本发明涉及一种测定羽毛降解率的方法，属于羽毛降解率检测方法技术领域。
背景技术：
羽毛富含角蛋白，是较好的动物性蛋白饲料来源，但角蛋白不易被畜禽消化，利用率降低。因此，在将羽毛饲用之前，需采取方法将羽毛角蛋白降解，生物发酵法是降解羽毛提高其饲用价值的发展方向。但目前还没有统一的检测羽毛降解率的实验方法。目前常用的测定羽毛降解率的实验方法是减重法，但传统的检测方法，将羽毛整根放置于发酵液中，造成发酵过程中，并未被有效降解的断羽分散到了发酵液中，这样再对整根羽毛进行减重法检测羽毛降解率，往往造成测定结果偏高，而且测定的平行性和重复性很差；采用粉碎后的羽毛进行发酵，其羽毛粉在发酵过程中，会粘到发酵器皿上，无法随着发酵液转移到滤纸上，同样造成结果偏高，测定的平行性和重复性也较差。而且以上两种方法采用过滤法时，重力法过滤速度较慢，而真空抽滤法对仪器设备有一定要求，均不利于对羽毛降解率进行高通量测定。
技术实现要素：
为解决现有减重法检测结果不够准确，测定平行性和重复性差，以及测定效率较低的问题，本发明提供了一种测定羽毛降解率的方法，采用的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种测定羽毛降解率的方法，该方法包括如下步骤：
1)将尼龙袋烘干至恒重，称量尼龙袋重量，记为M1；
2)将羽毛清洗，烘干后粉碎，过筛获得羽毛粉；
3)称取羽毛粉，置于步骤1)的尼龙袋中，封口后烘干至恒重，称量重量，记为M2；
4)将尼龙袋完全浸没于液体培养基中，向液体培养基中接种菌液后进行发酵，发酵完成后将尼龙袋捞出，置于容器中，然后加入蒸馏水，使蒸馏水完全浸没尼龙袋，将容器置于水浴摇床中进行清洗，重复操作多次，将清洗后的尼龙袋烘干后称重，记为M3；
5)按照如下公式计算羽毛降解率，羽毛降解率＝[(M2-M3)/(M2-M1)]*100。
优选地，步骤1)所述尼龙袋的孔径为40μm。尼龙袋孔径采用40μm，在该条件下的尼龙袋可以获得最为准确的羽毛降解率测定结果，因为如果孔径太大，后续操作过程中发酵后形成的未被有效降解的固形物会通过尼龙袋的孔目中流出，导致结果不准确；如果孔径太小的话，发酵微生物不易通过尼龙袋孔目进入尼龙袋内部对羽毛粉进行降解，影响发酵效率。
优选地，步骤2)所述过筛是将粉碎后的羽毛先过30目筛，再过40目筛，取40目筛上的粉末，获得羽毛粉。如果筛子孔径过大，羽毛粉不均匀，筛子孔径太小羽毛粉容易飞散，因此先过30目筛，再过40目筛，取40目筛上留存的羽毛粉最为适宜。
优选地，步骤1)所述烘干的温度为105℃；步骤3)所述烘干的的温度为105℃；步骤4)所述烘干的温度为105℃。
优选地，步骤4)所述清洗是在70℃-90℃、100rpm的条件下清洗。
优选地，步骤4)所述清洗的时间为10min。
优选地，步骤4)所述重复操作次数为五次。
优选地，步骤3)所述称取羽毛粉的重量为2g。
本发明步骤3)中称取羽毛的重量可以自行选择。
本发明步骤4)的菌液适用于任意菌株的菌液，尤其是具有降解羽毛作用菌株的菌液。
本发明方法适用于评价各种菌株对羽毛的降解率。对于不能够降解羽毛的菌液的情况，经本发明方法测定的降解率为0。
本发明步骤4)中的培养基用于为菌液中的菌株提供营养物质，因此该培养基根据菌液进行选择。
本发明方法检测原理：
本发明首先称量尼龙袋烘干至恒重的质量M1，然后再称量将羽毛粉装入尼龙袋后，置于105℃烘箱中烘干至恒重后获得的发酵前羽毛粉和尼龙袋的总重量M2，二者之差(M2-M1)即为发酵前未降解的羽毛粉的干重；然后将尼龙袋浸没在液体培养基中，通过向液体培养基中接入可以降解羽毛(角蛋白)的菌液，菌株通过尼龙袋的孔径进入到尼龙袋内部，然后对羽毛粉进行发酵降解，发酵完成后将尼龙袋捞出置于容器中，加入蒸馏水至完全浸没尼龙袋，在摇床中进行晃动清洗，以便将尼龙袋内部降解后的可溶性物质从尼龙袋中析出，而未被降解的固形物仍然留在尼龙袋内，发酵后将尼龙袋从发酵液中捞出，并将培养基完全清洗干净后，置于105℃的烘箱中烘至恒重后，称量发酵后尼龙袋和其内部羽毛的总重量，即为发酵降解后的羽毛粉和尼龙袋的总重量M3，M2-M3即为羽毛降解后的干重，因此[(M2-M3)/(M2-M1)]*100即为羽毛降解率。
本发明有益效果：
现有测定羽毛降解率的减重法和真空抽滤法存在测定的结果不够准确，平行性和重复性较差，测定效率较低的问题。本发明首次建立了尼龙袋法测定羽毛的降解率可以有效克服现有减重法和真空抽滤法存在的问题，本发明通过尼龙袋来测定微生物对羽毛的降解率，该方法测定羽毛降解率的结果更为准确，并且平行性和重复性较好，操作方法更简单，有效提高了检测的效率，同时该方法不受微生物种类的影响，适合于微生物对羽毛降解能力的评定，或用于微生物降解羽毛条件的优化研究。采用本方法进行微生物降解羽毛的研究，可以将发酵液和底物进行有效隔离，适合对发酵液和发酵底物进行后续的独立研究，降低了实验难度，提高了实验效率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
实施例1：
本实施例提供了一种测定羽毛降解率的方法，该方法包括如下步骤：
1)将30个400目(孔径40μm)的尼龙袋(6cm*5cm)，用铅笔做好标记后在105℃下烘干至恒重，分别称量每个尼龙袋重量，记为M1；
2)将羽毛清洗后烘干，粉碎后，先过30目筛，再过40目筛，获得羽毛粉(500μm左右)；
3)称取2g羽毛粉，置于步骤1)的尼龙袋中，封口后105℃烘干至恒重，分别称量重量，记为M2；
4)将尼龙袋灭菌后，首先，取10个尼龙袋完全浸没于10份MRS培养基中，然后向10份MRS培养基中分别接种羽毛降解菌(相当于10个平行处理)；其次，取10个尼龙袋完全浸没于10份液体LB培养基中，然后向10份液体LB培养基中分别接种不具有羽毛降解能力的大肠杆菌(相当于10个平行处理)；最后，取10个尼龙袋完全浸没于未接种任何微生物的液体MRS培养基中(相当于10个平行处理)；将30个样分别在微生物最适生长条件下进行发酵，发酵完成后将尼龙袋捞出，置于容器中，然后加入500mL蒸馏水，将容器置于水浴摇床中，在90℃、100rpm的条件下清洗10min，重复操作5次，分别将清洗后的30个尼龙袋于105℃烘干后称量发酵后的尼龙袋和其内部羽毛的总重量，记为M3；
5)按照如下公式计算羽毛降解率，羽毛降解率＝[(M2-M3)/(M2-M1)]*100。
本实施例中菌液为：采用具有羽毛降解能力的乳球菌降解羽毛，采用无羽毛降解能力的大肠杆菌作为对照实验，同时以无菌液作为空白对照。
本实施例中培养基为：1、用于培养本实验室自行筛选分离的乳球菌的MRS培养基(以羽毛为唯一氮源)：羽毛粉20.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，蒸馏水1000mL；用于培养本实验室自行筛选保存的大肠杆菌的LB培养基(以羽毛为唯一氮源)：羽毛10.0g，酵母膏5.0g，氯化钠10.0g，蒸馏水1000mL。
经过计算，乳球菌对羽毛的降解率为26.31％，大肠杆菌和无菌液中羽毛粉的降解率为0％，具体数据见表1。
表1降解率
分析与结论：将本发明实施例结果表明，本发明尼龙袋法仅对具有羽毛降解率的微生物有效，不会对检测结果造成假阳性。
实施例2
本实施例提供了一种测定羽毛降解率的方法，该方法包括如下步骤：
1)将400目(孔径40μm)的尼龙袋(6cm*5cm)，用铅笔做好标记后在105℃下烘干至恒重，称量每个尼龙袋重量，记为M1；
2)将羽毛清洗后烘干，粉碎后，先过30目筛，再过40目筛，获得羽毛粉(500μm左右)；
3)称取2g羽毛粉，置于步骤1)的尼龙袋中，封口后105℃烘干至恒重，称量重量，记为M2；
4)将尼龙袋灭菌后，将尼龙袋放置于液体MRS培养基中，并接种本实验室分离筛选的乳球菌，使培养基完全浸没尼龙袋，在微生物最适生长条件下进行发酵，发酵完成后将尼龙袋捞出，置于容器中，然后加入500mL蒸馏水，使蒸馏水完全浸没尼龙袋，将容器置于水浴摇床中进行清洗，在90℃、100rpm的条件下清洗10min，重复操作5次，将清洗后的尼龙袋于105℃烘干后称量发酵后的尼龙袋和其内部羽毛的总重量，记为M3；
5)此实验设置10个重复；
6)按照如下公式计算羽毛降解率，羽毛降解率＝[(M2-M3)/(M2-M1)]*100。
对照试验一：采用整根羽毛减重法
1)另取未碎整根羽毛，清洗后烘干；
2)称取重量为2g左右的整羽，105℃烘干至恒重，记录重量(N1)，灭菌后直接放置于接种了羽毛降解菌的液体MRS培养基中，使培养基完全浸没羽毛，在微生物最适生长条件下进行发酵；
3)发酵完成后将羽毛捞出，置于容器中，然后加入500mL蒸馏水，将容器置于水浴摇床中，在90℃、100rpm的条件下清洗10min，重复操作5次，105℃烘干后称量记为N2；
4)此实验设置10个重复；
5)按照如下公式计算羽毛降解率，羽毛降解率＝(N1-N2)/N1*100。
对照试验二：羽毛粉真空抽滤法
1)将羽毛清洗后烘干，粉碎后，先过30目筛，再过40目筛，获得羽毛粉(500μm左右)；
2)称取2g左右的羽毛粉，105℃烘干至恒重，称量后记录重量为K1；
3)取直径为5cm的铝盒，105℃恒重后记录重量为K2；
4)将羽毛粉灭菌后，放置于接种了羽毛降解菌的液体MRS培养基中，搅匀后在微生物最适生长条件下进行发酵，发酵完成后，采用水系0.4μm滤膜，用真空抽滤器对样品进行过滤，对过滤物用热蒸馏水进行反复清洗培养瓶后同时进行抽滤，尽量使不溶物完全被洗出；
5)将过滤物转移到铝盒，并用少量蒸馏水将滤膜上粘的固形物也洗脱到铝盒中，105℃烘干后称量记为K3；
6)此实验设置10个重复；
7)按照如下公式计算羽毛降解率，羽毛降解率＝[K1-(K3-K2)]/K1*100。
本实施例中菌液为：本身实验室分离筛选的具有羽毛降解能力的乳球菌
本实施例中培养基为：MRS培养基(以羽毛为唯一氮源)：羽毛粉20.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，蒸馏水1000mL
经过计算，尼龙袋法法检测的羽毛降解率为26.28％，整根羽毛减重法测定的羽毛降解率为29.15％，羽毛粉真空抽滤法测定的羽毛降解率为27.06％，具体数据见表2。
表2降解率
分析与结论：将本发明实施例与对照试验(减重法)相比较发现，整羽减重法和真空抽滤法测定的羽毛降解率要高于尼龙袋法。通过观察发酵后培养液、发酵器皿和滤膜发现，整羽减重法的发酵液中存在大量的未被完全降解的断羽，因此采用直接称量的方法，会使测定数据偏高，而从标准差也可以看出，实验的平行性和重复性较差。羽毛粉真空抽滤法的发酵器皿和滤膜中都还有残存的羽毛粉存在，所以测定降解率的数值也会偏高，并且平行性和重复性也较差。本项目还对整羽采用了真空抽滤法进行了检测，也存在碎羽与实验仪器粘连的现象。另外，真空抽滤法对仪器设备有要求，一个抽滤器只能同时做一个样品，效率较低，而且其人工操作也较复杂。从标准差可以看出，尼龙袋法测定羽毛降解率的平行性和重复性较好，这是因为羽毛在发酵前后过程中都被包在尼龙袋中，只有降解后的可溶性物质才可以从尼龙袋析出，羽毛不会与设备器皿发生粘连情况，降解不完全的碎羽也不会散落在培养基中，因此其平行性和重复性与后两种方法相比要好。而且尼龙袋法中的尼龙袋既是滤器，也是容器，减少了实验对仪器设备的依赖，也使人工操作更加简单，提高了检测的效率，实验的检测通量也较高。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。