(即紫云英苷)、山柰酚-3-o-β-d-吡喃半乳糖苷、杨梅素、槲皮素、柚皮素和山柰酚8种成分(张梦雨，等.高效液相色谱-质谱联用法同时测定脑心清原料药浸膏及其片剂中的8种有效成分[j].色谱，2016，34(8)：773-777)；中国发明专利申请，“一种柿叶提取物中黄酮类有效成分的定性”披露了，采用高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱仪检测牡荆素、金丝桃苷、黄芪苷、三叶豆苷、杨梅素、槲皮素和/或山柰酚(公开号cn106706788a，公开日2017年5月24日)。原因可能是上述研究采用的色谱条件未能将紫云英苷和槲皮苷分离开。而且这些方法均是依据外标法，需要多个相应的标准品，分别建立各个成分的标准曲线，操作繁琐、费时、检测成本高，不适用于工业化生产质量控制的要求。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，基于高效液相色谱法，本发明提供一种分离结构近似的黄酮类成分的方法。本发明的方法首次实现了槲皮苷和紫云英苷的分离。
为了实现上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：
一种分离结构近似的黄酮类成分的方法，所述方法基于高效液相色谱法，所述结构近似的黄酮类成分包括紫云英苷和槲皮苷；所述高效液相法的色谱条件为：
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶；
流动相：流动相a为乙腈，流动相b为0.05％～0.5％(体积百分比)磷酸水溶液，采用梯度洗脱：0-40min，7％～25％a，其余为b；40-60min，25％～50％a，其余为b；
流速：0.5～3.0ml/min；优选为1.0～1.2ml/min；更优选为1.0ml/min；
检测波长：200～400nm；优选为360nm；
柱温：25～35℃；优选为30℃；
进样量：2～20μl；优选为10μl。
优选的，所述流动相b为0.1％(体积百分比)磷酸水溶液。
优选的，所述结构近似的黄酮类成分还包括金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和山柰酚中的一种或多种。
本发明的另一个目的在于提供上述方法在检测柿叶提取物或其制剂中黄酮类成分中的应用。
优选的，所述检测是指定性检测和/或定量检测。
优选的，上述应用基于一测多评法，内标化合物选自槲皮素、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、杨梅素、山柰酚和紫云英苷中的一种。
优选的，上述应用，还包括以下步骤：
i.相对校正因子的建立，具体操作为：
i-1.系列混合对照品溶液的制备
分别精密称取包括所述内标化合物的黄酮类成分的对照品，置于容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，得到混合对照品储备液；分别精密吸取一系列不同体积的所述混合对照品储备液置于容量瓶中，甲醇稀释至刻度线，摇匀，即得系列混合对照品溶液，备用；
i-2.相对校正因子fk/s的计算
取步骤i-1制备得到的系列混合对照品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪，在所述的色谱条件下进行测定，获得色谱图并进行峰面积积分，分别计算所述内标化合物对除内标化合物外的其它黄酮类成分的相对校正因子fk/s，取平均值；
ii.供试品溶液的制备：
取柿叶提取物或柿叶提取物制剂，精密称定，加入甲醇，超声提取，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
iii.内标化合物标准溶液的制备：
取所述内标化合物，精密称定，加入置于容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得；
iv.测定
取步骤ii制备得到的供试品溶液和步骤iii制备的内标化合物标准溶液10μl，分别注入高效液相色谱，在所述色谱条件下进行测定，获得色谱图并进行峰面积积分，先用外标法计算出所述内标化合物在供试品中的含量，然后按公式(1)计算各黄酮类成分的含量，
ws＝(wk×as)/(fk/s×ak)(1)，
式中ak为所述内标化合物的峰面积，wk为所述内标化合物含量；as为被测组分s的峰面积，ws为被测组分s的含量，fk/s为被测组分相对内标化合物的相对校正因子，通过步骤i所述方法建立。
优选的，所述步骤i中，所述黄酮类成分的对照品包括选自槲皮素、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、杨梅素、山柰酚、紫云英苷中的至少两种。
更优选的，所述步骤i中，所述黄酮类成分的对照品为选自槲皮素、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、杨梅素、山柰酚和紫云英苷中的全部。
优选的，所述步骤ii中，甲醇体积和所述柿叶提取物质量比为20～25ml∶0.1g；甲醇体积与所述柿叶提取物制剂质量比为20～25ml∶1g。
还优选的，所述步骤ii中，所述超声提取的条件为，功率250w，频率45khz，超声20～40min。
作为一个优选的实施方式，本发明提供一种以槲皮素为内标化合物，一测多评法测定柿叶提取物或其制剂中黄酮类成分含量的方法，所述方法基于高效液相法，测定的黄酮类成分包括金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、杨梅素、山柰酚和紫云英苷；所述高效液相法的色谱条件为：
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶；
流动相：流动相a为乙腈，流动相b为0.1％(体积百分比)磷酸水溶液，采用梯度洗脱：0-40min，7％～25％a，其余为b；40-60min，25％～50％a，其余为b；
流速：1.0ml/min；
检测波长：360nm；
柱温：30℃；
进样量：10μl；
所述方法包括如下步骤：
i.相对校正因子的建立，具体操作为：
i-1.系列混合对照品溶液的制备
分别精密称取金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、杨梅素、槲皮素、山柰酚、紫云英苷的对照品，置于25ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度线，摇匀，得到混合对照品储备液，金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、杨梅素、槲皮素、山柰酚、紫云英苷的质量浓度各自独立地为0.6～1.0mg/ml；
分别精密吸取所述混合对照品储备液10.0、5.0、3.0、2.0、1.0、0.5、0.1ml，置于25ml容量瓶中，甲醇稀释至刻度线，摇匀，制得系列混合对照品溶液；备用。
i-2.相对校正因子fk/s的计算
分别取步骤i-1制备得到的系列混合对照品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪，在所述的色谱条件下进行测定，获得色谱图并进行峰面积积分，以槲皮素对照品的峰面积为内标，按照公式(2)分别计算金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、杨梅素、山柰酚、紫云英苷的相对校正因子fk/s，取平均值，
其中，w′k为混合对照品溶液中槲皮素内标化合物的含量，a′k为槲皮素内标化合物的峰面积；w′s为被测指标组分s的含量，a′s为被测成分s的的峰面积；
ii.供试品溶液的制备：
取柿叶提取物0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入20～25ml甲醇，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率45khz)30min，取出，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
iii.槲皮素标准溶液的制备：
取槲皮素，精密称定，加入置于容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，配制成0.003～0.31mg/ml溶液，即得；
iv.测定
分别取步骤ii制备得到的供试品溶液和步骤iii制备的槲皮素标准溶液10μl，分别注入高效液相色谱，在所述色谱条件下进行测定，获得色谱图并进行峰面积积分，先用外标法计算出槲皮素在供试品中的含量，然后按公式(1)计算测定的各黄酮类成分的含量，
ws＝(wk×as)/(fk/s×ak)(1)，
式中ak为槲皮素的峰面积，wk为槲皮素含量；as为被测组分s的峰面积，ws为被测组分s的含量，fk/s为被测组分相对槲皮素的相对校正因子，通过步骤i所述方法建立。
本发明还有一个目的在于提供上述基于一测多评法测定柿叶提取物或其制剂中黄酮类成分含量的方法在测定柿叶提取物或其制剂中黄酮类成分含量中的应用。
优选的，所述黄酮类成分包括选自槲皮素、山柰酚、槲皮苷、异槲皮苷、金丝桃苷、杨梅素、紫云英苷中的至少两种。
更优选的，所述黄酮类成分包括选自槲皮素、山柰酚、槲皮苷、异槲皮苷、金丝桃苷、杨梅素、紫云英苷中的全部。
本发明所述的柿叶提取物制剂是指所述柿叶提取物加入或者不加入药学上可以接受的辅料，制备成的临床上可以接受的制剂。
本发明首次基于高效液相法实现了紫云英苷和槲皮苷的分离(具体见图2a和2b)，成功解决了紫云英苷和槲皮苷色谱峰识别容易造成混淆问题，为研究和检测同时含有这两个化合物的中药材及其提取物和制剂提供了有力的工具。
本发明在建立了相对校正因子后，使用一种对照品(如槲皮素)，即能实现对多种其他黄酮类成分(如山柰酚、槲皮苷、异槲皮苷、金丝桃苷、杨梅素、紫云英苷)的含量测定和质量评价。与传统的外标法比较，本发明所述的基于一测多评法的方法，计算得到的各测试成分的含量相似性极高，证明发明所提供的方法对可信度和可靠性高，可以简便、高效、省时、全面地控制柿叶提取物及其制剂的质量，从而保证临床用药安全。
此外，本发明的方法在不同的高效液相色谱仪和不同的反相c18色谱柱上的测定结果没有显著差异，说明本发明的方法适用性和重现性好，适于普遍推广。
附图说明
下面结合附图对本发明做详细的说明。
图1示出的是实施例1中混合对照品在乙腈-0.1％磷酸水溶液按照梯度洗脱程序①洗脱得到的hplc图谱，其中1a是0-60min的色谱图，1b是1a的局部放大图。
图2示出的是实施例1中混合对照品在乙腈-0.1％磷酸水溶液按照梯度洗脱程序②洗脱得到的hplc图谱，其中2a是0-60min的色谱图，2b是2a的局部放大图。
图3示出的实施例2中柿叶提取物(批号h16p006-1)的hplc图谱，其中3a是0-60min的色谱图，3b是3a的局部放大图。
图4示出的实施例2中加了混合对照品的柿叶提取物(批号h16p006-1)的混合供试品的hplc图谱，其中4a是0-60min的色谱图，4b是4a的局部放大图。
图5示出的是实施例3中柿叶提取物供试品溶液不同柱温下得到的hplc图谱，其中5a是柱温为25℃时的hplc图谱，5b是柱温为30℃时的hplc图谱，5c是柱温35℃时的hplc图谱。
图6示出的是实施例3中柿叶提取物供试品溶液在流动相不同流速下得到的hplc图谱，其中6a是流速为0.8ml/min时的hplc图谱，6b是流速为1.0ml/min时的hplc图谱，6c是流速为1.2ml/min的hplc图谱。
图7示出的是实施例3中柿叶提取物供试品溶液在不同色谱仪和色谱柱上得到的hplc图谱，其中7a的色谱仪是agilent1260，色谱柱是agilenteclipseplusc18；7b的色谱仪是thermoultimate3000，色谱柱是agilenteclipseplusc18；7c的色谱仪是agilent1260，色谱柱是agilenteclipsexdb-c18；7d的色谱仪是thermoultimate3000，色谱柱是agilenteclipsexdb-c18；7e的色谱仪是agilent1260，色谱柱是agilentextend-c18；7f的色谱仪是thermoultimate3000，色谱柱是agilentextend-c18。
图8示出的是实施例3柿叶提取物供试品溶液的hplc图谱。
上述图1～8中，1为金丝桃苷的色谱峰，2为异槲皮苷的色谱峰，3为槲皮苷的色谱峰，4为紫云英苷的色谱峰，5为杨梅素的色谱峰，6为槲皮素的色谱峰，7为山柰酚的色谱峰。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。其中，部分试剂和仪器的购买情况如下：
1.仪器
agilent1260(美国安捷伦公司)；thermoultimate3000高效液相色谱仪(美国赛默飞公司)；色谱柱agilenteclipseplusc18(250mm×4.6mm，5μm)；色谱柱agilenteclipsexdb-c18(250mm×4.6mm，5μm)；色谱柱agilentextend-c18(250mm×4.6mm，5μm)；ja3003电子分析天平(上海天平仪器厂)；sb25-12dtd超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司)。
2.试药
金丝桃苷对照品(批号：must-16102605，供含量测定用，纯度为99.76％，由成都曼思特生物科技有限公司提供)，异槲皮苷(批号：must-17051005，供含量测定用，纯度为99.74％，由成都曼思特生物科技有限公司提供)，紫云英苷对照品(批号：z-020-170331，供含量测定用，纯度＞98％，由成都瑞芬思生物科技有限公司提供)，槲皮苷对照品(批号：must-16120510，供含量测定用，纯度为99.19％，由成都曼思特生物科技有限公司提供)，杨梅素对照品(批号：must-17022504，供含量测定用，纯度为98.31％，由成都曼思特生物科技有限公司提供)，槲皮素对照品(批号：must-16111114，供含量测定用，纯度为99.35％，由成都曼思特生物科技有限公司提供)，山柰酚对照品(批号：110861-201611，供含量测定用，纯度为95.5％，由中国药品生物制品鉴定所提供)。
柿叶提取物：由广州白云山和记黄埔中药有限公司提供，批号：h16p006-1，h16p006-2，h16p006-3，按照《中国药典》2015年版一部p1381上收载的方法制备。
乙腈、甲醇(色谱纯，美国tedia公司)，甲醇(分析纯，广州化学试剂厂)，水为超纯水。
实施例1高效液相色谱法分离黄酮类成分的研究
1.混合对照品溶液的制备
分别精密称取金丝桃苷、异槲皮苷、紫云英苷、槲皮苷、杨梅素、槲皮素、山柰酚的对照品适量，分别置于25ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度线，摇匀，分别制定成质量浓度为金丝桃苷0.8116mg/ml、异槲皮苷0.7092mg/ml、紫云英苷0.7668mg/ml、槲皮苷0.7820mg/ml、杨梅素0.8332mg/ml、槲皮素0.7592mg/ml、山柰酚0.7980mg/ml的对照品储备液。
分别取上述对照品储备液各5ml，置于同一100ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制得含金丝桃苷0.04058mg/ml、异槲皮苷0.03546mg/ml、紫云英苷0.03834mg/ml、槲皮苷0.03910mg/ml、杨梅素0.04166mg/ml、槲皮素0.03796mg/ml、山柰酚0.03990mg/ml的混合对照品溶液。
2.色谱条件的建立
2.1波长的选择
采用dad全波长扫描对照品溶液，分别测定金丝桃苷、异槲皮苷、紫云英苷、槲皮苷、杨梅素、槲皮素和山柰酚的最大吸收波长。测定结果显示：紫云英苷在264nm和350nm处有最大吸收波长，金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷在254nm和355nm处有最大吸收波长，杨梅素在254nm和375nm处有最大吸收波长，槲皮素在254nm和370nm处有最大吸收波长，山柰酚在264nm和365nm处有最大吸收波长。考虑到样品在使用254nm附近的波长检测时，干扰较多，而这六个待测成分在360nm处均有较大的吸收，干扰少，而且峰形良好、基线平稳，因此检测波长最终设定为360nm。
2.2流动相的考察
分别考察了由乙腈(a)-0.1％(体积百分比)磷酸水溶液(b)组成的流动相的两种梯度洗脱程序：
①0-60min，10％～35％a，其余为b；
②0-40min，7％～25％a，其余为b；40-60min，25％～50％a，其余为b。
在同一台高效液相色谱-紫外检测仪(agilent1260)上使用同一根色谱柱(agilenteclipseplusc18)，保持柱温30℃，进样量10μl，流速1.0ml/min，检测波长360nm；分别将制备的混合对照品溶液注入高效液相色谱仪，记录不同洗脱程序下的色谱图，见图1和图2。
结果发现：两种洗脱程序下，金丝桃苷、异槲皮苷、杨梅素、槲皮素和山柰酚均能实现基线分离，且色谱峰峰形好(具体见图1a和图2a)。但是按照梯度洗脱程序①，混合标准品中紫云英苷和槲皮苷的出峰时间极为接近，保留时间在27～27.5min之间，在相应位置几乎完全重叠，只能看到一个峰(见图1a和1b)；说明该洗脱程序无法使紫云英苷和槲皮苷分离。按照梯度洗脱程序②，混合标准品中的紫云英苷和槲皮苷在保留时间38.5～40min之间能看到两个明显的色谱峰，峰号分别为3和4(见图2a和2b)。因此，优选洗脱程序②，即：7％～25％a，其余为b；40-60min，25％～50％a，其余为b。
实施例2实施例1建立的方法检测柿叶提取物中的黄酮类成分
1.混合对照品溶液的制备
按照实施例1“1.”项下相同的方法制备混合对照品溶液。
2.供试品溶液的制备：
取柿叶提取物，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率45khz)30min，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得柿叶提取物供试品溶液。
3.混合加样供试品的制备
取柿叶提取物，取柿叶提取物供试品称样量的1/2(约0.05g)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入步骤1制备得到的混合对照品溶液10ml，再精密加入甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率45khz)30min，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得柿叶提取物混合加样供试品溶液。
4.色谱条件：
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶；
色谱柱：agilenteclipseplusc18；
流动相：乙腈(a)和0.1％磷酸水溶液(b)，采用梯度洗脱：0-40min，7％～25％a，其余为b；40-60min，25％～50％a，其余为b；
流速：1.0ml/min；
检测波长：360nm；
柱温：30℃；
进样量：10μl。
5.测定
分别取步骤1制备得到的混合对照品溶液和步骤2制备得到的供试品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱，记录色谱图。
三个批号的柿叶提取物(h16p006-1，h16p006-2，h16p006-3)的色谱图中，在金丝桃苷、异槲皮苷、杨梅素、槲皮素和山柰酚相应的位置都出现了清楚的色谱吸收峰；但是在保留时间～38.5min和～39min处出现2个色谱峰。其中批号h16p006-1的供试品溶液的色谱图及局部放大图见图3a和3b。初步判断该色谱峰为槲皮苷和紫云英苷。
为了进一步鉴别清楚，将步骤3制备的混合加样供试品(柿叶提取物批号h16p006-1)10μl注入同一台高效液相仪，在相同的色谱条件下进行测定，记录色谱图，见图4。
如图4a和4b所示，经过与混合对照品的色谱图比对后，可确定色谱保留时间～38.5min处的色谱峰为槲皮苷的吸收峰，色谱保留时间～39min处的色谱峰为紫云英苷的吸收峰；这两个吸收峰实现了基线分离。
实施例2的结果示出：本发明基于高效液相法建立的方法，能够实现紫云英苷和槲皮苷的分离，也能很好地分离金丝桃苷、异槲皮苷、杨梅素、槲皮素和山柰酚，完全可以用于含有黄酮类化合物的中药材或中药提取物及其制剂的定性和定量分析检测。特别的，本发明将上述方法用于柿叶提取物及其制剂的黄酮类成分的定性和定量检测。
实施例3一种基于一测多评法测定柿叶提取物中黄酮类成分含量的方法的建立
1.混合对照品溶液的制备
分别精密称取金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、杨梅素、槲皮素、山柰酚和紫云英苷的对照品适量，置于25ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度线，摇匀，制定成质量浓度分别为金丝桃苷0.8116mg/ml、异槲皮苷0.7092mg/ml、槲皮苷0.7820mg/ml、杨梅素0.8332mg/ml、槲皮素0.7592mg/ml、山柰酚0.7980mg/ml和紫云英苷0.7668mg/ml的混合对照品储备液。
分别精密吸取上述混合对照品储备液10.0、5.0、3.0、2.0、1.0、0.5、0.1ml，置于25ml容量瓶中，甲醇稀释至刻度线，摇匀，制得系列混合对照品溶液。
2.供试品溶液的制备
取柿叶提取物，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率45khz)30min，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得柿叶提取物供试品溶液。
3.色谱条件的建立
虽然在实施例1中已经建立色谱条件(主要是波长和流动相)，为了更好地达到更好的分离效果，本节以“2.供试品溶液制备”项下制备的柿叶提取物供试品溶液为研究对象，对柱温、流速、色谱仪和色谱柱进行了考察。
3.1柱温考察
考察不同柱温(25℃、30℃、35℃)对柿叶提取物供试品分离的影响。结果表明，在25℃下，各成分的峰形较差(见图5a)，而在35℃下，由于温度升高导致出峰时间变快，金丝桃苷、异槲皮苷的分离度受到一定影响(见图5c)。在30℃柱温下，样品中各成分的分离效果最佳，峰形较好(见图5b)。因此优选柱温为30℃。
3.2流速考察
考察不同流速(0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min)对柿叶提取物供试品分离的影响。结果表明，流速对目标化合物的分离效果影响较小，但0.8ml/min流速下样品的出峰时间延长，化合物容易拖尾(见图6a)，而1.2ml/min流速下虽然出峰时间较快(见图6c)，但色谱柱的柱压较高。1.0ml/min流速下出峰时间适中，峰形较好，分离效果也较好(见图6b)。因此本发明优选流速为1.0ml/min。
3.3色谱仪和色谱柱的考察
考察不同品牌的高效液相仪器agilent1260和thermoultimate3000，以及3种不同色谱柱agilenteclipseplusc18(250mm×4.6mm，5μm)，agilenteclipsexdb-c18(250mm×4.6mm，5μm)，agilentextend-c18(250mm×4.6mm，5μm)对柿叶提取物中6个指标成分相对槲皮素的相对校正因子的影响(图7)。结果见表1，可以看出在上述仪器和上述色谱柱上测得的6个黄酮类化合物的相对校正因子稳定，各指标成分的相对校正因子rsd在1.43％～2.88％范围内，重现性良好。
表1不同仪器和色谱柱相对校正因子考察结果
3.4建立的色谱条件：
基于上述研究，优选出的本发明的色谱条件为：
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶；
流动相：乙腈(a)和0.1％磷酸水溶液(b)，采用梯度洗脱：0-40min，7％～25％a，其余为b；40-60min，25％～50％a，其余为b；
流速：1.0ml/min；
检测波长：360nm；
柱温：30℃；
进样量：10μl。
在下面的研究中，高效液相色谱仪为agilent1260；色谱柱选用agilenteclipseplusc18(250mm×4.6mm，5μm)。
4.混合对照品溶液和供试品溶液的hplc图谱
取批号为h16p006-1的柿叶提取物，按上述方法制备成柿叶提取物供试品溶液；分别精密吸取混合对照品溶液和柿叶提取物供试品溶液，注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下，记录各自的hplc色谱图，其中柿叶提取物(批号h16p006-1)的hplc色谱图见图8。
从图8中可以看出，各个黄酮成分都实现了基线分离，峰形好，保留时间适宜。
5.色谱峰定位参数考察
为了在仅采用槲皮素为对照品时，能够确认金丝桃苷、异槲皮苷、紫云英苷、杨梅素、山柰酚色谱峰的位置，从而通过获得的相对校正因子同时计算另外6种成分的含量，达到一测多评的目的，考察了采用不同仪器和色谱柱下，柿叶提取物供试品溶液中金丝桃苷、异槲皮苷、杨梅素、山柰酚、紫云英苷色谱峰和槲皮素色谱峰之间的保留时间差和相对保留时间2个参数。考察结果发现，另外6种黄酮类成分和内标化合物槲皮素之间的保留时间差波动较大，而相对保留时间波动较小(见表2)，相对保留时间的rsd在0.74％～3.29％范围内。因此，可选用待测成分和槲皮素的相对保留时间作为其他6个待测成分色谱峰的定位指标。
表2不同仪器和色谱柱相对保留时间考察结果
6.方法学考察
6.1线性关系考察
分别精密吸取系列浓度的混合对照品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，按上述优选出的色谱条件测定，每个浓度分别进样3次，测定各对照品的峰面积，取平均值。以各对照品进样量(x，μg)对峰面积积分值(y)进行回归处理，得金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、杨梅素、槲皮素、山柰酚、紫云英苷的线性方程和相关系数r2。结果表明，各对照品的进样量与峰面积均呈良好的线性关系，具体结果见表3。
表3线性关系考察结果
6.2相对校正因子(fk/m)计算
分别精密吸取系列混合对照品溶液各10μl，按上述色谱条件测定，每个浓度分别进样3次，记录各对照品的色谱峰面积，以槲皮素对照品的峰面积为内标，按照计算公式(2)分别计算金丝桃苷、异槲皮苷、紫云英苷、杨梅素、山柰酚5种成分的相对校正因子，结果见表4。
其中，w′k为混合对照品溶液中槲皮素内标化合物的含量，a′k为槲皮素内标化合物的峰面积；w′s为混合对照品溶液中被测指标组分s的含量，a′s为被测成分s的峰面积。
表4各被测成分相对于槲皮素的相对校正因子
表4的数据示出，各被测成分在不同浓度下相对于槲皮素的相对校正因子基本恒定，rsd＜1.5％。
6.3精密度试验
6.3.1日内精密度试验
取批号为h16p006-1的柿叶提取物，按上述方法制备成柿叶提取物供试品溶液，在上述色谱条件下测定，一天之内连续进样6次，记录金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、杨梅素、槲皮素、山柰酚、紫云英苷的峰面积(mau)，并计算其rsd值，结果见表5，得出柿叶提取物日内精密度分别为0.23％、0.18％、0.35％、1.54％、0.63％、0.60％、0.95％表明仪器日内精密度良好。
表5柿叶提取物供试品溶液日内精密度试验结果
6.3.2日间精密度试验
取批号为h16p006-1的柿叶提取物，按上述方法制备成柿叶提取物供试品溶液，在上述色谱条件下测定，每天进样6次，连续进样3天，记录并计算金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、杨梅素、槲皮素、山柰酚、紫云英苷的峰面积(mau)的平均值，计算其rsd值，结果见表6，得出柿叶提取物日间精密度分别为0.49％、0.61％、0.53％、1.11％、0.73％、0.96％、0.74％，表明仪器日间精密度良好。
表6柿叶提取物供试品溶液日间精密度试验结果
6.4重复性试验
取批号为h16p006-1的柿叶提取物，按上述方法平行制备6份柿叶提取物供试品溶液进行测定，在上述色谱条件下测定，进样量10μl，记录金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、杨梅素、槲皮素、山柰酚、紫云英苷的峰面积，计算各成分的含量(按干燥品计算，mg/g)和rsd值，结果见表7。结果显示，上述7种成分的rsd在0.56％～1.51％之间，表明该方法的重复性良好。
表7柿叶提取物供试品溶液重复性试验结果
6.5稳定性
取批号为h16p006-1的柿叶提取物，按上述方法制备柿叶提取物供试品溶液，在室温下放置0，2，4，6，8，10，12，24小时后，在上述色谱条件下进样10μl，记录金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、杨梅素、槲皮素、山柰酚的峰面积(mau)，计算峰面积的rsd值。结果见表8，柿叶提取物供试品溶液中的7个指标成分峰面积rsd均小于2％，表明柿叶提取物供试品溶液室温放置24h内稳定。
表8柿叶提取物供试品溶液稳定性试验结果
6.6加样回收率
取批号为h16p006-1的柿叶提取物，取柿叶提取物供试品称样量的1/2(约0.05g)，精密称定，分别加入一定量混合对照品溶液，按上述方法平行制备供试品溶液6份，在上述色谱条件下进样10μl，记录金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、杨梅素、槲皮素、山柰酚的峰面积，计算加样回收率。结果见表9，可以看出柿叶提取物中金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、杨梅素、槲皮素、山柰酚、紫云英苷的加样回收率分别为100.43％、100.01％、100.08％、101.13％、99.35％、100.51％、100.76％，均符合加样回收率实验的要求。
表9柿叶提取物加样回收率试验结果
通过本实施例，建立了本发明所述基于一测多评法测定柿叶提取物中黄酮类成分含量的方法，并进行了方法学的考察。考察结果表明，本发明的方法稳定性、重现性、精密度都好。
实施例4一测多评法测定柿叶提取物中7种黄酮成分的含量
所述6种黄酮类成分为金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、杨梅素、槲皮素、山柰酚、紫云英苷，其中以槲皮素为内标化合物。
本实施例的含量测定，通过如下步骤：
i.相对校正因子的建立，具体操作为：
i-1.系列混合对照品溶液的制备
按照实施例3“1.”项下的方法制备得到，备用；
i-2.相对校正因子fk/s的计算
按照实施例3“6.2”项下计算相对校正因子，取平均值，作为各测试成分相对于槲皮素的相对校正因子。
ii.供试品溶液的制备：
取批号为h16p006-1，h16p006-2，h16p006-3的柿叶提取物，按照实施例3“2.”项下所述方法制备柿叶提取物供试品溶液。
iii.槲皮素标准溶液的制备：
取槲皮素，精密称定，加入置于容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，配制成0.0607mg/ml溶液，即得；
iv.测定
分别取步骤ii制备得到的供试品溶液和步骤iii制备的槲皮素标准溶液10μl，分别注入高效液相色谱，在所述色谱条件下进行测定，获得色谱图并进行峰面积积分，先用外标法计算出槲皮素在供试品中的含量，然后按公式(1)计算测定的各黄酮类成分的含量，
ws＝(wk×as)/(fk/s×ak)(1)，
式中ak为槲皮素的峰面积，wk为槲皮素含量；as为被测组分s的峰面积，ws为被测组分s的含量，fk/s为被测组分相对槲皮素的相对校正因子。
结果见表10。
对比例1外标法测定柿叶提取物中7种黄酮成分的含量
所述6种黄酮类成分为金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、杨梅素、槲皮素、山柰酚、紫云英苷。
本对比例的含量测定，通过如下步骤：
i.混合对照品溶液的制备
分别精密称取金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、杨梅素、槲皮素、山柰酚、紫云英苷的对照品适量，置于25ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度线，摇匀，制定成质量浓度分别为金丝桃苷0.8116mg/ml、异槲皮苷0.7092mg/ml、槲皮苷0.7820mg/ml、杨梅素0.8332mg/ml、槲皮素0.7592mg/ml对照品储备液、山柰酚0.7980mg/ml、紫云英苷0.7668mg/ml的混合对照品溶液。
ii.供试品溶液的制备
分别取批号为h16p006-1，h16p006-2，h16p006-3的柿叶提取物，按照实施例3“2.”项下所述方法制备柿叶提取物供试品溶液。
iii.测定
分别取步骤i制备得到的混合对照品溶液和柿叶提取物供试品溶液10μl，在与实施例2相同的色谱条件下，建立各个对照品的标准曲线，用外标法计算相应黄酮成分的含量(柿叶提取物含量按干燥品计算)，结果见表10。
将本对比例外标法测定的含量与实施例4一测多评法计算的含量采用pearson相关系数法进行比较，结果也见表10。
表10柿叶提取物一测多评法与常规外标法含量测定结果
表10示出，从pearson相关系数法可以看出，传统的外标法和本发明的一测多评法计算的含量相似性极高，两种含量测定方法计算得到的含量值之间无显著性差异。证明本发明所提供的一测多评的检测方法对柿叶提取物中的7个黄酮类指标成分进行测定可信度和可靠性好，可有效、全面地控制柿叶提取物的质量。
上述实施例中都是以价廉易得的槲皮素作为内标化合物。本领域技术人员应该可以理解，本发明的方法可以用上述黄酮类化合物中的任一个作为内标化合物，测定其它化合物的含量。这些都是在本发明的范围内的。
虽然本发明的实施例示出了一测多评同时测定柿叶提取物中金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、杨梅素、槲皮素、山柰酚、紫云英苷等7种黄酮类成分含量，但是本领域技术人员应该可以理解，本发明的方法不局限于上述7种成分，还可以适用于同时测定更多的黄酮类成分的含量。
本发明提供的分离结构类似的黄酮类化合物的方法以及基于该方法的一测多评法，除了柿叶提取物及其制剂外，还可以应用于其它含有黄酮类化合物的中药材、中药提取物及其制剂的成分定量、定性检测。