本发明属于植物组织切片技术领域，具体涉及一种芍药根茎组织的徒手切片方法及其应用。
背景技术
中国是世界芍药属的起源中心之一，其在我国具有悠久的栽培和应用历史，其花大艳美，多为著名的药用观赏植物，深受我国及世界人民的喜爱。肉质根是芍药属植物的物质储存中心，不仅为植物的正常生长和发育提供强大的能量供给，也是其药用成分提取的主要来源；茎的形成和发育的状况直接关系开花状态的好坏，是观赏性状得以形成的基础，对开花的数量、质量及产量等都有直接影响。
芍药属植物种类繁多，地域分布差异较大，不同种及种内不同品种间的根茎的形态及结构存在较大的差异，因而芍药属植物的根茎结构解剖研究在植物系统分类、生长发育、栽培繁殖、花期调控和抗逆研究等方面具有重要的理论价值和现实意义。
传统上，对芍药属植物的根茎解剖研究较少，研究方法主要是石蜡切片法。同时，芍药属植物的根茎特性受发育时期影响较大，同时石蜡切片法对实验条件要求较为严苛，试验过程复杂繁琐，从材料固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片及染色等需要经历一个较长的实验周期，其中每个环节都直接影响最终的实验效果，难以进行大规模直接推广的应用，需要根据材料进行实验条件的摸索，实际应用难度较大；同时，其需要使用二甲苯等有毒试剂进行透明及脱蜡处理，目前虽然已有相关无毒试剂替代，但是实验周期及成本仍然较高，效率仍有待提高。
对于科研工作者来说，好的切片方法的关键在于：1、切片能清晰、真实地反映实物；2、方法具有通用性，不受品种及发育阶段差异的限制；3、节省时间和经济成本、操作简单、环保、高效。
现有的切片方法不能完全满足上述条件，因而表现出一定的不足。综上所述，建立一种操作过程简单易学且绿色环保，所获得的图谱清晰且立体感强，能对不同发育时期的根茎组织进行快速、高效的解剖观察的徒手切片方法，是本领域急需解决的关键技术问题。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供了一种芍药根茎组织的徒手切片方法及其应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种芍药根茎组织的徒手切片方法，包括以下步骤：
s1、获取洁净新鲜的芍药根茎组织，脱水至含水率为5-10％；
s2、用刀片对步骤s1得到的根茎组织沿垂直于其纵轴方向切削，获得厚度为20-30μm的切片；
s3、将步骤s2得到的切片置于无水乙醇中去除多余水分后，置于蒸馏水中完全展开，即得。
上述徒手切片方法直接利用芍药属植物茎、根茎和根的新鲜材料进行操作，实验操作条件容易摸索，省去大量传统方法所需材料固定时间及繁琐、严苛的实验流程，极大地缩短了实验周期，极大地提高了实验效率；且实验过程无需使用任何传统方法所使用的有毒试剂，适合在普通实验环境条件下操作，方法可移植性强，操作要求较低，适用性极强。所得图片清晰，结果可靠。
在上述技术方案中，步骤s2中，所述切削具体为：用左手大拇指和食指上下捏紧距离步骤s1得到的根茎组织端部切口约0.8-1.2cm处，使根茎组织纵向倾斜25-35°，将小拇指置于左上方实验台上作为支撑，右手大拇指和食指捏紧刀片端部，将刀片刀刃紧靠削平的根茎组织的端面，初切时用力将刀刃稍向下压，然后从右上方往左下方的方向连续迅速地平行切削。捏紧根茎组织端部切口及小拇指支撑台面利于切削时材料位置稳固而不发生位移，将根茎组织纵向倾斜25-35°，利于扩大视域范围，这个倾斜角利于切削时刀口朝大拇指和食指外侧，保证切削安全。
优选地，在上述技术方案中，步骤s1中，所述脱水具体为：当所述根茎组织为肉质根或嫩茎时，依次置于梯度浓度的乙醇溶液中浸泡脱水，优选地，所述乙醇溶液的梯度浓度为50％-70％-85％-95％-100％-100％，各梯度浓度的乙醇溶液中的脱水时间为0.8-1.2h；当所述根茎组织为盛花期茎秆时，置于无水乙醇中浸泡5-10min。幼嫩组织含水量多，梯度脱水利于保持细胞结构完整，且脱水较充分。盛花期茎秆含水量低，组织纤维发达，缩短脱水时间可保证含水量在合适范围，利于切削操作。
进一步优选地，在上述技术方案中，步骤s3中，将所述切片置于无水乙醇中的浸泡时间为1-2min。置于无水乙醇中浸泡能利于切片迅速展开，防止切片卷曲或发生褶皱以至于后续操作破坏组织结构完整性。
再进一步优选地，在上述技术方案中，步骤s3中，将所述切片置于蒸馏水中完全展开具体为：取洁净载玻片，滴加0.5-1ml蒸馏水，用显微镊将切片置于蒸馏水上，待所述切片完全展开后，缓慢加盖盖玻片完全覆盖所述切片。蒸馏水可防止切片过渡脱水而皱缩，利于组织切片在载玻片上合理调整位置；缓慢加盖盖玻片可防止产生气泡而影响观察。
又进一步优选地，在上述技术方案中，步骤s1中，所述根茎组织控制为5-7.5cm长的节段，有利于手指直接进行固定操作。
更进一步优选地，在上述技术方案中，所述步骤s1还包括，在脱水前将所述根茎组织的两端沿与其生长相垂直的方向削平。削平后利于两端同时脱水，既可缩短脱水时间，也方便根据需要随机挑选其中一端进行切削。
进一步优选地，在上述技术方案中，所述刀片为不锈钢双面刀片，用作切片时将刀片对半折断。该不锈钢双面刀片质地薄，韧性好，不易腐蚀，非常利于制作切片。
再进一步优选地，在上述技术方案中，步骤s1中，所述根茎组织选自不同发育时期正常生长的芍药肉质根和茎秆，取样时将所述根茎组织冲洗干净后放入含有吸水纸的自封袋中并置于冰上保存，以保证材料鲜嫩及组织完整。
本发明还提供了一种所述徒手切片方法的应用，即将所述切片置于显微镜下进行观察，拍照，所述拍照在切片完成后的15min内完成，若因放置时间过长而产生气泡，则可于盖玻片一侧滴少量蒸馏水以去除之。
本发明的优点：
本发明所提供的徒手切片方法操作简单，切片效率高，成本低廉，能彻底解决现有石蜡切片方法实验条件严苛、操作过程复杂、使用有毒试剂及实验投入的时间和经费较大等问题；且所用工具简单易得，价格低廉且不需要使用有毒试剂，绿色环保，应用广泛，为提高研究效率及为相关的植物解剖切片标准化操作提供了依据，理论和实际意义重大。
附图说明
图1为本发明实施例中的伊藤芍药‘goingbanana’茎的解剖结构；
图2为本发明实施例中的牡丹嫩茎的解剖结构；
图3为本发明实施例中的芍药‘fenyunu’茎的解剖结构；
图4为本发明实施例中的芍药‘fenyunu’根茎的解剖结构；
图5为本发明实施例中的芍药‘dafugui’茎的解剖结构；
图6为本发明实施例中的芍药‘dafugui’根茎的解剖结构；
图7为本发明实施例中的芍药‘dafugui’根的解剖结构；
图8为本发明实施例中的芍药‘coralsunset’茎的解剖结构。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
于4月底至5月中旬，对种植在国家花卉工程中心小汤山种质资源圃(北京，昌平区，小汤山镇)的芍药、伊藤芍药及牡丹植株的地下肉质根、茎及根茎进行观察取样，此时芍药、伊藤芍药及牡丹处于开花期。
用不锈钢叉将芍药整株起苗，清除肉质根及根茎周围的泥土及杂物，然后选取直径0.5-1cm左右的肉质根及根茎，用解剖刀将其完整切下，清水冲洗干净后置于装有浸水吸水纸(吸水纸的含水量以手捏不滴水为宜)的塑料自封袋中；从当年生茎基部截取牡丹、芍药及伊藤芍药茎段，去除花蕾和部分枝叶后置于装有吸水纸的塑料自封袋中。所有材料置于冰盒中存放，带至实验室备用。
本实施例提供了一种上述芍药根茎组织的徒手切片方法，具体包括以下步骤：
s1、将所取的根、茎及根茎从自封袋中取出，再次用清水处理后截成5cm左右的节段，将两端削平后置于50％无水乙醇溶液中处理1h，然后按照70％-85％-95％-100％-100％浓度乙醇进行梯度脱水处理，每级梯度处理1h，对于茎的解剖，根据材料软硬程度合理安排脱水时间，一般越嫩的材料脱水时间可适当延长，盛花期的茎秆则可直接进行切片；
s2、将脱水后的材料取出，左手拇指和食指上下捏紧距切口约1cm处，使根纵向倾斜约30°，小指及手腕置于左上方实验台上，以作支撑，右手拇指和食指捏紧刀片端部，然后将刀片刀刃紧靠削平的根、茎截面，初切时稍用力将刀刃稍向下压，然后按照从右上方至左下方的方向进行连续迅速平行切削，切削动作需连贯，不可中途停顿；
上述切片过程中，一般左手拇指和食指固定材料，右手固定刀片，也可根据个人手性偏好进行选择，此外，在切片的过程中，可适当转动材料，以寻求最合适的切片角度；
s3、将切削下来的薄片置于盛有无水乙醇的培养皿中1分钟以上，然后取出干净的载玻片，滴少量(0.5-1ml)蒸馏水，用显微镊小心将切好的薄片置于水滴上，使其完全伸展，将盖玻片一侧先接触水滴，待一侧与水面完全接触后缓慢放下，使材料完全覆盖，即得。
本发明实施例还提供了一种所述徒手切片方法的应用，即：将所述所得切片置于leica体式显微镜(leicadfc500)下进行观察，拍照，所述拍照在切片完成后的15min内完成。摄像头拍照参数设置可参考：曝光：40％；饱和度：1.2；伽马：1.0，也可根据实际需要进行调整。
如图1-8所示分别为各不同品种的不同根茎组织的解剖图片，从图中可以清晰地看出各根茎组织的结构，从而进一步证实了本发明所述徒手切片方法的可行性和可靠性。
最后，以上仅为本发明的较佳实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。