一种黄曲霉毒素B1的荧光定量检测检测卡及其应用的制作方法

本发明涉及检测食品和饲料中黄曲霉毒素b1的荧光定量检测卡及其应用。

背景技术：

黄曲霉毒素b1（aflatoxinb1，afb1）是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素），具有强致癌性以及剧毒性，是迄今发现的各种真菌毒素中最稳定的一种。从1993年开始黄曲霉毒素被认定为世界卫生组织（who）的癌症研究机构划定的一类致癌物，是世界公认三大强致癌物质之一，而黄曲霉毒素b1因毒性最大，污染最重，是危害最大一种黄曲霉毒素。黄曲霉毒素b1污染的食物主要是花生、玉米、稻谷、小麦、花生油等粮油食品和饲料。目前已有91个国家制定了tafs在不同食品中的最大残留限量（mrl），如国际食品法典委员会（cac）和美国食品与药物监督管理局（fda）等规定食品中黄曲霉毒素总量的mrl为15μg/kg，日本为10μg/kg，欧盟（ec）为4μg/kg。目前，我国现行的《gb2761-2011食品中真菌毒素限量》标准中规定了afb1的限量标准，对粮食及其制品中黄曲霉毒素b1的最高限量为20μg/kg。gb13078-2001《饲料卫生标准》中对不同种类饲料中黄曲霉毒素b1的最高限量标准为10~50μg/kg。

黄曲霉毒素b1的检测是控制黄曲霉毒素b1残留的重要途径之一。目前，有关食品和饲料中黄曲霉毒素b1残留检测方法主要为高效液相色谱法、半定量薄层色谱法、酶联免疫吸附测定法、胶体金免疫层析法等。高效液相色谱法结果可靠、灵敏度高，但设备昂贵、技术水平要求高，样品前处理繁琐、耗时长，不适合快速、现场检测。薄层色谱法，准确度有限，无法定量检测。酶联免疫吸附分析法和胶体金免疫层析法快速方便、操作简单、成本较低、筛检样品量大，但酶联免疫吸附法抗体与酶均属生物活性物质，需要低温保存，稳定性差；胶体金免疫层析法检测灵敏度低，无法进行准确的定性定量测定，主要用于快速筛选分析，且酶联免疫吸附分析法和胶体金免疫层析法均存在非特异性反应、检测结果易出现假阳性问题。

因此，急需制定既简便快速、又能准确定量的检测方法来改善现状，填补原有的快速检测方法标准的缺失，提升并规范整个快检行业的技术水平及产品质量。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种简便、快速、准确定量的食品和饲料中检测黄曲霉b1的荧光定量检测卡及其制备方法和应用。

本发明所提供的检测卡包括背板、样品垫、猝灭抗体结合垫、荧光反应膜和吸水垫，荧光反应膜位于背板的中央，荧光反应膜上设有包被有黄曲霉b1抗原的检测区t区和包被ⅱ抗的质控区c区，背板的一端端头为样品垫，另一端端头为吸水垫，荧光反应膜两端分别与吸水垫和猝灭抗体结合垫相互交叠连接，在猝灭抗体结合垫上压有样品垫。

所述t区靠近样品垫，所述c区靠近吸水垫。优选的，所述样品垫和所述猝灭抗体结合垫有2mm重叠区，所述荧光反应膜c线端和所述吸水垫有2mm重叠区。优选的重叠区保证了样品液流动的连续性，使反应能够充分发生，有效地降低了实验误差。

所述猝灭抗体结合垫包被有亲和素修饰胶体金颗粒标记的生物素化黄曲霉b1单克隆抗体。

所述背板可为pvc胶板；所述样品垫可为玻璃纤维棉制成；所述吸水垫可为吸水纸；所述荧光反应膜为事先固定有荧光供体的硝酸纤维素膜（nc膜）。

本发明荧光定量检测卡的检测原理为：检测卡含有被事先固定于荧光硝酸纤维素膜t区的抗原和c区的ⅱ抗。当将待测样品滴加在样品垫上时，样品中的黄曲霉b1与猝灭抗体结合垫中的黄曲霉b1单克隆抗体结合并通过毛细作用由样品垫向吸水垫方向层析，达到荧光反应膜后，检测区t区固定的黄曲霉b1抗原与过量未结合的抗体结合，t区聚集的金可显著猝灭该处的荧光，猝灭程度和目标物浓度相关。层析结束后，采用荧光读数仪读取t区位置的荧光强度f2以及c区与t区之间荧光强度的最大值f1，计算f2/f1值，比值越大，目标检测物黄曲霉b1的浓度越低。

本发明获得的荧光定量检测卡，是免疫荧光技术和传统免疫层析技术结合并在工艺上发展创新，而形成的一种新型定量检测技术。保留了胶体金免疫层析技术操作简便、检测快速、便携性强的优点，避免了大量的分离和洗涤步骤，同时结合荧光读数仪实现检测结果的精准定量，适宜进行高通量和定量检测。

附图说明

图1为本发明试纸条结构示意图。

具体实施方式

实施例1：黄曲霉b1荧光定量检测卡的制备

一、黄曲霉b1荧光定量检测卡原材料的制备

1、黄曲霉b1人工抗原的合成

黄曲霉b1为小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，通过戊二醛法或重氮化法将二种药物分别和载体蛋白偶联，得到二种药物的载体蛋白偶联物，才具有免疫原性。

2、黄曲霉b1单克隆抗体的制备

（1）动物免疫程序

采用balb/c小鼠作为免疫动物，以黄曲霉b1-载体蛋白为免疫原，免疫剂量为50-100μg/只。首次免疫时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射；间隔2周取相同剂量免疫原加等量复式不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次；第四次免疫后腹腔加强免疫一次，腹腔加强免疫3天后取脾细胞。

（2）细胞融合与克隆化

步骤（1）得到的小鼠脾细胞，按（4-8）：1比例与sp2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争elisa测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

（3）细胞冻存和复苏

取处于对数生长期的杂交瘤细胞，用冻存液制成1×10⁶-5×10⁶个/ml的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

（4）单克隆抗体的制备与纯化

采用体内诱生法，将balb/c小鼠（8周龄）腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7-14天后腹腔注射步骤（3）的杂交瘤细胞5×10⁵-10⁶个/只，7-10天后采集腹水。经辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，得到黄曲霉b1单克隆抗体。

二、黄曲霉b1荧光定量检测卡的制备

1、猝灭抗体结合垫的制备

（1）亲和素修饰胶体金的制备

在沸腾的100ml的1%氯金酸水溶液中加入2-4ml的0.5-5%柠檬酸三钠溶液，使用0.1~0.4μg/mligg/g亲和素修饰金，金颗粒大小为20~50nm。

（2）亲和素-生物素共价标金的制备

用150mmpbs稀释黄曲霉b1单克隆抗体至5ml，将稀释好的抗体加入10-25g的0.1~0.4μg/mligg/g亲和素修饰金溶液中混匀，4℃静置过夜，得到金标抗体悬浮液。

（3）猝灭抗体结合垫的制备

将玻璃纤维素膜平铺浸泡入金标抗体悬浮液中，取出37℃过夜烘烤，剪裁成18mm*300mm的长条，即为猝灭抗体结合垫。

2、荧光反应膜的制备

检测区t区的制备：用150mmpbs将黄曲霉b1抗原稀释5~10倍，用作t区的划膜液；用0.1~1mmpbs包被液将羊抗鼠二抗稀释10倍，用作c区的划膜液。在荧光反应膜上划膜，划膜量为0.7μl/cm，t区、c区的间距为2~4mm。

3、黄曲霉b1荧光定量检测卡的组装

样品垫、猝灭抗体结合垫、荧光反应膜和吸水垫依次黏贴在背板上，荧光反应膜位于背板的中央，荧光反应膜上设有包被有黄曲霉b1抗原的检测区t区和包被ⅱ抗的质控区c区，背板的一端端头为样品垫，另一端端头为吸水垫，荧光反应膜两端分别与吸水垫和猝灭抗体结合垫相互交叠连接，在猝灭抗体结合垫上压有样品垫。

背板为pvc胶板，样品垫为玻璃纤维棉，荧光反应膜为事先固定有荧光供体的硝酸纤维素膜，吸水垫为吸水纸。

实施例2：黄曲霉b1荧光定量检测卡的应用

一、样品的制备

1、空白样品：谷物、饲料

将待检样本研碎成粉末（过20目筛）；称取1.00±0.05g粉碎后样品于10ml离心管中；加入4ml样品提取液（样品提取液：70ml甲醇和30ml去离子水，充分混匀），剧烈涡动5min，4000g，离心5min；取50μl处理好的样本上清液，加入到1ml样品稀释液（0.01mpbs）中混匀。

2、添加样品：向空白样品加入黄曲霉毒素b1标准品至所需浓度。

二、最低检测限测定

取20份空白谷物、饲料样品，使用黄曲霉毒素b1荧光定量检测卡进行检测，计算出其平均值，再加上3倍标准差，即为最低检测限。

表1空白样品测定结果统计表（µg/kg）

结果表明，结果表明，谷物中黄曲霉毒素b1的最低检出限为1.98µg/kg，饲料中黄曲霉毒素b1的最低检出限为1.94µg/kg，为保障产品的稳定性，可认为黄曲霉毒素b1荧光定量检测卡在谷物、饲料中检测限为2µg/kg。

三、准确度和精密度的测定

准确度是指测定值与真实值的符合程度，取空白谷物、饲料样品按2µg/kg、4µg/kg黄曲霉毒素b1标准品进行添加，每个添加5个平行，用3个批次的检测卡测定。结果见表3。

表2准确度和精密度

结果表明，所有样品各添加浓度的回收率均在90.51～112.75%之间。各添加浓度的批内、批间变异系数均低于15%。

四、与仪器方法比较

用黄曲霉毒素b1荧光定量检测卡和仪器法（高效液相色谱串联质谱法）分别对50份谷物、饲料盲样进行测定，比较测定结果，结果见表3-4，二者的符合率为100%。

表3与仪器方法比较结果（成品饲料）µg/kg

表4与仪器方法比较结果（粕类）µg/kg

结果表明，基于上述方法制备黄曲霉毒素b1荧光定量检测卡检测谷物、饲料的最低检测限为2µg/kg，且批内与批间精密度均较好，检测结果准确度、灵敏度高、使用简便，因此，利用本发明提供的黄曲霉毒素b1荧光定量检测卡能够提供更为准确有效的检测相关信息。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。