本发明属于分析化学样品前处理技术领域，特别涉及一种分离富集环境水样中痕量雌激素的方法。该方法制备出一种高内相乳液聚合物整体柱，适用于环境水样及其他复杂基体中痕量雌激素目标物的分离、富集和纯化。
背景技术：
雌激素(estrogen)又称雌性激素、女性激素，是一类主要的女性荷尔蒙。在女性身体中，通常通过卵巢与胎盘产生，少量一部分通过人体肾上腺皮质与肝分泌而来。雌激素可分为天然雌激素与合成雌激素两大类，其中，天然雌激素由人体分泌而来，主要包括：雌二醇、雌三醇、雌酮等。合成雌激素主要为与雌二醇结构相似的类固醇衍生物，其中包括：乙烯雌酚、炔雌醇等。雌激素刺激人的中枢伸进会影响人的情绪、心理、内分泌，且对人体的影响具有两面性，首先，雌激素作为卵泡发育的直接刺激因素，直接影响了卵巢的功能。分泌充足的雌激素能够使女性的乳腺、子宫、皮肤得到显著的改善，甚至可以降低血管中血液的压力，减少心血管疾病突发的几率。其次，当雌激素分泌过量或食入过多的雌激素时，会导致女性内分泌紊乱、受到妇科病甚至是乳腺癌的危害。同时，雌激素并非为女性的专属，男性常常通过食入一些激素超标的食品使自身的雌激素过高，会引起男性雄性激素的分泌，内分泌紊乱，导致男性患上睾丸癌等疾病。因此，近年来，对于雌激素的分析检测越来越受到人们广泛的关注，
目前，雌激素的检测方法主要有高效液相色谱法-紫外检测法，高效液相色谱-安培法、高效液相色谱法-质谱联用法、酶联免疫法毛细管电泳法等。高效液相色谱法紫外检测，采用高效液相色谱法-紫外检测法进行分析检测，有助于提高雌激素残留检测的灵敏度。
固相萃取(solidphaseextraction，spe)是一个由柱色谱分离过程、分离机理、固定相和溶剂的选择等组成的试样预处理技术，其利用固体吸附剂吸附液体样品中的目标物，使目标物与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱，最终达到分离和富集目标物的目的。spe具有操作时间短、样品量小、不需萃取溶剂、适于分析挥发性与非挥发性物质、重现性好等优点.对环境化学、食品、医药卫生、临床化学、生物化学、法医学等领域中复杂目标物样品微量或痕量的分离、富集和分析做出了巨大的贡献。
高内相乳液[highinternalphaseemulsion(hipe)]，是一种水包油(o/w)或油包水(w/o)两相体系，其中分散相的体积分率在74％以上，甚至达到99％。制备高内相乳液整体柱的过程中，可通过改变乳液材料的单体种类、单体种类、乳液材料的相比等精确控制孔的大小和分布，且高内相乳液整体柱具有高孔隙率、高比表面积、低密度、很好的物质输送能力以及重现性好的特点，在分离介质、吸收材料、生物组织工程、催化剂载体等领域显示出较好的应用前景。
技术实现要素：
本发明的目的在于，克服高内相乳液整体柱材料在种类和萃取效果上的很多不足，提供一种分离富集环境水样中痕量雌激素的方法。
具体步骤为：
(1)采用高内相乳液聚合技术合成具有亲水性的甲基丙烯酸甲酯mma-二乙烯苯dvb-反式丁烯二酸tba高内相乳液聚合整体柱，即mma/dvb/tbapolyhipe整体柱。
(2)将20ml目标环境水样在蠕动泵或高压泵的作用下以2ml/min的流速通过步骤(1)合成的mma/dvb/tbapolyhipe整体柱，萃取并富集目标环境水样中存在的痕量雌激素，然后采用体积百分比浓度为20％的甲醇水溶液作为清洗剂清洗mma/dvb/tbapolyhipe整体柱，除去吸附力小的干扰物质，继而采用体积比为1:9的乙酸/乙腈混合溶液洗脱富集在mma/dvb/tbapolyhipe整体柱上的雌激素目标物，收集洗脱液，将洗脱液通过有机滤膜后，放入进样瓶，上机测定，即实现对环境水样中痕量雌激素的分离富集。
所述mma/dvb/tbapolyhipe整体柱的具体制备步骤为：将单体mma、dvb、tba及表面活性剂span80按照体积比为30:5:14:15依次加入到离心管中，运用涡旋振荡器搅拌均匀，形成有机相；配制0.02g/ml的过二硫酸钾水溶液，该过二硫酸钾水溶液不仅作为材料的水相，也作为引发材料聚合的引发剂；将水相逐步滴加入有机相中，每次加入200μl，且每加入一次均用涡旋振荡器搅拌均匀，直至加入1.36ml为止，得到高内相乳液，其中水相体积占水相和有机相总体积的比为75％；取1.0ml制备好的高内相乳液，加入到2ml预填充有玻璃纤维丝且内表面粗糙的针管中，填充密实并封口；置于干燥箱中60℃下热聚合24小时，即制得mma/dvb/tbapolyhipe整体柱。
借由上述技术方案，本发明分离富集环境水样中痕量雌激素的方法至少具有以下优点：
1)本发明采用高内相乳液(hipe)法，制备了新型mma/dvb/tbapolyhipe整体柱，整体柱比表面积打，孔径较小，孔间通道数目多，形成巨大相互贯通的蜂窝结构。具有制备简单、渗透性好、对大体积的样品有较好的萃取效果的优点。
2)经过对单体比例的调控，相比的优化，使得乳液稳定性增加，乳液不断变粘稠，获得了吸附性强、流通性好、稳定性与重现性好的高内相乳液聚合物整体柱；对雌激素具有高的萃取和富集能力，可应用于复杂水体样品痕量雌激素的选择性萃取、富集和分析；采用高效液相色谱-紫外光谱仪(hplc-uvd)方法进行定性定量分析，实现了大体积环境水样中雌激素的高灵敏、超微量准确分析。
附图说明
图1是本发明中mma/dvb/tbapolyhipe整体柱的制备过程及萃取富集过程示意图。
图2是本发明实施例制得的mma/dvb/tbapolyhipe整体柱在放大倍数为50倍下的金相显微镜图。
图3是本发明实施例制得的mma/dvb/tbapolyhipe整体柱与hplc-uvd联用分离分析雌激素色谱图(三种雌激素的检测波长均为220nm)。
具体实施方式
为更进一步阐释本发明为达到预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳的实施例，对依据本发明提出的一种新型萃取富集大体积环境水样中微量雌激素的方法及其应用具体实施方式、方法、步骤、特征及其功效，详细说明如后。
实施例：
(1)mma/dvb/tbapolyhipe整体柱制备
在10ml离心管中，分别加入功能单体甲基丙烯酸甲酯、反式丁烯二酸、交联剂二乙烯基苯和表面活性剂span80，四种物质的体积比为30:14:5:15，用涡旋振荡器搅拌均匀，形成有机相。配制0.02g/ml的过二硫酸钾水溶液，该过二硫酸钾水溶液不仅作为材料的水相，也作为引发材料聚合的引发剂；将水相逐渐加入有机相中，每次加入0.2ml，加入后均用涡旋振荡器搅拌均匀直至加入1.36ml为止，得到高内相乳液，其中水相体积占水相和有机相总体积的比为75％。取1.0ml制备好的高内相乳液，加入到2ml预填充有玻璃纤维丝且内表面粗糙的针管中，填充密实并封口，放入干燥箱中，在60℃下热聚合24h，即制得mma/dvb/tbapolyhipe整体柱。反应过程简要示意图如图1所示。将所得mma/dvb/tbapolyhipe整体柱用水、乙醇轮流多次洗涤，除去所含的其他杂质，直至洗脱液上机测定无杂峰为止。所得mma/dvb/tbapolyhipe整体柱的表面显微结构如图2所示。
(2)mma/dvb/tbapolyhipe整体柱分离富集雌激素
将mma/dvb/tbapolyhipe整体柱上端加入上样品溶液，采用蠕动泵输送环境水样品(见图3)，流速为2.0ml/min，上样体积达20ml。萃取完成后，先用体积百分比浓度为20％甲醇水溶液清洗杂质，然后采用体积比为1:9的乙酸/乙腈混合溶液洗脱富集在整体柱上的雌激素目标物，收集洗脱液，采用hplc-uvd进行检测。萃取及富集过程示意图如图1所示。
应用实例1—本实施例制得的高内相乳液聚合物整体柱与hplc-uvd联用分离分析池塘水中雌激素的含量
首先从桂林理工大学雁山校区附近的池塘里内取10l水，静止沉积大颗粒杂质，然后过0.45μm滤膜。取20ml水样，通过蠕动泵以2.0ml/min流速通过整体柱；萃取完成后，用20％甲醇水溶液清洗整体柱，再用3ml体积比为1:9的乙酸/乙腈混合溶液洗脱目标物，收集洗脱液；将洗脱液过0.22μm滤膜，用hplc-uvd分析。
图3中(a)是雌激素的hplc-uvd色谱图，(b)是池塘水样品通过整体柱富集后的hplc-uvd色谱图，(c)是漓江水样品未经整体柱富集的hplc-uvd色谱图。通过定量分析可知，池塘水中未检测出雌激素的含量。
应用实例2—本实施例制得的高内相乳液聚合物整体柱与hplc-uvd联用分离分析河水中雌激素的含量
首先从桂林市区漓江内取河水10l，静止沉积大颗粒杂质，取上清液300ml，过0.45μm滤膜，通过蠕动泵以2.0ml/min流速通过整体柱；萃取完成后，20％甲醇水清洗整体柱，再用3ml体积比为1:9的乙酸/乙腈混合溶液洗脱目标物，收集洗脱液；将洗脱液过0.22μm滤膜，用hplc-uvd分析。通过定量分析可知，河水中未检测出雌激素的含量。
在上述实例中，是采用池塘水、漓江水等样品作为研究对象来证实本发明所制备的mma/dvb/tbapolyhipe高内相乳液聚合整体柱的高萃取富集能力。但以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术内容方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
表1mma/dvb/tbapolyhipe整体柱对雌激素的萃取率结果(n＝3)
表2mma/dvb/tbapolyhipe整体柱-hpl-uvd联用分离分析池塘水中雌激素的含量结果(n＝3)
表3mma/dvb/tbapolyhipe整体柱-hplc-uvd联用分离分析漓江水中雌激素的含量结果(n＝3)