本发明涉及一种用于对液体样品中荧光染料染色微粒进行快速计数的计数系统。
背景技术：
液体是各种反应进行的良好介质，也是生物体中各种成分分散的媒介。常见的对液体中的微粒进行计数及分类的方法有显微镜人工计数法、显微图像计算机辅助计数法、激光散射法、流式细胞法、Coulter法等等，这些方法存在着计数效率低、平行性差、区分度不佳、抗干扰能力弱、价格昂贵等等不足，难以在样品快速检验和工业过程控制等领域广泛应用。显微镜人工计数法是一种传统的、较为准确的微粒计数方法，传统显微计数法是通过人工进行计数，效率较低而且容易出现人为的错误，显微图像计算机辅助计数法虽然极大提高了效率，但是由于视野选择多为人工进行，常常出现随机差、人为错误、没有代表性等问题，影响计数的准确性。
不同的荧光染料具有不同的光学特性和特异结合性质，可以利用这些特性将液体中的微粒进行荧光染色，达到快速微粒计数以及不同微粒区分计数的目的。而且荧光法具有良好的抗干扰性，样品的颜色、样品浑浊度以及外界的杂光对其测定结果影响极小。
现有荧光法微粒计数法激发光多以小角度大光斑照射激发样品发光，可能导致部分荧光寿命较低或者需要较高激发光能量的染料发光强度快速衰减和发光效率较低的现象，导致计数不准、假阳性、假阴性等问题。部分仪器采用光源在样品池下部照射激发荧光，显微成像镜头在上方拍摄的设计，这样的设计虽然光路简单，但是会导致样品背景过亮，会干扰显微成像效果，导致计数不准、假阳性、假阴性等问题。常见的荧光计数法采用移动样品池的方法来获得多个计数视野，由于样品没有进行固定，样品池的移动会导致样品中微粒产生移动，导致无法准确获得微粒计数。现有方法为了应对不同折光率的样品带来的光路变化，常采用固定样品专用光路、手动调节光路或者使用昂贵的液体透镜作为光路调节器，导致使用费用较高或者操作不便。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决现有的荧光计数法显微成像效果不好、计数不准确、系统复杂等问题，提供一种用于对液体样品中荧光染料染色微粒进行快速计数的计数系统，该系统通过对液体样品中的微粒进行特定荧光染料染色及各组成系统的共同作用，能够实现准确高效、方便快捷的对液体样品中特定微粒进行快速计数以及快速分类计数。所述的微粒可以是生物样本中的尿液、血液、分泌物、细胞悬液和乳汁，或其他液体样品，例如微胶囊、乳化液中的具有荧光基团或能被特定荧光染料染色的微粒。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种用于对液体样品中荧光染料染色微粒进行快速计数的计数系统，所述的系统包括显微成像系统、荧光激发系统、滤光片系统一、滤光片系统二、光学装置整体移动系统、样品承载系统、数据计算系统和样品池；
所述的显微成像系统的输出端与数据计算系统的输入端相连，所述的显微成像系统设置在样品池正上方，显微成像系统用于拍摄样品池内的微粒；
所述的荧光激发系统的荧光激发端设置在样品池的斜上方，荧光激发系统用于激发样品池内的微粒显色，所述的荧光激发系统内设置有滤光片系统一，所述的滤光片系统一用于获得所需不同波长的激发光，所述的荧光激发系统内的激发光通过光纤传输；
所述的滤光片系统二设置在显微成像系统的拍摄光路上，滤光片系统二用于获取较佳的样品发射图像和防止外界杂光的干扰；
所述的光学装置整体移动系统用于实现显微成像系统的水平左右移动；
所述的样品承载系统用于承载样品池。
本发明相对于现有技术的有益效果是：本发明能够提高检测效率，测定一个染色后的样品仅需60 s；提高检测的准确度，样品池固定不动，杜绝以往样品池移动带来的细胞流动干扰，提高不稳定染料的染色效果；激发光斑较小，仅照射摄像头拍摄的区域，减少敏感染料被光长时间照射带来的发射光强度降低；使用光纤传导激发光，光路简洁，激发光可以随镜头随意移动；提高检测准确性，光源处设有滤光片，使得光源发出特定波长的光，高效率激发荧光染料，同时避免白光激发导致的多种不同激发波长染料同时发光干扰检测，光源处的滤光片设有不透光档位，便于化学发光方法的应用和系统校准，摄像头处设有滤光片，降低杂散光对计数的干扰；提高检测灵敏度，激发光几乎垂直的照射在样品上，形成光强度较大的光斑，强烈激发染料，提高检测灵敏度，垂直式激发也没有以往的透射式激发存在的强大的杂光干扰问题，黑色底的检测池提供一个良好的暗色本底，有助于提高灵敏度。
附图说明
图1为本发明系统的结构示意图；其中，1-显微成像系统、2-荧光激发系统、3-滤光片系统一、3-1-滤光片系统二、4-光学装置整体移动系统、5-样品承载系统、6-数据计算系统、7-样品池。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
本发明通过显微成像系统对液体样品中的荧光染料染色微粒进行清晰拍摄图像；荧光激发系统以75°~85°角的488 nm的光照射显微成像系统拍摄区域，激发吖啶橙染色微粒发出荧光；滤光片系统一以波长为488 nm的滤光片来保证激发所需光波长，滤光片系统二以波长为580 nm的滤光片来防止杂光干扰显微成像系统成像；光学装置整体移动系统将显微成像系统和荧光激发系统精密地按照设定进行移动，获取多个视野的样品图像；样品承载系统将样品以尽可能单微粒的形式分布在一个平面上便于准确计数；数据计算系统通过设定的算法（例如：腐蚀算法：把发光点都缩小成一个个小点，然后再循环计算和背景色不同的像素个数）对特定的微粒进行快速计数。本发明采用显微成像技术和荧光染色技术，开发了一种准确高效、方便快捷和使用费用低廉的对液体样品中特定微粒进行快速计数以及快速分类计数的系统，该系统通过对显微成像系统视野中的微粒使用化学方法进行荧光染色，使得数据计算系统内的计数芯片可以对微粒进行计数，设备通过光学装置整体移动系统移动，获得多个不同视野的微粒计数，通过数据计算系统的算法得到样品中染色微粒的数量。
具体实施方式一：本实施方式记载的是一种用于对液体样品中荧光染料染色微粒进行快速计数的计数系统，如图1所示，所述的系统包括显微成像系统1、荧光激发系统2、滤光片系统一3、滤光片系统二3-1、光学装置整体移动系统4、样品承载系统5、数据计算系统6和样品池7；
所述的显微成像系统1的输出端与数据计算系统6的输入端相连，所述的显微成像系统1设置在样品池7正上方，显微成像系统1用于拍摄样品池7内的微粒；
所述的荧光激发系统2的荧光激发端设置在样品池7的斜上方，荧光激发系统2用于激发样品池7内的微粒显色，所述的荧光激发系统2内设置有滤光片系统一3，所述的滤光片系统一3用于获得所需不同波长的激发光，所述的荧光激发系统2内的激发光通过光纤传输；
所述的滤光片系统二3-1设置在显微成像系统2的拍摄光路上，滤光片系统二3-1用于获取较佳的样品发射图像和防止外界杂光的干扰；
所述的光学装置整体移动系统4用于实现显微成像系统1的左右水平移动；
所述的样品承载系统5用于放置样品池7。
所述的系统工作过程如下：启动电源开关，光源和摄像头自动开启，滤光片系统一3的定位（令光通过没有滤光片的1号（没有滤光片的透光位）位置经光纤传输照射在样品池7内的经过抛光的载物台上，再反射到显微成像系统1的摄像头来定滤光片的1号位），滤光片系统二3-1的定位（通过调整，使样品池7内的载物台反射的白光进入摄像头来定没有滤光片的1号位），滤光片系统一3的定位确认（滤光片移动，让不透光的0号位（即不透光位）位于光路上阻断激发光，使得没有光照射在样品池7内的铝合金制抛光的载物台上反射到摄像头，来确认滤光片系统一3的定位准确性），滤光片系统二3-1的定位确认（滤光片系统一3定位到1号位，然后滤光片系统二3-1通过由1号空白位调整到0号不透光位使得反射的白光消失来确认滤光片系统二3-1的定位准确性），滤光片系统一3调整到0号不透光位，滤光片系统二3-1调整到0号不透光位，保护摄像头，光学装置整体移动系统4定位（光学装置整体移动系统4在XY轴步进电机带动下，移动到4个运动区域的顶点，遇到巨大阻力后确定4个运动区域的顶点位置，最终运动到原点），光源和摄像头预热10 min后开始检测，在样品承载系统5上放入盛有染色后样品的样品池7，滤光片系统一3和滤光片系统二3-1将选定的滤光片置于光路位置，光学装置整体移动系统4带动光学系统按照设定进行移动，拍照，拍照完成后，滤光片系统一3和滤光片系统二3-1均将0号不透光位移动到光路上，保护摄像头，光学装置整体移动系统4运动到原点，拿出样品池7，图片发到数据计算系统6进行分析计数，使用完毕后，光源和摄像头断电，关闭电源。
具体实施方式二：具体实施方式一所述的一种用于对液体样品中荧光染料染色微粒进行快速计数的计数系统，所述的显微成像系统1由带反控的工业电子显微镜或者CCD/CMOS摄像头配合光学透镜组构成，通常放大40倍、100倍等倍数。通过自动或者手动调节光学透镜组，适应不同折射率的样品带来的微小光路偏差，通过光学透镜组获得一定放大倍数的、准确清晰的、液体样品的局部染色发光微粒显微图像，并将图像传递给数据计算系统。如果配合大视野光学系统，可以减少采样视野数量。如果配合冷却系统可以有效提高工业电子显微镜或者CCD\CMOS摄像头的成像灵敏度、清晰度和稳定性。显微成像系统通过RS232、485、USB、TCP/IP等常见方式进行控制和传输图像。
所述的荧光激发系统可以根据样品中染料的激发或者染色特征进行选择适合的光源，如紫外波段可以选择经典的氘灯、氙灯、汞灯和紫外型LED，可见波段可以选择经典的氙灯、卤素灯、LED和激光等光源，也可以根据需要同时安装多个紫外光源和可见光源。荧光激发系统的光源透镜组可以将光源发出的光聚焦，通过棱镜、反射镜、光纤等光学部件将激发光的小光斑准确照射并完整覆盖摄像头读取区域，而且激发光以几乎垂直于样品的角度（80°、85°），以高能量的小光斑（直径1~3 mm）激发荧光染料，以获得良好的成像效果。使用光纤进行光传导，有利于降低系统复杂程度，便于实现光学系统整体移动。荧光激发系统通过一系列的透镜组、棱镜或光纤将光源发出的光以一定光强和角度照射样品激发其中染色剂发光，便于显微成像系统成像。
所述的滤光片系统，可以根据样品中荧光染料的激发波长、发射波长和发色波长等光学特征进行选择特定波长的滤光片。安装在荧光激发系统上的滤光片系统一有助于获得理想的样品中染料的激发光波，安装在显微成像系统上的滤光片系统二有助于获取较佳的样品发射图像和防止外界杂光的干扰。根据需求该设备可以选择安装多种滤光片，可以采用多通道的直列滤光片架、轮状滤光片架或者其他经典滤光片架的形式安装多种波长滤光片，滤光片的切换可以采用手动调整或程控调整。如果使用滤光片不透光的区域遮挡激发光，可以用来获取化学发光或自带荧光特性微粒的图像。滤光片系统通过承载的滤光片只让特定波长的光透过，显微成像系统处滤光片系统二有助于降低其他波长的光对成像及计数的干扰，荧光激发系统处滤光片系统一用于获得所需不同波长的激发光，有助于特定微粒进行快速计数以及快速分类计数。
所述的光学装置整体移动系统，将摄像头和光源牢固稳定地固定在金属（如铝合金材料）或者高分子材料制成的基座上，基座可以通过XY轴步进电机带动齿轮、蜗杆、丝杠等传动部件传动产生XY轴任意方向的水平移动，原理与显微镜的载物台的移动原理相同，移动精度可达0.1mm，以便获得符合数学统计要求的不同视野样本。光学装置整体移动系统避免了以往的移动样品池导致样品中微粒产生移动，影响计数准确性的缺陷。移动轨迹可以逐行逐列移动、经典血球计数法移动和随机移动等方式，移动方式也可以在控制软件中任意规定。光学装置整体移动系统在程序控制下将光学系统整体移动，用以获得多个计数视野。基座的移动具体为：X轴电机带蜗杆转动，带动光学装置整体移动系统在X轴上移动到指定位置，Y轴电机带蜗杆转动，带动光学装置整体移动系统在Y轴上移动到指定位置。
所述的样品承载系统，用于放置样品池7。样品池7底部为黑色低吸附材料构成，如黑色聚苯乙烯，黑色背景有助于提高显微成像系统成像的清晰程度和对比度。样品池7上部根据荧光染料光学特性选择透紫外或透可见光的光学材料构成，例如，选择光学聚苯乙烯材料，用于透过激发和发射光。样品池7底部和顶部可以通过超声焊接技术或者激光焊接技术粘合在一起，形成稳定的计数池，样品池内的底部和顶部之间缝隙根据所计数微粒的直径范围进行设计，间隙通常在计数微粒最大直径的2倍左右，有助于样品中的计数微粒以较为均匀的单层形式分布，便于准确计数。样品池7采用毛细现象原理进样。样品池7一次性使用杜绝了交叉污染带来的危害，提高了计数效率。
所述的数据计算系统通过单片机、平板电脑或者计算机收集、存储和分析显微成像系统传来的图像数据，运行算法对获得图像进行处理，按照指定微粒大小、形状、颜色来对样品中染色微粒数量进行分类和计数，并将结果输出。
实施例1：
利用本发明的系统可以对正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞进行区分计数。
吖啶橙是一种荧光色素，激发波长488 nm，可以和细胞中的DNA和RNA结合。溴化乙啶是一种荧光色素，激发波长302 nm，可以和细胞中的DNA结合。 吖啶橙与溴化乙啶合用双染，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。吖啶橙使其染上致密浓烈的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失，溴化乙啶只染死细胞使之产生桔黄色荧光，由此可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞。
（1）取0.2 mL含10％血清的细胞悬液，加入0.4mL冷Triton X-100 溶液混合振荡15s；
（2）加入1.2 mL柠檬缓冲液，充分混匀；
（3）加入0.4 mL吖啶橙染色液和溴化乙啶染色液后充分混匀，于10 min内，将样品滴入样品池，以毛细原理进样，激发波长为488 nm时，得到的图像中球形绿色或黄绿色均匀荧光为正常细胞；绿色或黄绿色大小不等的碎片为凋亡细胞。激发波长302 nm时，得到的图像中桔黄色荧光碎片为坏死细胞。