本发明涉及使用试纸条技术识别氯霉素，具体涉及一种用于检测氯霉素的试纸条及其制备方法。
背景技术：
：氯霉素属于一种高效广谱的抗生素，但是氯霉素具有较强的毒副作用，长期摄入会使大肠杆菌、沙门氏菌等多种菌株产生耐药性，容易造成动物机体菌群失调，抵抗力下降。我国规定在所有食品动物的可食用组织中均不得检出氯霉素，因此，需要一种快速、灵敏检测生物环境中的氯霉素的方法。通常采用抗体检测氯霉素，将抗体作为生物识别因子，利用抗原抗体的特异性识别进行氯霉素检测。但是抗体成本较高，不方便保存，而且制备抗体时需要活体中产生免疫，批次稳定性较差。目前，更多的研究转向采用核酸适配体检测氯霉素，即通过一段经过体外筛选得到的寡核苷酸序列或者短的多肽，能与相应的配体进行高亲和力和强特异性的结合。如申请日为2015年6月10日，申请公布号为cn104865216a的中国专利公开的一种基于纳米金核酸适配体比色检测氯霉素的方法，其将金纳米颗粒、能够对氯霉素特异性识别的核酸适配体和阳离子聚合物混合形成稳定的复合物；待测溶液和复合物结合释放阳离子聚合物；金纳米颗粒在阳离子聚合物的作用下团聚形成较大颗粒，导致金纳米颗粒团簇在不同波长处表现出的筒的颜色；根据颜色的变化确定待测样品中氯霉素的浓度。但是其采用的是溶液显色的方法，即需要现场配置溶液，在溶液中进行显色反应。在实际应用中较为不便。技术实现要素：本发明的目的是提供一种用于检测氯霉素的试纸条，其具有较好的一致性、稳定性和敏感性。本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种用于检测氯霉素的试纸条，包括支撑板，支撑板上排布硝化纤维素膜，硝化纤维素膜的一端自硝化纤维素膜起自下而上排布结合垫和样品垫，硝化纤维素膜与结合垫相对的另一端上铺设吸水垫，硝化纤维素膜上划检测线和控制线，结合垫包被纳米金-氯霉素适配体复合物，氯霉素适配体的核苷酸序列为3’-agc-agc-aca-gag-gtc-aga-tga-ctg-agg-gca-cgg-aca-gga-ggg-cat-gga-gag-atg-gcg-ttt-ttt-ttt-5’，其5’端采用巯基修饰；检测线包被探针a复合物，探针a复合物由链霉亲和素和生物素修饰的探针a溶液混合制得，探针a的核苷酸序列为5’-cgc-cat-ctc-tcc-atg-ccc-tcc-tgt-ccg-tgc-cct-cag-tca-tct-gac-ctc-tgt-gct-gct-3’，其3’端用生物素修饰；控制线包被探针b复合物，探针b复合物由链霉亲和素和生物素修饰的探针b溶液混合制得，探针b的序列为3’-aaa-aaa-aaa-5’，其3’端采用生物素修饰。本申请采用氯霉素适配体对氯霉素进行检测，并且采用试纸条法，从适配体库中筛选合适的氯霉素适配体，该氯霉素适配体一部分与氯霉素互补配对，另一部分与探针b互补配对；其中探针a和氯霉素与氯霉素适配体竞争结合。选择的氯霉素适配体的核苷酸序列一定，采用本方法检测氯霉素一致性较好。此外，本申请采用试纸条法，待测物滴在样品垫上，待测物溶液依次经过结合垫、检测线和控制线进行显色。若待测物中含有氯霉素，待测物流经结合垫时，与结合垫上的氯霉素适配体结合；结合氯霉素适配体的待测物继续流至检测线和控制线时，探针b与氯霉素适配体结合，控制线处显色。若待测物中不含氯霉素，待测物流经结合垫，氯霉素适配体继续流至检测线和控制线处，在检测线和控制线处均显色。采用该方法操作简单，仅需将待测样品滴在样品垫上即可。进一步地，纳米金-氯霉素适配体复合物按照如下方法制得：氯霉素适配体和纳米金溶液以体积比为1:5-6的比例混合，室温孵育6.5-8h，加入氯化钠至浓度为45-50mmol/l；在室温下继续活化11-12h，在6000-7000r/min的转速下离心10-15min，得到的浓缩物为纳米金-氯霉素适配体复合物。进一步地，纳米金的粒径为15-35nm。经过多次试验验证，在该粒径范围内的纳米金与氯霉素适配体结合，可以进一步提高试纸条的检测灵敏度。进一步地，纳米金采用柠檬酸三钠还原氯金酸制得，柠檬酸三钠与氯金酸以体积比为2-2.5:1的比例混合，在300-350r/min的转速下，温度为100-110℃下搅拌11-12min，制得纳米金溶液。采用以上方法制得的纳米金颗粒活性较佳，便于和巯基化的氯霉素适配体结合。进一步地，纳米金-氯霉素适配体复合物包被在结合垫上，并在35-37℃烘干7-12min。采用以上技术方案，预先将纳米金和氯霉素适配体结合制备纳米金-氯霉素适配体复合物，纳米金-氯霉素适配体复合物按照上述条件转移至结合垫上，纳米金的活性保持较持久。进一步地，探针a复合物按照如下方法制得：18-20μl浓度为2-3mg/ml的链霉亲和素与8-10μl浓度为90-100μmol/l的生物素修饰的探针a溶液在室温下混合2-2.5h。采用以上技术方案，探针a与链霉亲和素结合，显著提高检测灵敏度。进一步地，链霉亲和素采用非巯基化链霉亲和素。该链霉亲和素与生物素的亲和性更好，能与更多的生物素结合。进一步地，氯霉素的检测范围为0.5-160µg/ml。本发明的另一目的在于提供一种用于检测氯霉素的试纸条的制备方法，其具有检测灵敏、可直接观测检测结果的特点。本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：一种用于检测氯霉素的试纸条的制备方法，包括如下步骤：硝化纤维素膜、结合垫、样品垫和吸水垫分别固定在支撑板上，样品垫、结合垫之间重叠1.5-2.5mm，支撑板宽度为4-4.5mm；支撑板上划检测线和控制线；结合垫上浸润纳米金-氯霉素适配体复合物在35-37℃烘干7-12min备用；与氯霉素适配体部分互补的探针a溶液和链霉亲和素在室温下孵育2-2.5h制得探针a复合物，并包被在检测线处；与氯霉素适配体另一部分互补的探针b溶液和链霉亲和素在室温下孵育2-2.5h制得探针b复合物，并包被在控制线处；硝化纤维素膜放置在37℃干燥8-12h，放于4℃下干燥保存。按照如上方法制作试纸条，操作简单，并且在较大程度上提高了试纸条的检测灵敏度。进一步地，样品垫采用牛血清白蛋白做封闭处理。采用以上技术方案，对纳米金进行封闭，降低纳米金与样品垫的非特异性结合，提高试纸条的检测灵敏度。综上所述，本发明具有以下有益效果：1、本发明制得的试纸条对颜色变化更加敏感，通过采用柠檬酸三钠还原氯金酸制备纳米金，同时在制备试纸条的过程中配合不同的干燥温度，并且采用牛血清白蛋白做封闭处理，降低纳米金的非特异性结合，使得最终试纸条的视觉灵敏度可达到0.5ppm，读数仪的检测限可达到63.4ppb；2、本发明制得的试纸条检测氯霉素的范围较宽，通过对氯霉素适配体的浓度、链霉亲和素的种类、封闭剂的种类和浓度以及纳米金的粒径大小进行调整，最终制得的试纸条能够检测氯霉素的范围在0.5-160µg/ml之间；3、本发明制得的试纸条一致性较好，选用经过筛选的核酸序列一定的氯霉素适配体，采用竞争结合法，最终的检测结果通过肉眼即可观察，操作简便。附图说明图1为试纸条的结构示意图；图2为试纸条的测试原理图；图3为氯霉素标准曲线；图中，1、支撑板；2、硝化纤维素膜；3、结合垫；4、样品垫；5、吸水垫；6、检测线；7、控制线。具体实施方式以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。实施例一：一种用于检测氯霉素的试纸条，如图1所示，包括长条形的支撑板1，支撑板1上端面固定与支撑板1同宽的硝化纤维素膜2，硝化纤维素膜2位于支撑板1的中部。硝化纤维素膜2上方沿其长度方向的一个端部自硝化纤维素膜2起依次向上排布结合垫3和样品垫4，样品垫4位于结合垫3上方、并且与结合垫3错开排布。结合垫3与硝化纤维素膜2、结合垫3与样品垫4的叠压宽度均为2mm，叠压宽度也可以选择1.5mm或者2.5mm；硝化纤维素膜2沿其长度方向的另一端部上方固定吸水垫5，吸水垫5和硝化纤维素膜2的叠压宽度为2mm。硝化纤维素膜2上印制与硝化纤维素膜2的长度方向垂直的检测线6和控制线7，检测线6靠近样品垫4，检测线6和控制线7相距5mm。该试纸条中支撑板1的宽度可以在4-4.5mm之间选择，在样品垫4上包被检测靶标，检测靶标沿试纸条的长度方向流动时，边缘与中间流动的液体速度保持基本一致。本实施例中支撑板1为pvc材质，样品垫4采用玻璃纤维、聚酯膜等材质，便于和待测样品结合；吸收垫采用滤纸，其具有吸液作用，对待测样品进行导向。结合垫3上包被由纳米金和氯霉素适配体结合组成的纳米金-氯霉素适配体复合物，氯霉素适配体可以与氯霉素分子配对结合；硝化纤维素膜2上检测线6处包被由链霉亲和素和探针a结合后形成的探针a复合物，其中探针a与氯霉素适配体的部分碱基序列互补配对；硝化纤维素膜2上控制线7处包被由链霉亲和素和探针b结合后形成的探针b复合物，其中探针b与氯霉素适配体的另一部分碱基序列互补配对；在样品垫4上加入检测靶标，并加入流动缓冲液，使得检测靶标沿硝化纤维素膜2的长度方向向检测线6和控制线7方向移动（如图1中箭头方向所示），观察显色情况，并在免疫色谱读数仪上进行读数。一、选择氯霉素适配体、检测线6处的探针a和控制线7处的探针b1、氯霉素适配体的核苷酸序列（sequenceidno.1）为：3’-agc-agc-aca-gag-gtc-aga-tga-ctg-agg-gca-cgg-aca-gga-ggg-cat-gga-gag-atg-gcg-ttt-ttt-ttt-5’，5’端采用巯基修饰，以便于和纳米金结合，该过程由上海生工公司合成。2、检测线6处的探针a（sequenceidno.2），探针a的核苷酸序列为：5’-cgc-cat-ctc-tcc-atg-ccc-tcc-tgt-ccg-tgc-cct-cag-tca-tct-gac-ctc-tgt-gct-gct-3’，3’端采用生物素修饰，以方便和链霉亲和素结合，该序列由上海生工公司合成。3、控制线7处的探针b，探针b的核苷酸序列为：3’-aaa-aaa-aaa-5’，其3’采用生物素修饰。二、使用方法氯霉素适配体和纳米金自组装结合形成纳米金-氯霉素适配体复合物，并包被在结合垫3处；探针a与链霉亲和素混合后形成链霉亲和素-探针a复合物，包被在检测线6处。探针b与链霉亲和素混合后形成链霉亲和素-探针b复合物，包被在控制线7处。在样品垫4处加入检测靶标，并加入流动缓冲液，使得检测靶标向检测线6和控制线7方向移动。三、试纸条原理试纸条的检测原理如图2所示。若检测靶标中不包含氯霉素，检测靶标与纳米金-氯霉素适配体复合物达到检测线6和控制线7处，与检测线6中的探针a结合，并且与控制线7中的探针b结合；最终检测线6和控制线7共同显色，结果为阴性。若靶标溶液中包含氯霉素，靶标溶液与纳米金-氯霉素适配体复合物达到检测线6之前，靶标溶液中的氯霉素与适配体复合物结合，当其到达检测线6处，无法与探针a结合或者与探针a弱结合；最终检测线6不显色或者显色不明显，控制线7显色，结果为阳性。实施例二：一种用于检测氯霉素的试纸条的制备方法，包括如下步骤：一、适配体与纳米金自组装形成适配体复合物1、纳米金的制备1ml1%氯金酸稀释至100ml，加入2ml质量百分数为1%的柠檬酸三钠，在350r/min的转速下，温度为100℃下搅拌11min，制得平均粒径为15nm的纳米金溶液；2、纳米金-氯霉素适配体复合物的制备氯霉素适配体（sequenceidno.1）的5’端采用巯基修饰（上海生工公司合成）步骤1中的纳米金溶液采用0.01mol/l的naoh调制ph=7.4，在10000r/min的条件下离心15min，弃去上清液，制得浓缩纳米金备用；10μl浓度为10μmol/l的氯霉素适配体与500μl的浓缩纳米金搅拌混合，在室温孵育8h之后加入2mol/lnacl至浓度为50mmol/l，在室温下活化12h之后，混合物在6500r/min的转速下离心15min，弃去上清液制得纳米金-氯霉素适配体复合物备用。纳米金-氯霉素适配体复合物包被在结合垫3上，并且在37℃干燥7min。二、检测线6处探针a复合物的制备10μl浓度为100μmol/l的生物素修饰的探针a与20μl浓度为2mg/ml的链霉亲和素搅拌混合，在常温下反应2小时制得探针a复合物。利用胶体金点样系统为试纸条划线，并且在37℃烘干处理。三、控制线7处探针b复合物的制备10μl浓度为100μmol/l的探针b与20μl浓度为2mg/ml的链霉亲和素搅拌混合，在常温下反应2小时制得探针b复合物。利用胶体金点样系统为试纸条划线，并且在37℃烘干处理。四、试纸条的封闭处理为了减少试纸条对纳米金的非特异性吸附，样品垫4预先采用样品垫封闭剂浸泡，同时流动缓冲液也采用封闭剂做封闭处理。样品垫封闭剂采用浓度为1%的牛血清白蛋白溶液，流动缓冲液选择含有质量百分数为1%牛血清白蛋白，2%蔗糖和0.5%吐温-20的磷酸缓冲液。五、测试在结合垫3上包被5μl纳米金-氯霉素适配体复合物，并且在37℃烘干10min；检测线6处包被2μl探针a复合物，控制线7包被2μl探针b复合物。取5μl不含氯霉素的检测靶标滴在样品垫4上，并且在样品垫4上滴加55μl流动缓冲液，使得检测靶标向检测线6和控制线7方向移动。20min之后，肉眼观察检测线6和控制线7共同显色，并采用免疫色谱读数仪测试吸光度值为357.3。对比例为提高试纸条的显色效果，设置如下对比例分别对纳米金的粒径、氯霉素适配体的浓度、封闭剂的种类、链霉亲和素的种类、硝化纤维素膜2的种类进行调整。具体如下所示：对比例1：一种用于检测氯霉素的试纸条的制备方法，其与实施例二的区别在于氯霉素适配体浓度不同。（1）氯霉素适配体浓度为50µmol/l；其最终的吸光度值为482.0。（2）氯霉素适配体浓度为100µmol/l，其最终吸光度值为522.7。采用该试纸条可以对不同浓度的氯霉素进行检测。对比例2：一种用于检测氯霉素的试纸条的制备方法，其与实施例二的区别在于封闭剂的种类和浓度不同。（1）封闭剂选择质量百分数为0.25%牛血清白蛋白、2%蔗糖和0.5%吐温-20的磷酸缓冲液，最终吸光度值为506.8；（2）封闭剂选择质量百分数为0.5%牛血清白蛋白、2%蔗糖和0.5%吐温-20的磷酸缓冲液，其最终吸光度值为481.3；（3）封闭剂选择质量百分数为1%牛血清白蛋白、2%蔗糖和0.5%吐温-20的磷酸缓冲液，其最终吸光度值为456.1；（4）封闭剂选择质量百分数为0.25%酪蛋白、2%蔗糖和0.5%吐温-20的磷酸缓冲液，其最终吸光度值为121.5；（5）封闭剂选择质量百分数为0.5%酪蛋白、2%蔗糖和0.5%吐温-20的磷酸缓冲液，其最终吸光度值为51.1；（6）封闭剂选择质量百分数为1%酪蛋白、2%蔗糖和0.5%吐温-20的磷酸缓冲液，其最终吸光度值为28.7；（7）封闭剂选择质量百分数为0.25%鸡卵清蛋白、2%蔗糖和0.5%吐温-20的磷酸缓冲液，其最终吸光度值为51.5；（8）封闭剂选择质量百分数为0.5%鸡卵清蛋白、2%蔗糖和0.5%吐温-20的磷酸缓冲液，其最终吸光度值为12.3；（9）封闭剂选择质量百分数为1%鸡卵清蛋白、2%蔗糖和0.5%吐温-20的磷酸缓冲液，其最终吸光度值为7.06。由上述结果可知，选择牛血清白蛋白作为封闭剂，最终测得的吸光度值比较高，试纸条的显色效果较佳。对比例3：一种用于检测氯霉素的试纸条的制备方法，其与实施例二的区别在于封闭剂的封闭位置不同，选择浓度为1%的牛血清白蛋白作为封闭剂。（1）仅在样品垫4中加入封闭剂浸润，其最终吸光度值为429.43；（2）仅在缓冲液中加入封闭剂至牛血清白蛋白的浓度为1%，其最终吸光度值为444.77；（3）在样品垫4和缓冲液中均加入封闭剂，其最终吸光度值为522.9。由以上结果可知，样品垫4和缓冲液中都加入封闭剂，显色效果较佳，实际检测时，在样品垫4和缓冲液中均加入封闭剂。对比例4：一种用于检测氯霉素的试纸条的制备方法，其与实施例二的区别在于链霉亲和素的种类不同。（1）选择盘古基因生物工程股份有限公司的gsa作为链霉亲和素，ph=7，其最终吸光度值为509.4；（2）选择盘古基因生物工程股份有限公司的gsa作为链霉亲和素，ph=8，其最终吸光度值为454.3；（3）选择盘古基因生物工程股份有限公司的gsa作为链霉亲和素，ph=9，其最终吸光度值为216.3；（4）选择南京盘古生物公司的sa作为链霉亲和素，ph=7，其最终吸光度值为385.9；（5）选择南京盘古生物公司的sa作为链霉亲和素，ph=7，其最终吸光度值为385.1。使用该试纸条检测时，选择盘古基因生物工程股份有限公司的gsa作为链霉亲和素，试纸条的显色效果较佳。对比例5:一种用于检测氯霉素的试纸条的制备方法，其与实施例二的区别在于硝化纤维素膜2的种类不同。（1）选择上海杰一生物技术有限公司的millopore135作为硝化纤维素膜2，最终吸光度值为464.3；（2）选择上海杰一生物技术有限公司的sartorius140作为硝化纤维素膜2，最终吸光度值为448.6。在实际检测时，选择millopore135作为硝化纤维素膜2。对比例6：一种用于检测氯霉素的试纸条的制备方法，其与实施例二的区别在于纳米金的粒径不同。具体如下：（1）1ml质量百分数为1%的氯金酸稀释至100ml，加入2.5ml质量百分数为1%的柠檬酸三钠，在320r/min转速下，100℃下搅拌12min，制得平均粒径为25nm的纳米金溶液；10μl浓度为10μmol/l的氯霉素适配体与600μl的浓缩纳米金搅拌混合，在室温孵育6.5h之后加入2mol/lnacl至浓度为45mmol/l，在室温下活化12h之后，混合物在7000r/min的转速下离心10min，弃去上清液制得纳米金-氯霉素适配体复合物备用；最终测得的吸光度值为506.7。（2）1ml质量百分数为1%的氯金酸稀释至100ml，加入2ml质量百分数为1%的柠檬酸三钠，在300r/min转速下，110℃下搅拌11min，制得平均粒径为35nm的纳米金溶液；10μl浓度为10μmol/l的氯霉素适配体与600μl的浓缩纳米金搅拌混合，在室温孵育6.5h之后加入2mol/lnacl至浓度为45mmol/l，在室温下活化12h之后，混合物在7000r/min的转速下离心10min，弃去上清液制得纳米金-氯霉素适配体复合物备用；最终吸光度值为660。平均粒径为15-35nm的纳米金均具有较好的显色效果。对比例7：一种用于检测氯霉素的试纸条的制备方法，其与实施例二的区别在于读数时间不同。具体如下：（1）检测靶标滴在样品垫4之后，5min进行读数；最终吸光度值为513.2；（2）检测靶标滴在样品垫4之后，10min进行读数；最终吸光度值为684.9；（3）检测靶标滴在样品垫4之后，15min进行读数；最终吸光度值为522.6；（4）检测靶标滴在样品垫4之后，25min进行读数；最终吸光度值为519.6；（5）检测靶标滴在样品垫4之后，35min进行读数；最终吸光度值为517.6。由以上数据可知，在20min之后读数，显色较稳定，检测效果更佳。经过多次试验验证，最终得出：（1）封闭剂选择0.9-1.1%的牛血清白蛋白；（2）封闭的最优方式是将缓冲液和样品垫4中都加入1%的牛血清白蛋白；（3）选择盘古基因生物工程股份有限公司的gsa,ph为7；（4）硝化纤维素膜2选择上海杰一生物技术有限公司的millopore135；（5）选择纳米金的粒径为15-35nm；（6）试纸条优选在20min之后读数。用于检测氯霉素的试纸条在该条件下进行测试，最终测试结果具有较好的一致性、稳定性和敏感性。实施例三：氯霉素标准曲线绘制取浓度为1mg/ml的氯霉素标准储备液，并用乙腈配制成浓度分别为0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、120μg/ml、160μg/ml、180μg/ml和200μg/ml的标准品溶液，具体浓度和吸光度值的标准曲线如图3所示。由以上结果可知，氯霉素的检测范围在0.5-160µg/ml之间。而且检测的视觉灵敏度为0.5ppm，读数仪检测限为63.4ppb（按照国际法3∂法计算）。实施例四：检测水中的氯霉素将自来水过膜后加入10、80和160μg/ml标准氯霉素，取5µl该样品加到样品垫4上，并加55µl缓冲液使样品流过检测线6位置，20min后将试纸条放入读卡仪（c11787modl1）中读数得到吸光度值，所有的结果均重复3次，具体结果如表1所示。表1加标回收率测试结果检测项目氯霉素浓度（μg/ml）吸光度吸光度在标准曲线上对应的氯霉素浓度（μg/ml）加标回收率（%）110449.98.57585.75280315.788.566110.713160175.7172.013107.51最终得到加标回收率在85.7%－110.68%之间，且相对标准偏差为0.2707%－0.7437%，符合要求，说明此方法可用于检测实际样品中的氯霉素。加标回收率的计算公式为：加标回收率=实测氯霉素浓度/标准氯霉素浓度*100%。实施例五：特异性试验分别取空白试样（自来水）、浓度为100nmol/l的氟苯尼考、浓度为100nmol/l甲砜霉素、浓度为100nmol/l黄曲霉毒素b1和浓度为100nmol/l氯霉素滴加到试纸条上，观察试验现象。只有氯霉素显示颜色吸收值为292.3，与理论结果相同；空白样、氟苯尼考、甲砜霉素和黄曲霉毒素b1的颜色吸收值分别为514.2，500.567，503.0，506.1。由此可知，该试纸条仅对氯霉素有特异性。本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。sequencelisting<110>北京化工大学<120>用于检测氯霉素的试纸条及其制备方法<130>2018.1.11<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>66<212>dna<213>人工序列<400>1agcagcacagaggtcagatgactgagggcacggacaggagggcatggagagatggcgttt60tttttt66<210>2<211>57<212>dna<213>人工序列<400>2cgccatctctccatgccctcctgtccgtgccctcagtcatctgacctctgtgctgct57当前第1页12