相关申请的交叉引用
本申请要求2013年3月14日提交的美国临时专利申请号61/781,841的优先权，所述申请通过引用全文并入本文。
政府支持的声明
本发明根据国家健康研究所授予的合同hg000205和国家癌症研究所授予的合同u54ca143803在政府的支持下完成。政府在本发明中享有特定权利。
对序列表、计算机程序或光盘的引用
本申请包含序列表，所述序列表已作为ascii文本文件提交，并通过引用全文并入本文。该文本文件在2014年2月18日创建，命名为“482_35_1_pct_seq_list.txt”，且大小为717字节。
发明背景
发明领域
本发明涉及用于单细胞的细胞内含物特别是线粒体dna的提取的纳米装置领域。
相关技术
以下呈现了关于本发明的某些方面的背景信息，因为它们可能涉及在详述中被引用但不必然被详细描述的技术特征。即，本发明中使用的个别组合物或方法可在以下讨论的出版物和专利中被更为详细地描述，所述出版物和专利可为本领域技术人员提供进一步指导以制备或使用要求权利的本发明的某些方面。下文的讨论不应被理解为承认描述的专利或出版物的相关性或现有技术作用。
人体中的生理和病理过程由动态微环境范围内的复杂的细胞-细胞相互作用控制。细胞生物分子分析传统上在一个克隆群体的细胞行为相同的假设下进行。该假设并非来源于实验证据，而是由于缺乏能够分析单个细胞的工具。此外，在单细胞水平上动态检测表型(即，基因表达、蛋白质活性、离子波动、信号传导)的能力是理解复杂环境中的细胞行为的关键(1-4)。
1990年，jameseberwine小组使用玻璃微量移液管分离了培养物中的单细胞，并证实了从所述细胞提取的rna能够被扩增并分析(5)。该实验开创了单细胞生物学领域的先河，并且eberwine小组成功地将该技术应用于理解神经元运作的分子基础(6)。在过去的20年中，生物分子分析随着高通量测序的发展而高速发展，所述高通量测序现在允许研究人员在单个读出(readout)中获得一个细胞中的活性基因的集群(collection)(7)。然而，单细胞的初始捕获仍然是主要技术问题(1)。自从eberwine成功使用玻璃微量移液管以来，科学家们已经使用多种技术分离单细胞，所述多种技术从酶促消化(其从组织中释放细胞)到激光显微切割(其从组织切片中切出完整细胞的同质群体)。然而，这些方法并不能在细胞的天然环境中检查所述细胞，或同最初的微量移液管一样，它们被限制在探测分离的细胞上(8)。
作为外科手术工具的纳米装置
因为纳米级装置用于高空间和时间分辨率研究的潜力，它们是理想的单细胞外科手术工具(9-10)。目前两个小组独立地开发了用于单细胞分析的细胞纳米内窥镜。singhal等人(11)将碳纳米管附接在玻璃微量移液管的最尖端，并显示其用于在低至单个细胞器的水平上探询(interrogate)细胞、转运液体以及进行光学和电化学诊断的潜力。similarlyyan等人(12)开发了附接至光学纤维的尖端的纳米线波导，其能够引导可见光进入活的哺乳动物细胞的细胞内区室中，并检测来自亚细胞区域的光学信号。圆筒形状的这些纳米内窥镜允许探测细胞内部深处的细胞器，但是这些技术缺乏任何自动操作能力；这些内窥镜被人工放置到细胞中，不允许进行需要大量样品分析的那些复杂生物问题的研究。
这些纳米内窥镜与扫描探针技术的整合可克服该限制，有可能允许自动操作和高通量分析。2003年，osada和同事将原子力显微镜(afm)尖端插入活细胞中以提取mrna(13)。用pcr技术分析所述mrna以验证提取方案(14)。最近，wickramasinghe小组通过用铂包被afm尖端优化了该方法，这允许通过介电泳提取mrna分子。wichramasinghe的技术已经成功地与标准测定技术结合以检测乳腺癌细胞中的rna分子(15-16)。
操作并分析单细胞是理解控制细胞的功能和命运的过程的下一个新领域。随着高通量测序的引入，现在可能获得单细胞内部所有活性基因的集群，但是细胞遗传物质的初始捕获仍然是主要挑战。此外，目前用于单细胞操作的方法常常仅能够检测一类分析物。
具体专利和出版物
seger等人,“voltagecontrollednano-injectionsystemforsingle-cellsurgery,”nanoscale4(19):5843-5846(2012)，公开了开发一种作为无标签感测平台的纳米移液管(20-24)和改造icm以允许培养物中的单细胞的多成分注射(25)。
laforge等人,“electrochemicalattosyringe，”proceedingsofthenationalacademyofsciences104(29):11895-11900(2007)，公开了一种基于玻璃纳米移液管的电化学阿注射器(attosyringe)，以通过电润湿作用将微量液体递送到活细胞中(26)。
mirkin等人,wo2008/054488,2008年5月8日公布,标题为“electrochemicalattosyringeanditsuseasanelectrochemicalnanopumpdriver”，公开了一种填充有机溶剂的纳米移液管和驱动水性溶液的抽吸和递送的外部电压。
seger等人,us2012/0225435,2012年9月6日公布,本申请具有至少一个共同发明人并具有同一代理人,标题为“nanopipetteapparatusformanipulatingcells”，公开了与xyz控制器和纳米移液管孔道中的电压差的电子控制元件相结合的纳米移液管，以高通量方式将物质电渗注射到细胞中并对细胞具有最小损害。该申请中未公开从细胞中提取物质和从纳米移液管中射出后分析所述物质，也未公开以天然的形式取出生物物质用于进一步分析。
seger等人,“voltagecontrollednano-injectionsystemforsingle-cellsurgery”,nanoscale4:19,2012年9月28日,第5843-6页，包含类似于上文引用的pg出版物的公开内容。
pavel等人,us20110131690,2011年6月2日公布,标题为“scanningionconductancemicroscopy”，公开了扫描离子电导显微术及其在软表面和界面的研究中的用途，所述软表面和界面包括细胞和卷曲的基质结构的那些。如其中所公开的，扫描离子电导显微术(sicm)是扫描探针显微术(spm)的一种形式，其允许无论如何都不会有任何接触或力相互作用的情况下并且在受试者的正常液体环境中对软表面进行高分辨率成像。
发明概述
以下的概述不预期包括本发明的全部特征和方面，其也不暗示本发明必须包括该概述中讨论的所有特征和方面。
在某些方面，本发明涉及一种装置，所述装置包括纳米移液管，所述纳米移液管包括尖端；和第一电极，所述第一电极与纳米移液管的内部中的或邻近纳米移液管内部的第一电解质接触并被布置为与电流检测电路中的放大器输入连接；以及第二电极，所述第二电极与纳米移液管和细胞外部的包含第二电解质的溶液接触并被布置为与第一电极和电流检测电路连接，其中第一电极和第二电极允许离子电流在所述电极之间流通并通过尖端的纳米级开口。在一些方面，纳米移液管由石英制成，并可在尖端具有直径为10-1000nm、优选大约50-200nm的孔道。
此外，纳米移液管装置包括附接至纳米移液管的xyz控制器，用于实现纳米移液管以亚微米x和y步长的机械运动，以及实现所述纳米移液管在z方向上接近和远离细胞的运动，所述xyz控制器还具有用于根据用户定义的控制来控制所述机械运动的电子控制元件。在一些方面，纳米移液管的z方向由第一和第二电极之间的离子电流产生的信号控制。将这样的装置连接至能够以高分辨率对细胞表面成像的装置，例如扫描离子电导显微镜(sicm)。
这样的装置在本文中被称为“纳米移液管sicm”装置，并且可包括用于控制电压的电路，如上文提及的us2012/0225435中另外描述的。
在本发明的某些方面，纳米移液管装置中的第一电极为四(4-氯苯基)硼酸银(silvertetrakis(4-chlorophenyl)borate)(agtbaci)。
在本发明的某些方面，第一电解质溶液是包含离子物质例如四(4-氯苯基)硼酸四己基铵(tetrahexylammoniumtetrakis(4-chlorophenyl)borate)(thatpbcl)的疏水性液体例如1-2二氯乙烷。
在某些方面，本发明还包括用于控制纳米移液管sicm装置以实施从单细胞的细胞质或细胞器中提取预选择的生物物质以分析所述生物物质的方法。该方法在本文中被称为“纳米活组织检查”。与常规活组织检查不同，本发明的纳米活组织检查在单细胞内进行；细胞优选为真核细胞，优选已从宿主生物体中提取并被放置于与显微镜一起使用的样品台上的动物细胞。细胞可以是已经通过常规活组织检查提取的细胞，或者其可通过其他方法例如血液抽取、骨髓穿刺等离体获得。可在纳米活组织检查前离体培养细胞一段时间。提取的物质可在不依赖于亲和化合物或化学处理的情况下获得。物质以其天然状态被获得并且不会引入任何基于免疫反应性、序列同一性等的选择偏向。
在本发明的某些方面，如下控制纳米移液管装置：
1.将纳米移液管提供有液体有机溶剂和内部电极，所述内部电极连接至另一电极，所述另一电极在纳米移液管外部但在接触待分析的细胞的溶液(培养基)中。
2.用正偏压(例如200mv)极化内部电极，以防止培养基流入细胞中。
3.通过测量离子电导将纳米移液管引导至细胞表面，并且，当纳米移液管刚好在细胞表面上时，将其快速降低以刺入细胞。该步骤可通过光学显微术或允许对所感兴趣的细胞组分成像的其他显微术引导。例如，线粒体的长度通常为约1-10μm，并且可在光学显微镜中观察到。可对细胞进行染色以可视化鉴定所选择的线粒体。
4.纳米移液管尖端在细胞内部之后，将纳米移液管偏压从正偏压转换为负偏压(例如-500mv或-200至-1000mv的范围)，持续预定的时间，以引起靶生物物质吸入纳米移液管。“靶细胞内含物”，即，生物物质，通过待收集的分子在细胞中的物理位置和性质被靶向，所述待收集的分子例如基因组dna、线粒体dna、mrna、rrna、细胞质蛋白质、核蛋白质、溶酶体蛋白质或膜、多糖等。
5.步骤4之后转换为正电压，所述正电压例如200mv或200mv至500mv的范围，其终止了吸入并且不允许纳米移液管的内含物流出。
6.将纳米移液管快速升高，从细胞和周围培养基中移出，并移动至转移容器中，其中电压再次被转换为正值(例如+1v或500至1000mv的范围)以引起抽吸的内含物流出至样品容器中用于分析。样品容器可包含核酸储存缓冲液，诸如例如不含核酸酶的pbs溶液，或例如在us2012/0171685中描述的多种缓冲液。
在本发明的某些方面，分析来自步骤6的抽吸的内含物以确定或鉴定样品中dna的碱基序列。这可通过多种方法包括实时pcr或下一代测序(ngs)进行。
因此，上文描述的装置可被表征为用于从单细胞提取细胞内含物的装置，所述装置包括：纳米移液管，所述纳米移液管安装在xyz控制器上，并且包含适于与纳米移液管内部的第一疏水性电解质溶液一起使用的第一电极；纳米移液管外部的第二电极，所述第二电极被布置并适于接触与细胞外部接触的第二不同电解质溶液；电流检测电路和电压控制电路，所述电流检测电路检测电极之间的离子电流，并且所述电压控制电路被构造以通过将第一电极和第二电极之间的电压反向来控制液体在预定的时间流入和流出纳米移液管。
还可被配置的装置的多个实施方案包括其中将所述xyz控制器附接至纳米移液管用于实现纳米移液管以亚微米x和y步长的机械运动，以及实现所述纳米移液管在z方向上接近或远离细胞的运动，所述xyz控制器还具有用于根据用户定义的控制来控制所述机械运动的电子控制元件，并且当所述xyz控制器已经将纳米移液管的尖端置于细胞中时所述电压控制元件将电压反向。还可配置装置的多个实施方案，其中纳米移液管的z方向由第一和第二电极之间的离子电流产生的信号控制。还可配置装置的多个实施方案，其中第一电极为四(4-氯苯基)硼酸银(agtbaci)。还可配置装置的多个实施方案，其中第一电解质溶液包含疏水性液体例如1-2二氯乙烷；以及离子物质，所述离子物质包括四(4-氯苯基)硼酸四己基铵(thatpbcl)。还可配置装置的多个实施方案，其中纳米移液管为石英。
上文的装置可包括根据以下步骤操作装置的程序化指令，所述步骤包括：(a)提供第一偏压，以将第一电解质保持在纳米移液管中；(b)提供第二不同偏压，以引起物质从细胞内的吸入；以及(c)提供第三不同偏压，以引起液体从纳米移液管的流出。
还可将装置的多个实施方案配置为包括响应离子电流的改变而操作装置的一组程序化指令，所述离子电流由电流检测电路感测。
在本发明的某些方面，通过本发明的方法以天然形式提取的来自细胞的细胞内含物包括细胞器或核酸。在一些方面，提取的核酸包括基因组dna、rna(包括mrna和来自核糖体的rrna)或线粒体dna。在其他方面，细胞器是线粒体。另外，人们可提取细胞的细胞质的部分或含有蛋白质、小分子、细胞过程的代谢物等的囊泡。
在某些方面，本发明还涉及一种用于从细胞中机械提取细胞内含物的方法，所述方法包括：(a)制备包含具有用于提取的靶细胞内含物的细胞的溶液；(b)使如本文描述的sicm纳米移液管运转以通过感测离子电流而靠近细胞；(c)使用纳米移液管穿透细胞表面；(d)调整离子电流以产生持续预定的时间的负偏压和电压，以引起将靶细胞内含物提取到纳米移液管中的受控制的吸入；和(e)进一步调整离子电流以产生正偏压，以防止提取的内含物离开纳米移液管且进一步地，将纳米移液管的内含物排出到容器中用于进一步分析。
所述方法的多个实施方案还可包括用于从单个细胞提取靶细胞内含物，包括：制备包含具有用于提取的靶细胞内含物的至少一个细胞的溶液；提供纳米移液管sicm装置，所述纳米移液管sicm装置具有xyz控制器、用于产生偏压的内部电极和外部电极，并且还具有纳米移液管，所述纳米移液管包含疏水性溶液并具有尖端；操作纳米移液管sicm装置以通过感测通过尖端的离子电流的降低来靠近所述一个细胞。
所述方法的多个实施方案还可包括在内部电极和外部电极之间产生正电压，以防止在插入细胞的过程中液体进入纳米移液管中的疏水性溶液中；放置纳米移液管以穿透预定的细胞位置并将其插入细胞中；调整电压以引起纳米移液管吸入并提取靶细胞内含物；进一步调整电压以防止提取的靶细胞内含物离开纳米移液管；和进一步调整电压以引起提取的靶细胞内含物流出至样品容器。
所述方法的多个实施方案还可包括，其中提取的靶细胞内含物包含核酸，所述核酸包含dna或rna，和/或可包含线粒体dna。
所述方法的多个实施方案还可包括，其中电压为以下的一种或更多种的步骤：(a)-100至-1000mv，以引起靶细胞内含物吸入纳米移液管；(b)100-500mv，以终止吸入并防止从纳米移液管的流出；和(c)+0.5至2v，以引起提取的靶细胞内含物的流出。所述方法的多个实施方案还可包括其中步骤(a)中的吸入持续1和5秒之间的步骤。
所述方法的多个实施方案还可包括其中流出是进入包含核酸储存缓冲液的样品容器的步骤。所述方法的多个实施方案还可包括其中提取的靶细胞内含物是来自单个线粒体的dna的步骤以及还包括确定线粒体dna序列的部分的步骤。
所述方法的多个实施方案还可包括从单个细胞提取细胞内含物的方法，所述方法包括：(a)提供纳米移液管，所述纳米移液管具有xyz控制器、用于产生偏压的内部电极和外部电极，并且还具有纳米移液管，所述纳米移液管包含用于刺入单细胞的尖端；(b)操作纳米移液管装置以引起纳米移液管吸入并提取细胞的靶细胞内含物；(c)进一步调整电压，以防止提取的靶细胞内含物离开纳米移液管；(d)进一步调整电压以引起提取的靶细胞内含物流出至样品容器中；和(e)通过以下的一项或两项分析提取的靶细胞内含物：(i)分析来自提取的靶细胞内含物的mrna；和(ii)分析来自提取的靶细胞内含物的一种或更多种所选择的蛋白质。
所述方法的多个实施方案还可包括其中所述分析mrna包括分析来自细胞的至少500pg的mrna的步骤，或其中所述分析mrna包括分析细胞中至少90％的mrna序列的步骤。
所述方法的多个实施方案还可包括分析蛋白质，包括检测特定蛋白质的超灵敏测定，例如免疫测定，例如邻位连接方法。分析可包括：分析蛋白质种类，所述分析蛋白质种类包括分析egfr、mkk1、erk1/2、jak、ap1/jun和stat中的至少一种；区分磷酸化的蛋白质与未磷酸化的同一蛋白质；在不同的时间对同一细胞进行多次分析；区分磷酸化的蛋白质与未磷酸化的同一蛋白质；和/或区分具有翻译后修饰的蛋白质与未被如此修饰的同一蛋白质。
附图说明
图1a-1d是示出了单细胞纳米活组织检查和单细胞的内含物细胞器或细胞质的转移用于抽吸后分析的一组图。图1a示出了纳米移液管的尖端自动靠近细胞表面，其中纳米移液管的尖端在浸浴细胞的液体的表面之下；图1b示出了尖端穿入细胞胞质中，然后受控制地抽吸细胞质物质；图1c示出了纳米移液管的撤回；以及图1d示出了将活组织检查的物质递送到管中用于分析。未示出培养基中的外部电极。
图2是示出了纳米移液管中电润湿的结果的迹线图。在活组织检查过程中，以+100mv对纳米移液管加偏压，然后转换为-500mv，且然后转换为+500mv。所得曲线是15个“抽吸-排出”循环的结果的平均值，并且示出了在不同电压状态下离子电流的变化。
图3是示出了单细胞纳米活组织检查过程中的计时电流分析的迹线图。以+100mv对纳米移液管加偏压，以防止任何水性溶液进入纳米移液管中。当偏压转换为-500mv时，离子电流由于细胞质进入纳米移液管的管中而增加。
图4是用
图5是示出了通过靶向来自hela细胞的gfprna的qpcr的活组织检查后的分析的线图，示出了来自～1,000个细胞裂解物的总rna的阳性对照(定量循环，cq20)、来自单细胞的活组织检查物(定量循环cq30)以及作为阴性对照的水(定量循环cq33)。
图6是示出了由从～1000个gfp-hela细胞的裂解物提取的总rna组成的阳性对照(圆形)的线图。纳米活组织检查(方框)代表以单细胞的标准纳米活组织检查的内含物开始的qpcr。阴性对照(三角形)代表5个样品，4个纳米活组织检查样品遵循我们的标准方案但在细胞穿入之后不施加-500mv(因此缺少抽吸步骤)，而第五个样品使用水作为起始物质。与我们的纳米活组织检查样品和阳性对照相比，未施加电压的4个样品和使用水的样品全部导致阴性扩增。
图7是示出了通过qpcr进行的阳性对照和5个阴性对照样品(样品#1-#5)的活组织检查后的分析的线图。
图8是用sybr金染色的凝胶图像，用于线粒体dna的片段大小确定(预期大小为～7000个碱基对)和聚合酶链式反应(pcr)扩增。泳道1-5，对5个单独的人bj成纤维细胞进行的线粒体活组织检查。样品泳道6是未进行活组织检查的阴性对照(无输入dna)，并且泳道7是阳性对照(线粒体pcr产物作为输入物质)。
图9a-9b是在ucsc基因组浏览器中显示的一组图，示出了抽吸物的rna测序的读段(read)覆盖。基因组位置沿着x轴显示，且y轴代表覆盖深度。图9a示出了基因pabpc1中可变的3’外显子使用。整体基因预测在底部显示，其中线代表内含子，且矩形代表外显子。这些基因预测在反向链(reversestrand)上，并以3’至5’的方向显示。在m3和m7对比m8中观察到基因pabpc1中的可变的3’外显子使用。m8示出了在较长同种型的3’区域上的覆盖，而m3和m7示出了在较短同种型上的覆盖。图9b示出了读段覆盖延伸跨越基因mccc2的全长，证实了从通过纳米活组织检查分离的转录物产生全长cdna的可行性。基因mccc2以5’至3’的方向显示在底部。
图10是描绘了从来自单细胞的两个线粒体抽吸物以及从细胞群体提取的dna获得的测序结果的图。测序结果证实了抽吸物中可变的异质性频率的保守性。将估计频率在5％和99％之间的异质性变体显示为圆圈，其中圆圈的面积与观察到的频率成比例。变体的核苷酸由圆圈附近和圆圈内部的字母‘a’、‘c’、‘t’或‘g’指示。14713a->t变体示出了跨越抽吸物和群体的相似频率；而16278c->t变体示出了抽吸物中的异质性频率的更高变化性。低频率变体还见于两个抽吸物中，但是未见于群体中。
图11是使用本发明的纳米移液管方法的单细胞的蛋白质分析的示意图，其中对特定蛋白进行了定量。
优选实施方案的详述
定义
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料都可用于实践或测试本发明，但描述了优选的方法和材料。一般来说，与细胞和分子生物学以及化学结合使用的术语以及细胞和分子生物学以及化学的技术是本领域中公知的并常用的那些。某些未具体限定的实验技术通常根据本领域公知的常规方法以及如遍及本说明书引用并讨论的多个一般性和更具体的参考文献中描述的进行。为了清楚的目的，在下文中定义了以下术语。
术语“电润湿”在本文中以其常规含义使用，是指采用外加电场来移动液滴和液膜的作用。其在本文中用于当施加负电压时引起细胞溶液流入纳米移液管中以及当将偏压反向时引起流出。作为一个实例，laforge和同事开发了纳米移液管中的电润湿，以将荧光染料注射到培养物中的活细胞中(26)。
本文使用的术语“离子电导显微术(icm)”或“扫描离子电导显微术(sicm)”是指扫描探针技术，其具有以高空间(17)和时间分辨率(18)对活细胞成像的能力。icm依赖于填充有电解质溶液的玻璃纳米移液管，所述电解质溶液偏向于产生通过纳米移液管孔的离子流。然后在表面上对纳米移液管进行扫描，并且测量的离子电流大小的变化反应了被研究的样品的形貌的变化(18-19)。如果跨越样品对尖端进行扫描，就可渲染出图像(28)。
术语“纳米移液管”在本文中以其常规含义使用，是指中空自支撑(self-supporting)的惰性非生物结构，具有纳米级的圆锥形尖端开口(即纳米孔)，所述纳米级即0.05nm至约500nm，优选约(+或-20％)50nm。中空结构可以是玻璃或石英，并适用于将通过纳米孔开口的液体保持在中空结构的内部或纳米孔的一侧。选择或改造纳米移液管的内部以将分析物的非特异性结合最小化。将内部的大小制成允许插入与纳米移液管中的液体接触的电极。纳米移液管优选通过激光牵拉玻璃或石英毛细管制成。纳米移液管具有大约10-100nm的内径，大约200-800nm的外径，以及约10μm的典型长度。这些尺寸的大小被制作为适合具体应用，并且纳米孔大小的控制是重要考虑。“多管式纳米移液管(multibarrellednanopipette)”是具有通常共享公用壁的两个或更多个平行孔道的纳米移液管。孔道是同轴的，通常是放射状分隔开的，但是可以是同心的。它们可从市售可得的多孔道毛细管制成。
术语“显微操作器”或“xyz控制器”是指在三个维度移动的机械装置，所述三个维度被称为通常是平面的x和y维度，以及通常是垂直的z方向。已知xyz控制器用于多种微米级的应用，例如原子探针显微镜；关于示例性xyz控制器的进一步详情参见例如kajimura等人的us5,394,741，标题为“atomicprobemicroscope”。
术语“电流检测电路”或“控制电压的电路”是指包括可控放大器和灵敏电压电流检测器的已知电子电路和装置。它们可包括用于检测在10-10000皮安培的基线电流的基础上大约1-10皮安培的电流变化，并且进一步响应此类变化而改变电压和/或电流的任何灵敏的装置。该术语还指时间响应并且相对不依赖于温度的电路或允许待补偿的温度中的变化的电路。它应该在其中提供已知电压的电路中具有输入。灵敏的检测电路是已知的，包括电压钳放大器和互阻抗放大器。
术语纳米移液管sicm装置意指使用纳米移液管作为探针的扫描离子显微镜装置。其具有控制电路，所述控制电路有效地设置内部偏压用于将液体保持在纳米移液管孔道中、向纳米移液管孔道中输入液体和从纳米移液管孔道中排出液体。偏压由纳米移液管孔道中的电解质溶液中的内部电极和在纳米移液管外部但在运行过程中与纳米移液管接触的导电溶液中的外部电极设置。术语“偏”压以一般含义使用，但优选为固定的dc电压。
术语“超灵敏测定”包括如下文定义的pla和能够检测蛋白质和其他细胞非核大分子特别是蛋白质的测定。超灵敏是指基于单细胞的内含物获得有意义的结果(蛋白质修饰和/或定量)的能力。这特别适用于细胞质蛋白质和分泌的蛋白质。超灵敏测定可检测低至飞克的量的特定蛋白质。
超灵敏免疫测定的实例包括“widerangeluminescentimmunoassays”us20130273667，“ultra-sensitivedetectionofmoleculesorparticlesusingbeadsorothercaptureobjects”us20120289428和超灵敏酶促放射免疫测定方法us4289748a。
术语“翻译后修饰”是指已经通过官能团或蛋白质的共价添加、调节亚基的蛋白质水解裂解或完整蛋白质的降解而被修饰的蛋白质。这些修饰包括磷酸化、糖基化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化、脂化和蛋白质水解，并影响正常细胞生物学和发病机理的几乎所有方面。尚未以这种方式修饰的蛋白质可称为未修饰的蛋白质。
术语“pla”意指如本文中描述的邻位连接测定，其中抗体结合至在一定距离内在空间上相邻的表位，所述距离允许附接至抗体的寡核苷酸相互作用。该寡核苷酸相互作用使得能够进行基于多核苷酸检测的灵敏检测，例如pcr。为了进一步阐述，给出了pla的实例，hej,eversdl,o'learytj.等，immunoliposome-pcr:agenericultrasensitivequantitativeantigendetectionsystem.jnanobiotechnology.jnanobiotechnology.2012；10:26和ulflandegren的“ultrasensitiveimmunoassays”，us6878515。
术语“egfr”意指“表皮生长因子受体”，例如以uniprotq504u8(q504u8_human)进一步描述的人表皮生长因子受体。
术语“mkk1”意指map激酶skh1/pek1，例如uniprotq02750(mp2k1_human)。
术语“erk1/2”意指细胞外信号调节激酶，例如uniprotp27361(mk03_human)。
术语“jak”意指janus激酶2，例如uniproto60674(jak2_human)。
术语“ap1/jun”意指激活蛋白1(ap-1)家族，所述激活蛋白1(ap-1)是一种转录因子，该转录因子是一种包含属于c-fos、c-jun、atf和jdp家族的蛋白质的异二聚体蛋白质。ap-1(激活蛋白-1)转录因子，也被称为jun因子，是调节许多可诱导的基因反应的作用广泛的因子。一个实例是peli3，uniprotq8n2h9(peli3_human)，其激活ap1/jun和elk1。
术语“stat”意指信号转导子和激活子，其是被激活之前一直存在于细胞质中的转录潜伏的转录因子家族。七种哺乳动物stat在c末端附近具有保守的酪氨酸残基，所述酪氨酸残基被jak磷酸化。一个实例是uniprotp42226(stat6_human)。
综述
本文公开了用于使用整合到扫描离子电导显微镜(sicm)中的纳米移液管以从细胞中提取细胞内含物包括细胞器和细胞器内含物的系统的装置和方法。该技术可与单细胞测序技术(32)一起使用，以允许具有空间和时间信息的活组织中异质性的详细研究。目前的单细胞操作方法通常仅能够检测一类分析物，但是本文描述的纳米活组织检查平台可用于基因组学、蛋白质组学和代谢组学分析(33)。该技术可由包含程序化指令的计算机和实施本发明方法的以计算机可读形式体现的程序化指令实现。
整合的纳米移液管sicm装置
如下文进一步详细描述的制成纳米移液管，并整合到sicm装置中，所述sicm装置允许将纳米移液管自动置于在细胞上方几百纳米(25)。sicm装置以前被设计用于对软的非电导表面的形貌成像。参见，例如hansma,p.k.等人,thescanningion-conductancemicroscope.science,1989.243(4891):第641-643页。此类现有技术装置使用xyz扫描，z反馈和控制逻辑(z被认为是垂直于被扫描的表面的方向)。
简言之，一般的sicm配置由回填充有疏水性电解质溶液并且浸入电解槽中的纳米移液管组成。一个电极位于纳米移液管中，且地电极位于槽中距离一定距离处。当纳米移液管填充有机溶液并浸入水性溶液中时，在纳米移液管开口处形成液-液界面。如果随后施加电压通过该界面，那么就会产生能够引导水性溶液流入/流出纳米移液管(28)的力。离子电流还作为反馈信号以将纳米移液管的高度精确地控制在细胞表面上方的预定距离处。
在一些实施方案中，根据待提取的靶细胞内物质的大小来制作或调整纳米移液管的尖端。此外，尖端被设计为足够耐用且坚固以穿透细胞壁或膜。
此外，可将该装置的特征并入相关装置中，用于从单细胞提取目标对象，或用于测量单细胞中的分子结合。
细胞内提取物
如在图1a-1d中看出的，用于从细胞中提取细胞内含物的方法包括以以下步骤使用本文描述的纳米移液管装置：
1)靠近细胞表面(图1a)；可以观察到细胞具有核102和线粒体104。该步骤优选使用传感电路实现，所述传感电路检测纳米移液管尖端106向细胞表面的靠近。如在此描述的，这可在当沿着包含细胞的样品表面扫描尖端时通过检测通过纳米移液管尖端106的离子电流的变化来进行。浸浴细胞的液体的表面示为107。图1a表明移液管中的小的正偏压防止流入。
2)穿透细胞表面(图1b)；此时已经定位了靶细胞器，并且纳米移液管的尖端位于它的正上方。然后例如通过xyz操作器将它快速向下移动，以穿透外层细胞膜并且穿透细胞器的膜。可根据已知的细胞尺寸预先设定穿透的深度。例如，人淋巴细胞的直径可以为6-12μm的范围。典型的人细胞的直径为约10μm。成纤维细胞具有不同的形状和大小，并且呈活化形式和未活化形式。例如，细菌的大小通常为0.5至1.5μm的范围。图1b表明，移液管中的负偏压用于引起从细胞内的吸入。
3)抽吸(提取)靶细胞内物质(图1b)；此时纳米移液管偏压被转换为负电位，使得细胞物质进入纳米移液管。当填充有二氯乙烷(dce)的纳米移液管浸入水性溶液中时，由于dce的疏水特性而在纳米孔腔处形成液-液界面。施加电压通过该界面，会引起dce表面张力的变化。被称为电润湿的这种作用，当施加负电压时引起水性溶液流入纳米移液管，并且当将偏压反向时引起水性溶液流出。可使用其他疏水性溶剂，例如具有在水中的溶解度小于0.5g/110g的那些，例如在http://murov.info/orgsolvents.htm中列出的那些。
4)撤回纳米移液管(图1c)；此时，加偏压于纳米移液管至保持状态，直至离开浸浴细胞的液体；图1c示出了移液管中的保持电位，以防止流出；和
5)分析提取的物质(图1d)。此时，加偏压于纳米移液管至正态，以排出内含物。图1d示出了移液管中的强的正偏压，以引起流出至样品容器中。
使用之前，首先用包含电解质的疏水性液体填充纳米移液管，并将涂丝电极置于纳米移液管管内的电解质溶液中。再次重申，使用sicm或光学显微术以及能够控制纳米级移动的xyz控制器将纳米移液管的尖端置于靶细胞成分的上方。将其降低进入包围细胞的溶液中，所述溶液优选地包含第二电解质和生长培养基。在此，用正偏压将纳米移液管管中的电解质极化，以防止不想要的溶液流入管中。该偏压由纳米移液管管中的电极和包围细胞的培养基中的电极之间的电位差产生。如下文描述的，电压控制电路连接电极，并提供不同偏压，优选在计算机的控制下提供不同偏压。该偏压产生通过液-液界面的离子电流，其被用作例如由反馈放大器或膜片钳放大器布置物提供的反馈环路的输入。
施加电压通过该界面从而通过电润湿引起电解质表面张力的变化。电润湿涉及不可混合的液体之间的界面，所述不可混合的液体例如疏水性液体和亲水性(水性)液体。
可在纳米移液管孔道中使用其他非极性液体实施电润湿。为了识别这些，人们可参考例如maillard等，“twoliquidswettingandlowhysteresiswettingondielectricapplications,”langmuir25(11)6162-6167(2009)。
示例性非水性电解液为：含有0.01mol/l(或更高)四苯基硼酸四丁基铵(tba-tpb)电解质的硝基苯溶剂，或者含有0.01mol/l(或更高)tba-tpb的1,2-二氯乙烷溶剂。非水性电解液还可使用任一溶剂，但是将tba替换为另一四烷基化铵阳离子例如tea、四苯基铵等，来形成。
类似地，tba-tpb阴离子可更换为其他官能化的苯基硼酸盐，例如四[3,5-二(三氟甲基)苯基]硼酸盐，或甚至更换为简单的卤化物例如碘化物阴离子。本文列出的溶剂和电解质不提供非水性电解液的总表，但是至少一种示例性溶剂、至少一种示例性阳离子和至少一种示例性阴离子的任何组合可用于产生可适用于支持电润湿作用的非水性电解液。参见，monroe等人，“electrowettingdevicees,”wo2008/142378。
将实例中的纳米移液管填充包含10mm四(4-氯苯基)硼酸四己基铵(thatpbcl)的1-2二氯乙烷(dce)溶液。将其浸入pbs(磷酸盐缓冲盐水)槽中。在图2中，以+100mv对纳米移液管加偏压，以防止任何水性溶液流入纳米移液管孔道中。通过人工或自动化操作，将纳米移液管降低至待进行活组织检查的对象(在该情况下为细胞)的上方，直至检测到阈值离子电流。检测到特定阈值的离子电流之后，则以高速进一步降低纳米移液管，以发生细胞膜的穿透。在示例性的装置中，自定义编写的软件指导纳米移液管接近细胞，直至控制电路检测到离子电流的0.5％的降低。这指示向细胞表面的靠近。此时，软件终止靠近，并将纳米移液管快速降低1um以刺入细胞。
刺入细胞膜后，电路随后被转换为负偏压，允许控制细胞的细胞质中的细胞内含物抽吸到纳米移液管中。再次参照图2，当偏压转换为-500mv时，测量的离子电流增加，这是由于水性溶液进入纳米移液管的管中，所述水性溶液具有比初始填充纳米移液管的管的有机液体更高的电导。
接下来将偏压转换回至正偏压，终止细胞内含物吸入纳米移液管。正偏压足够强以防止已抽吸的内含物流出纳米移液管。再次，图2表明当电压转换为+500mv时，抽吸的水性溶液被排出，导致测量的离子电流减少，并提供细胞内含物样品。
然后使用已知的分子生物学技术分析从细胞中提取的细胞内含物。纳米活组织检查平台允许细胞器包括线粒体的取样，这对疾病例如癌症和神经退行性疾病的研究具有很大启示。
在本发明的一个实施方案中，将多管式纳米移液管与不同管中的至少两个电极一起使用。一个管可用于抽取细胞内含物，且另一个管可用于在同一操作过程中将物质注射到细胞中。还可使用多个管以在单次注射过程中在不同时间点收集不同样品。
细胞内含物：线粒体dna
从单细胞和线粒体中提取线粒体dna(mtdna)，并使用分子生物学技术进行分析。dna在没有任何种类的化学处理应用至细胞的情况下并且在未裂解细胞的情况下被提取。
mtdna是真核细胞的线粒体中存在的dna。线粒体是负责产生腺苷三磷酸(atp)的细胞供应的细胞器，所述腺苷三磷酸(atp)用作细胞能量来源。mtdna可以为单链，更常见的为双链，并且形状通常为环形或线形。线粒体基因组由编码37个基因的16,596个核酸碱基对组成，所述37个基因中的13个用于电子传递，22个用于trna，以及2个用于rrna。mtdna分析可用于追溯母系谱系，因为它是母系遗传的。其可用于诊断遗传性线粒体疾病，参见，例如，ep1841884a2,“inheritedmitochondrialdnamutationsincancer”，其描述了在受试者中鉴定oxphos系统的复合体iii、iv和/或v的核酸中的错义突变。因此，可通过本文进行的分析检测到的这样的突变包括如上述专利中描述的c5911t、g5913a、a5935g、g5949a、g5973a、g6081a、g6150a、t6124c、t6253c、g6261a、g6267a、g6285a、c6340t、g6480a、a6663g、g6924t、g7041a、t7080c、a7083g、a7158g、a7305c、a14769g、c8932t和t7389c。突变可具有抑制oxphos(氧化磷酸化)和增加ros(活性氧)的作用。
存在于细胞核中的核dna包含比mtdna更多的碱基。但是，由于细胞中存在远远更多的线粒体，因此相比核dna，存在更多拷贝的mtdna，使得mtdna成为通过本发明的方法进行分析的特别好的靶。
实施例的方法和材料
纳米移液管制作
纳米移液管从石英毛细管制成，所述毛细管为细丝状，外径为1.0mm，内径为0.70mm且长度为7.5cm(sutterinstrumentco.,item#qf100-70-7.5)。平均直径＝(106±16)nm(波动15％)。
sicm装置
扫描离子电导显微镜(sicm)由以下组成：用于纳米移液管的偏压和电流测量的低噪声放大器(axopatch200b,moleculardevices,sunnyvale,ca)、用于在x、y和z方向的粗控制的显微操作器(mp-285,sutterinstrumentcompany,novato,ca)、用于在x、y和z方向的精控制的压电致动器(nano-cube,physikinstrumente)和用于系统的硬件控制的现场可编程门阵列(fpga)(pcie-7851r,nationalinstruments)。使用在labview中编写的自定义编码软件控制系统(1)。
细胞培养
从stemgent商品目录号08-0027购买bj人成纤维细胞，并培养在含有补充物(lonza目录号cc-4181)但不含酚红的基质细胞基础培养基(scbm)(lonza目录号cc-3204)中。如供应商建议的，在补充有10％胎牛血清、0.1mm必需氨基酸、2mml-谷氨酰胺和1％青霉素-链霉素(pen-strep)的70％dmem培养基中培养表达绿色荧光蛋白的hela细胞(cellbiolabs,inc.,目录号akr-213)。所有细胞都培养在37℃5％co2中。将细胞平铺到用1％明胶包被的无网格的和有网格的平板上(未包被的无菌的ibidiμ-dish35mm，highgrid-500)。以每皿约5x104个细胞平铺细胞。
thatpbcl盐合成
通过四己基溴化铵(aldrich,#263834)和四(4-氯苯基)硼酸钾(fluka,60591)的复分解反应合成四(4-氯苯基)硼酸四己基铵(thatpbcl)。两种产物均溶解于水/甲醇(1:3)的混合物中并在乙醇中重结晶(2)。
钙成像
通过在纳米手术程序之前、过程中和之后监测[ca2+]来测试纳米活组织检查平台的侵入性。在实验之前，在上文的细胞培养部分中描述的培养基中用5μmfluo-4am(invitrogen)对人bj成纤维细胞进行染色。然后在37℃下孵育细胞30分钟。用生长培养基洗涤细胞两次。
分子生物学技术
遵照制造商的建议使用了应用sybrgreeni的real-timeqpcrmastermix—sybradvantageqpcrpremix(目录号697676)。
遵照制造商的建议使用iscripttmcdna合成试剂盒(目录号639505&639506)。
pcr引物：hela-gfp
反向引物：gcgccgaggtgaagttcgagg(seqidno:1)
正向引物：gccgtcgccgatgggggtgtt(seqidno:2)
用于对线粒体dna进行扩增(30个循环)的引物对
产物：3,968个碱基对。
凝胶电泳
在2％凝胶(100mltae缓冲液的2g琼脂糖)中运行
条件：95伏持续30分钟
线粒体的可视化
用mitotrackergreenfm(invitrogen)标记线粒体(激发波长490nm，发射波长516nm)。将mitotrackergreen以1mm的浓度溶解于二甲亚砜(dmso)，并保存在-20℃。用1mmmitotrackergreen的稀释溶液对粘附的成纤维细胞进行染色，所述mitotrackergreen在培养基中的终浓度为500nm。将细胞置于37℃孵育30分钟，并洗涤两次。然后向用于实验工作的细胞添加1ml培养基。当将培养皿置于荧光灯下时，仅线粒体显示被显著染色。
用于蛋白质和蛋白质组的亚细胞分析的纳米移液管装置和方法
除了以上应用之外，本发明的装置可用于单细胞中特定蛋白质种类和蛋白质相互作用的检测和定量。该应用使用在其尖端具有50nm的孔的纳米移液管，其能够如上文描述的从单个细胞取回并递送少量的细胞质样品(15皮升(整个细胞的～1％))。如上文描述的，将纳米移液管与扫描反馈技术整合，以对尖端进行定位用于单细胞分辨。通过监测纳米移液管尖端的离子电流，可确定纳米移液管的精确位置并将其控制在细胞膜的～200nm内。初始放置在细胞上方之后，如果人们想要对细胞内含物取样，那么以受控的速度、角度和深度将纳米移液管插入细胞中。然后将纳米移液管快速(100μm/s)降低1μm，穿透细胞膜。插入后，纳米移液管可用于注射或抽吸少量的细胞内含物。
纳米移液管使用扫描离子电导显微术靶向单个活细胞，允许用户以时间分辨率来监测单细胞的分子生物学。为了分析单细胞中基因表达的变化，人们可采用已描述的、用于核酸扩增和测序的高效方法，以允许单细胞中转录组的多重测量(tariqma,kimhj,jejelowoo,pourmandn.whole-transcriptomernaseqanalysisfromminuteamountoftotalrna.nucleicacidsres2011；39:e120)。
本发明方法的一个重要特征是多重邻位连接测定(pla)。这进一步描述于例如fredrikssons,gullbergm,jarviusj等人proteindetectionusingproximity-dependentdnaligationassays.natbiotechnol2002；20:473-7；soderbergo,gullbergm,jarviusm等人directobservationofindividualendogenousproteincomplexesinsitubyproximityligation.natmethods2006；3:995–1000；gullbergm,gustafsdottirsm,schallmeinere等人cytokinedetectionbyantibody-basedproximityligation.procnatlacadsciusa2004；101:8420–4；bjarnegardm,engem,norlinj等人endothelium-specificablationofpdgfbleadstopericytelossandglomerular,cardiacandplacentalabnormalities.development2004；131:1847–57；gustafsdottirsm,nordengrahna,fredrikssons等人detectionofindividualmicrobialpathogensbyproximityligation.clinchem2006；52:1152–60；fredrikssons,horeckaj,brustugunot等人multiplexedproximityligationassaystoprofileputativeplasmabiomarkersrelevanttopancreaticandovariancancer.clinchem2008；54:582–9；和blokzijla,friedmanm,pontef&landegrenuprofilingproteinexpressionandinteractions:proximityligationasatoolforpersonalizedmedicine.(review)jinternmed2010；268:232–245中。
蛋白质分析足够灵敏以在同一细胞中测量多个蛋白质反应是重要的。pla采用与寡核苷酸融合的杂合抗体。使用qpcr检测抗体-抗原结合，提供了蛋白质水平的高度灵敏的定量测量。pla的多个实施方案进一步描述于landegrenus6878515,“ultrasensitiveimmunoassays”中。
例如，人们可使用建立的参与癌症的细胞信号通路，表皮生长因子受体(egfr)。已知当表皮生长因子(egf)与egfr结合时，癌细胞中的蛋白激酶通路级联被激活，这引起影响细胞增殖的基因表达的改变。作为原理论证，多重pla测定因此将要测量大量的蛋白质磷酸化事件，所述蛋白质磷酸化事件在三阴乳腺癌(tnbc)系mda-mb-231中介导基因表达的egf刺激。这些细胞已经广泛用于研究egfr信号传导，并且我们已经开始使用纳米移液管研究单个mda-mb-231细胞中的基因表达。
将多重egfrfla整合到本发明的纳米移液管装置中，并且pla的灵敏度允许人们测量同一细胞中的egf刺激之前和之后的激酶激活通路。在测量同一细胞中随时间推移的egf信号传导中，人们可进一步整合纳米移液管单细胞pla和全转录组分析(wta)。这提供了一种新的纳米移液管技术，其能够同时进行单个癌细胞中随时间推移的蛋白质翻译后读出和基因组读出。
实施例
实施例1：纳米活组织检查平台设置
使用常规激光拉制仪(p2000,sutterinstruments)制作孔径为115±15nm的石英纳米移液管(图像未显示)，并填充包含10mm四(4-氯苯基)硼酸四己基铵(thatpbcl)的1-2二氯乙烷(dce)溶液。
为了将sicm改造为单细胞活组织检查平台，将纳米移液管填充dce中10mmthatpbcl溶液，并在纳米移液管的管中配备四(4-氯苯基)硼酸银(agtbacl)包被的银线。当填充dce的纳米移液管浸入水性溶液中时，由于dce的疏水特性在纳米孔腔处形成液-液界面。施加电压通过该界面，引起dce表面张力的变化。施加电压通过纳米移液管中的疏水性液体与纳米移液管外部的电解质溶液之间的界面，引起疏水性液体表面张力的变化。这种电润湿作用当施加负电压时引起水性溶液流入纳米移液管，并且当将偏压反向时引起水性溶液流出纳米移液管。
将填充的纳米移液管浸入填充有其中细胞被培养的生长培养基的培养皿中。当在细胞培养基中时，用正偏压极化纳米移液管，以防止培养基流入管中。该偏压产生通过液-液界面的离子电流，所述离子电流被用作进入反馈环路的输入。自定义编写的软件指导纳米移液管接近细胞，直至其检测到离子电流中0.5％的降低。此时，软件告知xyz控制器停止靠近，并以高速度(100μm/s)将纳米移液管快速地降低1μm以刺入细胞膜，将纳米移液管的尖端插入细胞质中。
在这个阶段，通过软件将纳米移液管偏压转换为-500mv，持续5秒，这引起细胞质受控制地吸入纳米移液管中(图3)。
然后，通过软件将偏压转换为200mv，该电压足以终止吸入，但不会起始抽吸的内含物的流出。然后，通过软件将纳米移液管快速升高，并通过施加+1v持续2分钟(也在软件的控制下)通过xyz控制器将抽吸的内含物转移到5ul的不含rna酶的液滴中，并在4℃下保存。
实施例2：绿色荧光蛋白转录物的活组织检查
我们对表达绿色荧光蛋白(gfp)的hela细胞进行活组织检查，并使用pcr方法以通过gfp转录物的靶向选择性扩增来验证方案的成功(图4)。我们使用iscripttmcdna合成试剂盒(biorad)对从单细胞中抽吸的内含物进行cdna合成。该方法将存在于活组织检查物中的所有rna逆转录为cdna。随后，对cdna进行实时-pcr，以证实gfp转录物的存在。在实时-pcr实验中，荧光保持在背景水平(第1-18个循环，图5)，直至足够的扩增产物积累到产生可检测的荧光信号。发生这个现象时的循环数被称为定量循环或cq。两个反应的cq值相差x，反映起始物质的量相差2x。
实时pcr扩增图表明，阳性对照的cq值为20，其中来自hela-gfp细胞裂解物的总rna被掺入cdna合成反应，当输入rna为活组织检查的内含物时cq值为30，并且阴性对照(当未加入rna用于cdna合成时)的cq值为33。我们使用从～1000个hela-gfp细胞中提取的总rna作为阳性对照。pc和活组织检查的样品的cq值的差异为10，这对应于输入物质的1024(210)倍的差异。因此我们可得出如下结论：扩增图与从单细胞中提取的rna的量一致。实时pcr方案依赖于荧光染料(sybr金)，当所述荧光染料插入双链dna时就会发出荧光。阴性对照中的荧光增加是由引物二聚体的形成引起的。我们勤奋地研究了纳米活组织检查方案的再现性。已知单个细胞具有不同的基因表达模式，并因此我们通过在包含～1000个gfphela细胞的裂解物的溶液中进行抽吸，来测试纳米活组织检查方案的再现性。通过qpcr的抽吸后分析(图6)证实了纳米活组织检查方案的高度再现性。
活组织检查依赖于遗传物质的电压控制的抽吸，并且不依赖于纳米移液管侧壁的物理吸附。当纳米移液管插入细胞后未向其施加电压时，以及当在本体溶液(bulksolution)中进行抽吸时，未观察到扩增(图7)。这是区分纳米活组织检查技术与基于afm的平台的关键要素。wickramasinghe的小组和osada的小组基于物理吸附或固定到探针上的互补rna的杂交，使用afm探针从培养物中的细胞中提取rna(14-15)。相比之下，纳米移液管探针的中空特性允许液体抽吸，因此不会将其应用限于rna提取。
实施例3：人bj成纤维细胞线粒体的活组织检查
纳米移液管平台决不会限于rna从单细胞的提取，其还可用于细胞的细胞器的取样。使用用于线粒体的荧光标记物mitotracker(invitrogen)对人bj成纤维细胞(皮肤成纤维细胞，atcccrl2522)进行染色(数据未显示)。将纳米移液管置于具有大量线粒体的区域上方，并使用前文描述的相同方案进行活组织检查(数据未显示)。纳米移液管的尖端中的荧光指示线粒体的成功抽吸(数据未显示)。使用活组织检查的线粒体的pcr分析来证实线粒体dna的存在。使用对线粒体基因组特异性的引物扩增线粒体dna，并且扩增的线粒体dna的凝胶电泳表明，取得的所有5个样品都显示出在针对人线粒体dna的正确长度处的条带(图8)。
实施例4：纳米移液管的最小侵入性
胞质中的ca2+浓度的调整被认为是由外来对象的插入引起的机械应力的指示(11，30-31)。为了证实单细胞活组织检查平台的低侵入性，我们测量了纳米活组织检查之前、过程中和之后的细胞内[ca2+](数据未显示)。用fluo4am标记人bj成纤维细胞(数据未显示)。光学显微图像证实了最小侵入性的过程，该过程在纳米活组织检查期间产生几乎不可检测的ca2+内流。细胞在抽吸后5秒内完全恢复，达到与抽吸前水平一致的[ca2+]。
实施例5：纳米活组织检查分析内源性mrna表达
纳米移液管中的电润湿
使用p-2000激光拉制仪(sutterinstrument,novato,ca)从石英毛细管(sutterinstrument,novato,ca)制成纳米移液管。平均直径＝(106±16)nm。将石英纳米移液管填充包含10mm四(4-氯苯基)硼酸四己基铵(thatpbcl)的1-2二氯乙烷(dce)溶液。然后将四(4-氯苯基)硼酸银(agtbacl)包被的银线插入纳米移液管的管中，同时将ag/agcl线浸入电解液(bathsolution)中充当参比电极/对电极。
sicm设置
扫描离子电导显微镜(sicm)由以下组成：用于纳米移液管的偏压和电流测量的axopatch200b低噪声放大器(moleculardevices,sunnyvale,ca)、用于在x、y和z方向的粗控制的mp-285显微操作器(sutterinstrument,novato,ca)、用于在x、y和z方向的精控制的nano-cube压电致动器(physikinstrumente,irvine,ca)和用于系统的硬件控制的pcie-7851r现场可编程门阵列(fpga)(nationalinstruments)。使用在labview8中编写的自定义编码软件操作系统。
细胞培养
从stemgent购买bj人成纤维细胞，并培养在含有补充物(lonza,alpharetta,ga)但不含酚红的基质细胞基础培养基(scbm)(lonza,alpharetta,ga)中。如供应商建议的，在补充有10％胎牛血清、0.1mm必需氨基酸、2mml-谷氨酰胺和1％青霉素-链霉素的70％dmem培养基中培养表达绿色荧光蛋白的hela细胞(cellbiolabs,sandiego,ca)。所有细胞都培养在37℃5％co2中。将细胞平铺到用1％明胶包被的无网格的和有网格的平板上(未包被的无菌的ibidiμ-dish35mm，highgrid-500)。以每皿约5x104个细胞平铺细胞。
cdna合成和qpcr
使用iscripttmcdna合成试剂盒(biorad,hercules,ca)遵照制造商的建议，从由来自细胞的纳米活组织检查的总rna合成cdna。遵照制造商的建议使用clontech的advantageqpcrpremixsybrgreenimastermix(clontech,mountainview,ca)，将定量pcr(qpcr)用于证实纳米活组织检查方案的成功。pcr引物：hela-gfp，反向引物：gcgccgaggtgaagttcgagg(seqidno:1)，正向引物：gccgtcgccgatgggggtgtt(seqidno:2)，用于扩增抽吸的线粒体dna，扩增得到通过凝胶电泳可视化的3968个碱基对。
cdna合成和rna测序
使用
为了进行配对末端全转录组文库制备，使用covaris-s2超声波仪(covaris,woburn,ma)根据制造商建议的方案将每个样品的～0.5-1.0μgcdna剪切为在200-300bp范围内的大小。使用truseqv1多样品制备试剂盒(illumina,sandiego,ca)将片段化的cdna样品用于制备rna-seq文库。简言之，根据制造商的说明，对cdna片段进行末端修复、da-加尾并连接到多种衔接子上。连接后，用ampurexp珠(beckmancoultergenomics,danvers,ma)除去小于150bp的dna片段。使用聚合酶链式反应(14个循环)富集纯化的衔接子连接的产物。使用caliperxt系统(perkinelmer,waltham,ma)将最终的扩增文库在2.0％琼脂糖凝胶上分离，并选择350–380bp范围内的大小。使用agilentbioanalyzer2100对最终的rna-seq文库进行定量，并以相等浓度汇集在一起用于测序。在miseq(illumina,sandiego,ca)上对汇集的多个文库进行测序，产生2x150bp的配对末端读段。
线粒体dna扩增和测序
使用一对引物：正向tcatttttattgccacaactaacctcctcggactc(seqidno:3)和反向cgtgatgtcttatttaaggggaacgtgtgggctat(seqidno:4)，通过长片段pcr(long-rangepcr)扩增抽吸的线粒体dna，产生～8kbp的片段。使用长链高保真聚合酶链式反应(longandaccuratepolymerasechainreaction，la-pcr)lapcr试剂盒ver.2.1(takarabio)扩增抽吸的线粒体基因组。在25μl反应混合物中进行线粒体基因组扩增，所述反应混合物包含抽吸的模板dna、2.5μl10xepicenter’sboost、2.5μl10xlapcr缓冲液ii(加有mg2+)、4.0μldntp(2.5mm)、1.25μl每条引物(10μm)、0.125μllataqdna聚合酶和11.4μl无菌蒸馏水。热循环条件是95℃持续2分钟；然后进行30个循环，每个循环由94℃持续15秒、然后为68℃持续8分钟组成；以及在68℃持续13分钟的最后延伸。通过covariss2系统剪切线粒体扩增子，得到300-400bp的片段，所述片段在自动机器上经受自动化illumina多个配对末端文库的制备。将独特的索引序列用于每个线粒体样品，并在单个illuminahiseq2000通道上测序。
生物信息学方法
对来自线粒体实验的短读段进行预处理，以从读段的3’末端剪去测序衔接子。使用非拼接比对器将线粒体读段与修订版剑桥线粒体参考序列进行比对。报告了在5％和99％之间的异质性变体。对来自rna-测序实验的短读段进行预处理，以从读段的3’末端剪去测序衔接子。待除去的来自rna-测序读段5’末端的10个碱基在cdna第二条链合成过程中被偏向性引入。使用拼接比对工具将rna-测序读段与hg19ucsc人参考基因组33以及与ucsc已知基因进行比对。如果至少一个读段独特地映射到一个注释的转录物上，就认为基因被表达。对检测到的基因进行基因集富集分析，并报告过度重复出现的(overrepresented)基因本体。详细的生物信息学方法在支持信息的方法部分是可得的。
纳米活组织检查平台可用于分析来自单个活细胞的内源性mrna表达。产生成熟mrna的cdna，进行测序，并将读段映射到人参考基因组上。观察到细胞质poly-a结合蛋白(pabpc1)中的差异性3’非翻译区域(utr)利用，其中两个抽吸物显示非典型亚型的占优势的表达，而第三个抽吸物显示典型亚型的表达(图9a)。我们还观察到其中得到的覆盖范围跨越整个转录物而非仅3’utr的情况。图9b中示出了读段覆盖范围跨越甲基巴豆酰基辅酶a羧化酶2(mccc2)的全长的实例。作为纳米活组织检查可用于分析内源性rna的另一个证明，我们富集了最过度重复出现的基因本体，并发现两个抽吸物占主要优势地表达与翻译相关的机器(machinery)，而一个富集了与代谢和形态发生相关的过程。
实施例6：纳米活组织检查的线粒体的基因组测序
遵循实施例5中的线粒体活组织检查，采用下一代测序对活组织检查的线粒体的基因组进行测序。使用线粒体基因组特异性的引物扩增线粒体dna。该方法是新的且重要的，因为其允许我们选择性地对线粒体基因组进行测序，而不需要把线粒体核酸与更加丰富的核dna分开。来自单细胞的两个线粒体抽吸物以及从细胞群体提取的dna的测序结果表明，一些异质性变体的频率在亚细胞水平更加保守(图10)。例如，两个异质性变体(14713a->t和16278c->t)可见于亚细胞抽吸物以及来自总(汇集的)线粒体群体的样品中。发现14713a->t变体的频率在所有样品中均相似，为83％、87％和79％。但是，16278c->t变体显示频率的巨大差异，汇集的线粒体对比所选择的线粒体的频率分别为62％、98％和38％。而基于群体的测序中可观察到平均异质频率，只有亚细胞测序揭示出一个细胞中的异质性变体。除了亚细胞抽吸物之间的异质性频率的差异之外，我们还能够检测到占测序读段的多于5％的大量变体。这些结果表明，通过将纳米移液管与新的线粒体定向基因组技术结合，可对单细胞中的小亚群的线粒体基因组进行测序。
在实施例5和6中，纳米活组织检查依赖于电压控制的细胞物质的抽吸，而不依赖于对纳米移液管侧壁的吸附。如果在插入细胞之后未将负电压施加到纳米移液管，以及当在本体溶液中进行抽吸时，就不会观察到扩增。这是区分纳米活组织检查技术与基于afm的平台的一个关键要素。
实施例7：测量mda-mb-231细胞中egfr信号传导的基于纳米移液管-pla的设备.
egfr激活导致mapk和jnk通路、多个转录因子(tf)的磷酸化和刺激，并最终导致基因转录和细胞增殖的改变。在基础条件下，这些蛋白激酶通路中的许多酶是无活性的。但是，egf刺激通过转换它们的磷酸化状态而激活这些蛋白质。多重邻位连接技术(pla)用于测量mapk和jmnkegfr信号传导通路的不同成分的磷酸化。这包括mkk1的磷酸化，mkk1的磷酸化催化mapkerk1/2的磷酸化，然后mapkerk1/2的磷酸化使tfap-和fos-jun磷酸化，磷酸化的ap-和fos-jun调控参与细胞生长的基因的表达。
举个具体例子，使用用于jak的磷酸化形式的pla，所述jak的磷酸化形式刺激stat的磷酸化，磷酸化的stat调控细胞增殖。介导egf信号传导的多种其他磷酸化靶都可以是研究对象，并且人们可方便地获得市售可得的第一抗体和第二抗体，并产生用于pla的抗体-寡核苷酸杂合物。类似地，开发pla以检测每个纯化的磷酸化靶，并对溶液中检测的蛋白质的量进行优化。
人们可使用纳米移液管从细胞(例如用egf处理的单个mda-mb-231细胞或单个临床肿瘤细胞)中取样不同量的细胞质，并评价每个pla所需的细胞样品的最低量。人们还可在癌细胞中进行egf处理之前和之后，使用多重pla测量同一细胞中egf信号传导通路中的变化。纳米移液管装置用于在基础条件下和在egf刺激之后从同一细胞分离不同的样品用于pla和wta。wta可用于鉴定由egf激活的基因簇，并且具体基因表达的变化将通过qpcr定量。所述方法还可用于测试特异性阻断个体磷酸化事件和基因表达变化的mapk或jnk的选择性抑制剂，以提供独特的方法以将癌细胞中的具体信号传导通路与选择性基因的表达调控联系起来。
现在参照图11，机械平台110用于支持、指导和操作安装在平台110上的纳米移液管112，所述平台110还包括显微指导系统和xyz控制器用于将纳米移液管尖端114插入细胞116。如图所示，细胞116是真核的，但是尖端114被插入胞质区室中。下一步，如箭头118所示，将纳米移液管和从细胞116抽吸的内含物移位到容器112，如箭头120所示的。在此，允许一种或多种感兴趣的蛋白质与抗体124结合，所述抗体124结合同一蛋白质上的不同表位。例如，一个表位可由磷酸化的氨基酸代表，所述磷酸化的氨基酸否则在蛋白中则是氨基酸。如122所示，如果蛋白质结合两种抗体，寡核苷酸标签将互相接触，并允许彼此连接。然后引物126可用于桥接所述寡核苷酸，并扩增所述连接的寡核苷酸。如128所示，扩增可通过检测扩增的蛋白质分子的数目的实时或定量pcr方法进行。
如图11所示，细胞x被纳米移液管穿透，所述纳米移液管由显微镜例如sicm(扫描离子电导显微镜)放置并指导。如上文描述的，每次我们使用纳米移液管抽吸～15皮升的细胞内含物(～1％)，其对应于～1pg的总rna。使样品经历rna扩增(～1000倍)，并用于cdna合成和测序。除了基因组分析之外，样品还能够进行同一单细胞中的蛋白质组分析，或可选地，用于单细胞分子分析的纳米移液管仪器除了进行基因组分析外，还能够在同一单细胞中进行蛋白质组分析。pla是一种扩增测定，其采用抗体以选择性地检测单个蛋白质靶。其并入pcr以定量蛋白质。这通过将用于pcr的寡核苷酸融合至蛋白质抗体而实现。
再次参照图11，示出了本发明方法的pla部分的示意图。pla的示意图。靶向同一蛋白质的不同表位的两个抗体偶联至引物或封闭的寡核苷酸。抗体与蛋白质的结合将每个寡核苷酸置于允许连接和扩增的紧密靠近的状态。然后可通过实时pcr检测扩增的产物。pla已被用于测量许多生长因子受体，包括pdgfr和egfr。
pla过程还用于egfr。其用于研究在egfr激活中至关重要的第一步，受体二聚化。大量研究已经表明，pla比市售可得的elisa灵敏超过1000倍，并且因为pcr，能够检测样品中相对较少的靶蛋白质。原位pla足够灵敏以检测固定的单细胞中的磷酸化的pdgfrβ，并且能够测量药物诱导的激酶活性的抑制。
在一个方法中，使用两种不同的抗体，一种选择磷酸化的靶，且另一种在同一蛋白质上具有更通用的表位。对于每组抗体，引物寡核苷酸偶联至一种抗体，且封闭寡核苷酸将偶联至另一种抗体。使用连接子寡核苷酸将实现两种寡核苷酸的杂交。qpcr将用于检测每个pla中扩增的寡核苷酸。
第二个方法基于近期描述的技术(weibrechti,grundbergi,nilssonm,soderbergo(2011)simultaneousvisualizationofbothsignalingcascadeactivityandend-pointgeneexpressioninsinglecells.plosone6(5):e20148.doi:10.1371/journal.pone.0020148)，其中pla中采用的寡核苷酸偶联至第二抗体。因此，与第一种方法相同，使用靶向同一蛋白质的不同表位的两种抗体，但是它们来自不同的种类。来自互补种类的第二抗体偶联至引物寡核苷酸或封闭寡核苷酸。该方法的潜在优势是仅需要将第二抗体偶联至寡核苷酸而不需要将寡核苷酸合成到多重测定中使用的每种抗体上，并且那些第二抗体通常可用于每种pla。目标1中的初始研究将确定哪种方法对测定的发展是最佳的。
在另一个实施方案中，可使用多重测定，人们确定每个测定的灵敏度，以测量常见的细胞匀浆样品(抽吸物)中的磷蛋白。将纳米移液管用于抽吸被研究的单细胞的增加量的细胞质，并用于确定所有pla都能够定量它们的靶蛋白质所需的细胞样品的最低量。人们可通过改变施加至纳米移液管尖端的电压来改变从单个细胞中取样的量。最佳的是，其将能够定量～15皮升细胞内含物(总细胞的～1％)中的每种磷蛋白，因为这是我们能够测量这些癌细胞中wta的细胞样品的量，并且可多次抽吸取样这个量的胞质而不会对细胞产生明显的损伤或损害生存力。
使用上述方法，人们还确定了通过细胞通路激活子刺激之前和之后细胞的状态。例如，在egf(1μm)处理之前和之后1小时对单个mda-mb-231细胞取样，并确定pla是否将鉴定出egfr、mapk和jak通路以及ap-1/jun和stattf的磷酸化的预期增加。重要的是，egf可通过mapk-ap-1/jun和jak-stat刺激不同的信号传导。存在这些通路中的每一个的选择性抑制剂，使得阻断一条通路不会影响经由其他通路的egf信号传导，以确立磷酸化的特异性。
为了开发pla以测量磷酸化的egfr、mkk1、erk1/2、jak、ap1/jun和stat，人们可使用来自cellsignaling(cs)cellsignalingtechnology,inc.(cst)beverly,massachusettsandsantacruzbiotechnology,inc.,dallas,texas(sc)的市售可得的抗体。对于每个靶，使用两种抗体，一种选择性地靶向磷酸化位点，且另一种抗体靶向同一蛋白质上的不同表位。对于抗-egfr抗体，人们可使用靶向氨基酸1156-1186的兔多克隆抗体06-847(cs)和靶向酪氨酸1197的小鼠单克隆抗体05-483(cs)。对于mkk1，人们可使用靶向c末端的单克隆抗体04-376(cs)和靶向pser218/222的抗-磷酸化多克隆抗体444995。对于erk1/2，人们可使用靶向残基325-345的小鼠单克隆抗体05-1152(cs)和靶向pthr202/tyr204的抗-磷酸化兔多克隆抗体。对于jak1，人们可使用靶向残基785-815的小鼠单克隆抗体a-9(sc-1677)和兔抗-磷酸化抗体tyr1022(sc-101716)。为了检测磷酸化的tf，人们可使用抗-c-jun/ap-1小鼠单克隆抗体op55(cs)和靶向c-jun的磷酸化的丝氨酸65的兔抗-磷酸化单克隆抗体y172(cs)。对于stat1，人们可使用兔多克隆抗体sc-346和靶向酪氨酸701的小鼠单克隆抗-磷酸化-stat1抗体(sc-8394)。
抗体-寡核苷酸的合成可使用上文引用的以前的方法。使抗体与30倍过量的smpb(pierce)反应。通过g-50柱除去过量的smpb。使引物寡核苷酸(5’巯基-aaaaaaaaaatatgacagaactagacactctt)seqidno5和封闭寡核苷酸(5’巯基-aaaaaaaaaagacgctaatagttaagacgcttuuu)seqidno:6与10mmdtt反应30分钟，除去dtt，并且然后将引物寡核苷酸添加至活化的抗体的一种中，将封闭寡核苷酸添加至每组的另一种抗体中。通过hplc纯化抗体-寡核苷酸。对于测试第二抗体-寡核苷酸pla探针的研究，使用驴抗兔igg(711-005-152,jacksonimmunoresearch)和驴抗小鼠igg(715-005-150,jacksonimmunoresearch)，并且可以以与描述的相似的方式进行寡核苷酸与抗体的缀合。
可从与所述抗体相同的来源(sc或cs)获得纯化的靶(例如磷酸化的egfr)，并用于开发pla。蛋白质靶与pla探针预孵育1小时，且然后与包含探针连接物的混合物反应，所述探针连接物是连接子寡核苷酸(5’磷酸-ctattagcgtccagtgaatgcgagtccgtctaagagagtagtacagcagccgtcaagagtgtctaseqidno:7(eurogentec)和5’-磷酸-gttctgtcatatttaagcgtcttaa)seqidno:8。对于实时pcr，添加包含80μmatp、0.2mmdntp、0.5μm引物、用于5’核酸酶测定的200nm探针和1.5单位的platinumtaqdna聚合酶的混合物。将反应物转移到实时pcr仪器中进行温度循环：95℃持续2分钟，然后95℃持续15秒和60℃持续60秒，重复45次。
对于使用第二抗体pla探针的pla，首先将蛋白质靶与上文描述的第一抗体(未偶联至寡核苷酸)一起孵育。通过洗涤除去未结合的抗体，并将第二抗体pla探针(抗-兔和抗-小鼠两者)添加至每个第一抗体结合的靶中。然后pla将遵循与上文描述的相似的过程。
可针对使用的pla探针的量、反应时间、洗涤程序以及连接和杂交反应对每个pla进行优化。人们还可改变靶蛋白质的量以鉴定用于qpcr的最佳蛋白质浓度。类似的研究采用了用egf刺激的mda-mb-231细胞或测试细胞的匀浆作为磷酸化的egf调控的靶的来源，以解释说明可能影响pla的任何细胞因子。可通过用抗体肽封闭每个pla来确立特异性。
人们可使用纳米移液管从用egf处理的单个细胞(例如mda-mb-231)中取样不同量的细胞质，并评价用于定量每种靶蛋白质的磷酸化的每个pla所需的细胞样品的最低量。细胞抽吸物将从低至～15皮升(我们的wta中使用的量)至全细胞内含物之间变化。对于每个pla，人们可开发细胞内含物相对于通过qpcr的蛋白质定量的剂量反应。分析应在3-4个不同细胞上重复，以确定pla读出的变化性。
定量测试(例如mda-mb-231)细胞中的egf诱导的蛋白质磷酸化的多重pla
人们可多次进行上文开发的pla，并测试感兴趣的蛋白质标志物，确定测量细胞中所有蛋白质靶的磷酸化(或其他修饰)的细胞样品的最低量。使用纳米移液管抽吸增加量的细胞样品。然后将每个样品等分并添加至pla中，以测量每个靶蛋白质。目标是确定提供细胞中的每种靶蛋白质的最优读出所需的细胞抽吸物的最低量。然后人们将那个量的细胞抽吸物用于标准测定，以测量egf信号传导通路的每个成分。然后人们可使用多重pla以测量egf处理之前和之后癌细胞中egf信号传导通路的变化。为此，纳米移液管将被用于将羧基荧光素注射到单个癌细胞中。然后标记的细胞将在egf处理之前1小时以及然后在egf(1μm)加入后1小时被取样。由于在基础条件下应存在足够磷酸化的每种靶蛋白质，因此pla将检测到靶蛋白质磷酸化的主要增加。人们还可从未处理的癌细胞中抽吸多个样品，以确定细胞抽吸本身是否会诱导靶蛋白质的磷酸化。如果是的话，人们可使用那个刺激作为测定egf刺激的作用的基线测量。
为了测试pla测量egf信号传导的特异性，我们将确定在单个mda-mb-231细胞中由egf调控的一些激酶的抑制剂是否会阻断下游的激酶和tf的磷酸化。首先，人们可确定egfr激酶抑制剂gefitinib(1μm)(caymaneurope)是否会阻断egfr、mkk1、erk1/2、jak、ap1/jun和stat的磷酸化。人们还可测试mkk1抑制剂pd0325901(cs)是否会选择性地阻断mkk1、erk1/2和ap1/jun磷酸化而不会影响egfr、jak和stat磷酸化。该化合物阻断mkk1活性和随后的erk1/2的磷酸化，但是不会与erk1/2直接相互作用。作为本发明方法应用于未表征的肿瘤细胞的另一方面，人们可测试erk1/2选择性抑制剂fr180204是否会阻断erk1/2和ap1-jun磷酸化而不会阻断egf信号传导的其他成分。此外，人们可测试jak抑制剂incb018424(chemitek)是否会阻断egf诱导的jak和stat的磷酸化而不会阻断egf诱导的mapk通路的磷酸化。
预期检测egfr、mkk1、erk1/2、jak、ap1/jun和stat磷酸化的pla将具有比针对这些蛋白质的市售可得的elisa约1000倍更高的灵敏度；此外，多重pla形式能够在来自单细胞的15-150皮升的单个抽吸物中检测这些磷蛋白；并且，预期与未处理的对照相比，单个肿瘤细胞特别是三阴细胞，例如模式细胞mda-mb-231的egf刺激，将会引起靶蛋白质的磷酸化的显著(p<0.05)增加。
结论
上述具体描述预期为了例证并说明本发明，并且不应该被视作限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的文字范围和等效范围限定。该说明书中提及的任何专利或出版物预期表达在实施本发明的某些方面中有用的方法和材料的详细信息，所述详细信息可能并未明确示出但会被本领域技术人员理解。如为了描述并使能够进行引用的方法或材料的目的所需的，此类专利或出版物通过引用并入本文，其程度如同每个专利或出版物通过引用被具体并单独地并入包含在本文中一样。
参考文献
1.schubertc(2011)single-cellanalysis:thedeepestdifferences.nature480(7375):133-137.
2.wangd&bodovitzs(2010)singlecellanalysis:thenewfrontierin‘omics’.trendsinbiotechnology28(6):281-290.
3.zhengxt&licm(2012)singlecellanalysisatthenanoscale.chemicalsocietyreviews41(6):2061-2071.
4.trouillonr,passarellimk,wangj,kurczyme,&ewingag(2012)chemicalanalysisofsinglecells.analyticalchemistry85(2):522-542.
5.vangelderrn等人(1990)amplifiedrnasynthesizedfromlimitedquantitiesofheterogeneouscdna.proceedingsofthenationalacademyofsciences87(5):1663-1667.
6.eberwinej&bartfait(2011)singlecelltranscriptomicsofhypothalamicwarmsensitiveneuronsthatcontrolcorebodytemperatureandfeverresponse:signalingasymmetryandanextensionofchemicalneuroanatomy.pharmacology&therapeutics129(3):241-259.
7.zongc,lus,chapmanar,&xiexs(2012)genome-widedetectionofsingle-nucleotideandcopy-numbervariationsofasinglehumancell.science338(6114):1622-1626.
8.morrisj,singhjm,&eberwinejh(2011)transcriptomeanalysisofsinglecells.jvisexp(50):e2634.
9.yumk,wangn,&yum-f(2010)nanoneedle:amultifunctionaltoolforbiologicalstudiesinlivingcells.nanoscale2(3):363-372.
10.tianb等人(2010)three-dimensional,flexiblenanoscalefield-effecttransistorsaslocalizedbioprobes.science329(5993):830-834.
11.singhalr等人(2011)multifunctionalcarbon-nanotubecellularendoscopes.natnano6(1):57-64.
12.yanr等人(2012)nanowire-basedsingle-cellendoscopy.natnano7(3):191-196.
13.osadat,ueharah,kimh,&ikaia(2003)mrnaanalysisofsinglelivingcells.journalofnanobiotechnology1(1):2.
14.ueharah,kunitomiy,ikaia,&osadat(2007)mrnadetectionofindividualcellswiththesinglecellnanoprobemethodcomparedwithinsituhybridization.journalofnanobiotechnology5(1):7.
15.nawarathnad,changr,nelsone,&wickramasinghehk(2011)targetedmessengerrnaprofilingoftransfectedbreastcancergeneinalivingcell.analyticalbiochemistry408(2):342-344.
16.nawarathnad,turant,&wickramasinghehk(2009)selectiveprobingofmrnaexpressionlevelswithinalivingcell.appliedphysicsletters95(8):083117.
17.novakp,etal.(2009)nanoscalelive-cellimagingusinghoppingprobeionconductancemicroscopy.natmeth6(4):279-281.
18.shevchukai,etal.(2012)analternativemechanismofclathrin-coatedpitclosurerevealedbyionconductancemicroscopy.thejournalofcellbiology197(4):499-508.
19.hansmap,drakeb,martio,goulds,&praterc(1989)thescanningion-conductancemicroscope.science243(4891):641-643.
20.korchevye,bashfordcl,milovanovicm,vodyanoyi,&labmj(1997)scanningionconductancemicroscopyoflivingcells.biophysicaljournal73(2):653-658.
21.viloznyb,actisp,segerra,vallmajo-martinq,&pourmandn(2011)reversiblecationresponsewithaprotein-modifiednanopipette.analyticalchemistry83(16):6121-6126.
22.actisp等人(2011)voltage-controlledmetalbindingonpolyelectrolyte-functionalizednanopores.langmuir27(10):6528-6533.
23.actisp等人(2011)reversiblethrombindetectionbyaptamerfunctionalizedstingsensors.biosensorsandbioelectronics26(11):4503-4507.
24.actisp,maka,&pourmandn(2010)functionalizednanopipettes:towardlabel-free,singlecellbiosensors.bioanalyticalreviews1(2):177-185.
25.actisp,jejelowoo,&pourmandn(2010)ultrasensitivemycotoxindetectionbystingsensors.biosensorsandbioelectronics26(2):333-337.
26.adamsegerr等人(2012)voltagecontrollednano-injectionsystemforsingle-cellsurgery.nanoscale4(19):5843-5846.
27.laforgefo,carpinoj,rotenbergsa,&mirkinmv(2007)electrochemicalattosyringe.proceedingsofthenationalacademyofsciences104(29):11895-11900.
28.dalesec&unwinpr(2008)polarisedliquid/liquidmicro-interfacesmoveduringchargetransfer.electrochemistrycommunications10(5):723-726.
29.chenc-c,zhouy,&bakerla(2012)scanningionconductancemicroscopy.annualreviewofanalyticalchemistry5(1):207-228.
30.berridgemj,bootmanmd,&roderickhl(2003)calciumsignalling:dynamics,homeostasisandremodelling.natrevmolcellbiol4(7):517-529.
31.brinim&carafolie(2009)calciumpumpsinhealthanddisease.physiologicalreviews89(4):1341-1378.
32.soonww,hariharanm,&snydermp(2013)high-throughputsequencingforbiologyandmedicine.molsystbiol9.
33.
序列表
<110>加利福尼亚大学董事会
<120>用于亚细胞分析的纳米移液管装置和方法
<130>482.35-1pct
<150>us61/781,841
<151>2013-03-14
<160>8
<170>patentinversion3.5
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<211>21
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<213>人工的
<220>
<223>合成制备的寡核苷酸序列
<400>8
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