一种用于肾衰检测的多指标快速定量检测胶体金试剂盒的制作方法

本实用新型涉及生物技术诊断领域，具体涉及一种用于肾衰检测的多指标快速定量检测胶体金试剂盒。

背景技术：

肾衰是一个连续性过程，广泛发生于糖尿病人、交通事故伤害、重症患者、大手术后患者，它按FIFLE标准分为风险、损伤、衰竭、肾功能丧失和终末期肾病。现有技术中，临床检测肾衰的生物标志物是肌酐、尿素氮和尿量。而这些传统指标因为其影响因素较多，造成特异性偏低，导致以肌酐等作为肾衰诊断标志存在严重的局限性。

肾衰的早期发生、发展过程包括肾小管损伤、肾小球滤过功能下降，肾衰过程的检测有助于对病人实施保护性治疗，阻止肾脏功能的进一步恶化。鉴于现有临床面临的这些问题，新的早期急性肾损伤的生物标志物已被逐步开发出来。包括肾损伤分子-1(Kim-1)、中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白(NGAL)和视黄醇结合蛋白（RBP）。

肾损伤分子-1(Kim-1)是由334个氨基酸残基组成的Ⅰ型跨膜蛋白，在正常的肾组织中几乎不表达，当肾脏发生缺血及肾损伤后，在人近曲小管上皮细胞中呈高表达状态。肾小管受损后第1天KIM-1升高至少5倍以上，而血清肌酐与尿素氮晚到受损后第3天才升高，因此Kim-1是监测早期肾小管损伤的最敏感的标志物之一。Kim-1分子的细胞外ectodomain(金属蛋白酶水解脱下来的，可以分泌到尿液中)是急性肾衰竭 (AKI)的定量标志物，尿中KIM-1的检测不受尿液理化物质的影响，心脏手术后几个小时就会检测到Kim-1在尿液中大幅增长现象。肾脏缺血时尿Kim-1水平升高，具有较高的特异性，对于AKI患者而言，高水平Kim-1预示患者的预后较差。临床实验证明，Kim-1是早期肾小管损伤最敏感的标志物之一。

中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白(NGAL)是一种小分子量分泌型蛋白，由Kjeldsedn等人于1993年发现，是Lipocalin家族的新成员。生理条件下，NCAL少量合成于骨髓中性粒细胞和肾小管等多个系统的上皮细胞，炎症反应和恶性肿瘤可诱使其在多组织(如子宫、前列腺、唾液腺、肺、肾、气道及消化道上皮等)中大量生成，几个小时内就可以达到峰值，产生速度明显快于其它相关生物标记物。NGAL在急性肾小管损伤早期就已经表达，反映肾小管功能紊乱，它浓度的升高提示肾小管损伤发生，而传统指标血肌酐升高则需24小时以上。NGAL也是目前新型AKI诊断的首选指标物。

视黄醇结合蛋白（RBP）是一种分子量约为 21KD 的小分子量蛋白，主要由肝细胞合成，广泛分布于血液、脑脊液等各类体液，血液中的 RBP 常与视黄醇及甲状腺转运蛋白结合形成三元复合体，结合状态的 RBP 无法从肾小球滤过。当肾脏滤过功能降低时,肾小球滤过率和肾血流量降低而使血中各种形式的视黄醇结合蛋白（RBP）贮积而显示血清RBP浓度升高。在慢性肾小球肾炎中, 血清RBP与肾功能相关性好,可以作为肾小球滤过功能受损的敏感指标。正常人尿中视黄醇结合蛋白（RBP）含量很少，约为0.1ug/min以下，其水平增加被认为是一种敏感的近端肾小管损伤的诊断指标。RBP与尿白蛋白、NAG、β2-微球蛋白等有显著的正相关。而尿RBP作为肾小管损伤的指标较NAG敏感。在疾病状态下，尿RBP浓度又是NAG的10倍。因此，尿RBP的测定比NAG和β2-MG更有价值。当肾脏疾患或感染等导致肾小管重吸收功能障碍时,尿中RBP 浓度升高,因此尿中RBP 测定是诊断早期肾小管损伤的敏感指标。

技术实现要素：

本实用新型所要解决的技术问题是提供一种用于肾衰检测的多指标快速定量检测胶体金试剂盒，其通过同时检测Kim-1、NGAL和RBP的指标变化，可准确地检测早期肾小管的损伤，具有特异性强、准确性高的特点，用一滴血、一滴尿实现家庭检测和现场检测，避免肾衰的进一步发生，具有极高的社会效益。

为解决以上技术问题，本实用新型采用如下技术方案：

一种用于肾衰检测的多指标快速定量检测胶体金试剂盒，其包括检测卡、比色卡和/或胶体金定量读数仪，检测卡包括上样垫、胶体金结合垫、具有检测线和质控线的承载膜、吸样垫及底板，检测指标包括肾损伤分子-1、中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白、视黄醇结合蛋白，胶体金结合垫包括结合垫本体和涂覆于结合垫本体上的胶体金标记抗体涂层，其中胶体金标记抗体涂层中的抗体为所述指标的抗体；检测线有三条，这三条检测线相互分离且分别为能够与胶体金标记的抗体特异性结合的配对抗体或抗原形成的涂层。

根据本实用新型的一个具体方面，检测卡由上样垫、胶体金结合垫、承载膜及吸样垫依次相互交错粘贴在底板上构成。

根据本实用新型的一个优选方面，检测卡还包括滤血膜或尿液过滤膜，滤血膜或尿液过滤膜覆设在上样垫上，上样垫、胶体金结合垫、承载膜及吸样垫依次相互交错粘贴在底板上。

根据本实用新型的又一优选方面，检测卡还包括助推垫，且检测卡由上样垫、胶体金结合垫、助推垫、承载膜及吸样垫依次相互交错粘贴在底板上构成。

根据本实用新型的还一优选方面，检测卡还包括滤血膜或尿液过滤膜和助推垫，滤血膜或尿液过滤膜覆设在上样垫上，上样垫、胶体金结合垫、助推垫、承载膜及吸样垫依次相互交错粘贴在底板上。

优选地，助推垫的材质为玻璃纤维素膜或无纺布。

根据本实用新型的一个优选方面，承载膜仅有一条，三条检测线、质控线相互平行且沿着所述承载膜的长度方向依次设置在所述承载膜上。

进一步地，三条检测线中靠近胶体金结合垫的检测线为肾损伤分子-1的配对抗体或抗原涂层，靠近吸样垫的检测线为视黄醇结合蛋白的配对抗体或抗原涂层，中间的检测线为中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白的配对抗体或抗原涂层，质控线位于承载膜的靠近吸样垫的端部。

根据本实用新型的又一优选方面，承载膜包括三条承载分膜，三条检测线分别分布在三条承载分膜上。在各承载分膜上分别设置有质控线。

根据本实用新型的又一优选方面，检测卡包括三个独立的检测分卡，上样垫、结合垫、吸样垫和底板分别有三条，每一条上样垫、结合垫、承载分膜、吸样垫和底板组装成一个检测分卡。

优选地，质控线通过包被包括但不限于羊抗鼠IgG、羊抗鸡IgY或羊抗兔IgG等形成。

优选地，承载膜为硝酸纤维素膜且为孔径5～12um的多孔样结构膜；上样垫、胶体金结合垫的材质为玻璃纤维素膜或无纺布，吸样垫的材质为吸水滤纸。

免疫胶体金技术是已知的。本实用新型所述的胶体金免疫标记抗体可采用本领域熟知的方法制备。

由于以上技术方案的实施，本实用新型与现有技术相比具有如下优点：

本实用新型试剂盒包括快速检测肾衰的三联检测卡，其采用Kim-1、NGAL和RBP三种标记物，可有效的预测肾衰风险，在诊断试剂的研发方面属于首创，其结构上增加了助推垫，可以有效的去除干扰。其诊断灵敏度高、特异性强，临床监测的准确率高，进行早期预警可及时阻止病人的病情恶化，降低因检测不及时造成的漏诊、误诊，降低死亡率。

本实用新型检测卡将原本只能应用于医院检验科的试剂盒，经过技术创新，通过增加滤血膜或尿液过滤膜，使其可以方便、简易、准确的应用于有肾衰风险的家庭、养老院、条件简陋的社区卫生所，其使用方法也仅是由病人或家属针刺一滴血或直接用尿液来实现肾衰自我检测、监测，减轻去医院挂号、排队、化验、取报告等繁琐过程，减轻公共医疗机构的压力，更有益于患者的日常治疗。

进一步地，本实用新型在结构上增加了助推垫，可以有效的去除背景干扰，从而进一步提高诊断灵敏度高和准确度，此外助推垫还有助于加快检测样品流动，提高检测效率，缩短检测时间，可以避免胶体金颗粒被PVC底板截留，提高产品性能。

附图说明

图1为根据本实用新型实施例1的检测卡的主视结构示意图；

图2为根据本实用新型实施例2的检测卡的立体结构示意图；

图3为根据本实用新型实施例3的检测分卡的主视结构示意图（含T1检测线）；

图4为根据本实用新型实施例3的检测分卡的主视结构示意图（含T2检测线）；

图5为根据本实用新型实施例3的检测分卡的主视结构示意图（含T3检测线）；

其中：1,1’,1”、上样垫；2,2’,2”、胶体金结合垫；20,20’,20”、结合垫本体；21,21’,21”、胶体金标记抗体涂层；3、承载膜；30,30’,30”、承载分膜；4,4’,4”、吸样垫；5,5’,5”、底板；6,6’,6”、滤血膜/尿液过滤膜；7,7’,7”、助推垫；T1,T2,T3、检测线；C,C’,C”、质控线。

具体实施方式

实施例1

如图1所示，一种用于肾衰检测的多指标快速定量检测胶体金试剂盒，其包括检测卡、比色卡和/或胶体金定量读数仪，检测卡包括上样垫1、胶体金结合垫2、具有检测线和质控线C的承载膜3、吸样垫4、底板5、滤血膜或尿液过滤膜6和助推垫7，滤血膜或尿液过滤膜6覆设在上样垫1上，上样垫1、胶体金结合垫2、助推垫7、承载膜3及吸样垫4依次相互交错粘贴在底板5上。助推垫7的材质为玻璃纤维素膜或无纺布。承载膜3为硝酸纤维素膜且为孔径5～12um的多孔样结构膜；上样垫1、结合垫本体20的材质分别为玻璃纤维素膜或无纺布，吸样垫4的材质为吸水滤纸。

进一步地，指标包括肾损伤分子-1、中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白、视黄醇结合蛋白，胶体金结合垫2包括结合垫本体20和涂覆于结合垫本体上的胶体金标记抗体涂层21，其中胶体金标记抗体涂层中的抗体为所述指标的抗体；检测线有三条，这三条检测线T1、T2、T3相互分离且分别为能够与胶体金标记的抗体特异性结合的配对抗体或抗原形成的涂层。三条检测线T1、T2、T3、质控线C相互平行且沿着承载膜3的长度方向依次设置。三条检测线T1、T2、T3中靠近胶体金结合垫2的检测线T1为肾损伤分子-1的配对抗体或抗原涂层，靠近吸样垫4的检测线T3为视黄醇结合蛋白的配对抗体或抗原涂层，中间的检测线T2为中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白的配对抗体或抗原涂层，质控线C位于承载膜3的靠近吸样垫4的端部。质控线C通过包被包括但不限于羊抗鼠IgG、羊抗鸡IgY或羊抗兔IgG等形成。

本例各部件是这样组装到一起的，在干燥室内，温度20～25℃，湿度小于40％，取底板5，将已包被的承载膜3放置在底板5的中部粘贴，将助推垫7裁切成合适的宽度，在承载膜3上的检测线一侧搭接助推垫7；将胶体金结合垫2裁切成合适的宽度，粘贴在助推垫7上；在胶体金结合垫2另一侧搭接粘贴上样垫1；滤血膜或尿液专用过滤膜6覆设在的上样垫1上；在承载膜3上的质控线一侧粘接吸样垫4；最后用裁剪机将贴好塑料板切成3～5mm宽的试纸条，装入塑料卡内即形成所述检测卡。

本例试剂盒的检测方法如下：

（1）将检测试剂及样本平衡至室温，取出检测卡，平放；

（2）吸取血清、血浆或全血样本，加入洁净的离心管中，用样本稀释液进行稀释，充分混匀；

（3）用移液枪吸取稀释后的样本加入到上样垫的样本孔中，15～20分钟内进行定性分析或根据已预先设置在胶体金定量分析检测仪内的标准曲线对Kim-1、NGAL和RBP的浓度进行计算并显示结果。

试剂卡与胶体金定量读数仪搭配，即可构成用于肾衰的早期预警、治疗过程和愈后监控的试剂盒。

本例检测卡的检测原理如下：

当样本加入到样品孔后，样本中含有的Kim-1、NGAL和RBP抗原与胶体金标记的Kim-1、NGAL和RBP抗体结合，借助毛细管作用，所形成的抗体-抗原免疫复合物沿硝酸纤维素膜层析至检测线，然后与固化在检测线上的Kim-1、NGAL和RBP抗体结合。未结合的免疫复合物则继续层析至质控线被羊抗鼠IgG抗体捕获。

当反应结束后，根据色带颜色的深浅可进行定性判断，根据已预先设置在胶体金定量分析检测仪内的标准曲线对Kim-1、NGAL和RBP的浓度进行计算并显示结果。

实施例2

如图2所示，本例提供一种用于肾衰检测的多指标快速定量检测胶体金试剂盒，其基本同实施例1，不同的是，其承载膜3包括三个并排设置的承载分膜30，30’，30”，每个承载分膜30，30’，30”上分别形成一条检测线和质控线。

本例试剂盒的制备、检测及检测原理同实施例1。

实施例3

如图3、图4、图5所示，本例提供一种用于肾衰检测的多指标快速定量检测胶体金试剂盒，其基本同实施例1，不同的是，检测卡包括三个独立的检测分卡，滤血膜或尿液过滤膜6，6’，6”、上样垫1，1’，1”、结合垫2，2’，2”、助推垫7，7’，7”、承载分膜30，30’，30”、吸样垫4，4’，4”和底板5，5’，5”分别有三条，每一条滤血膜或尿液过滤膜6，6’，6”、上样垫1，1’，1”、结合垫2，2’，2”、助推垫7，7’，7”、承载分膜30，30’，30”、吸样垫4，4’，4”和底板5，5’，5”组装成一个检测分卡，每个检测分卡上的承载分膜30，30’，30”上分别形成一条检测线和质控线。

本例试剂盒的制备、检测及检测原理同实施例1。

综上，本实用新型试剂盒包括快速检测肾衰的三联检测卡，其采用Kim-1、NGAL和RBP三种标记物，可有效的预测肾衰风险，其诊断灵敏度高、特异性强，临床监测的准确率高，实现肾衰的自我检测和监测，及时阻止病人的病情恶化。

本实用新型检测卡将原本只能应用于医院检验科的试剂盒，经过技术创新，通过增加滤血膜（或尿液过滤膜），使其可以方便、简易、准确的应用于有肾衰风险的家庭、养老院、条件简陋的社区卫生所，其使用方法也仅是由病人或家属针刺一滴血或直接用尿液来实现肾衰的自我检测、监测，减轻去医院挂号、排队、化验、取报告等繁琐过程，减轻公共医疗机构的压力，更有益于患者的日常治疗。

以上对本实用新型做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本实用新型的内容并加以实施，并不能以此限制本实用新型的保护范围，凡根据本实用新型的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本实用新型的保护范围内。