本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种基于单粒径并可同时检测血清和尿液样本中视黄醇结合蛋白的试剂盒。
背景技术：
：视黄醇结合蛋白(retinolbindingprotcin,rbp)为血液中视黄醇(维生素a)的转运蛋白。rbp主要由肝细胞合成，广泛分布于人体血清、脑脊液、尿液及其他体液中。在血液中，rbp与视黄醇、前白蛋白以1:1:1(mol)的复合物形式存在，转运体内90％的视黄醇至机体组织，当rbp与细胞表面的rbp受体结合时，视黄醇进入细胞内，复合物解体，游离的rbp从肾小球滤出，其中绝大部分被近端肾小管上皮细胞重吸收，并被分解。研究表明，视黄醇结合蛋白在高血压及糖尿病早期肾病的诊断中具有重要意义，可作为临床诊断高血压及糖尿病早期肾病的参考指标进行临床检测：(1)与肝病的关系：肝病患者血清中rbp显著低于正常人，且急性病毒性肝炎病程早期血清rbp含量降低较晚期更明显。血清rbp水平能准确、灵敏地反映肝功能变化；(2)与肾脏病的关系：rbp稳定性好，是一个比β2-mg更实用、可靠的肾功能指标，当肾小管功能受损时，尿中rbp可明显增高，较肌酐、尿素更准确灵敏；(3)与其它疾病关系：rbp水平是反映营养性疾病疗效的灵敏、特异性指标，甲亢患者rbp水平较正常人低，甲减患者rbp水平高于正常人。此外，当血清rbp低于正常一半时，患者才出现暗适应能力降低，提示血清rbp含量能更灵敏地反映维生素a缺乏症。临床上广泛使用的rbp检测方法有酶联免疫吸附eia、单向免疫扩散rid、免疫比浊等。酶联免疫吸附法的检测限较差，并且费时。单向免疫扩散主要是手工操作，试验重复性较差，检测的准确度不高，临床已经不再采用其为定量检测方法。目前临床进行大量样本检测常采用的方法是免疫比浊法，但由于信号低，即灵敏度低无法达到目前市场上要求的血尿同检。目前市场上有采用胶乳增强免疫比浊法测定rbp，基于双粒径的胶乳增强免疫比浊法、基于双单克隆抗体抗体胶乳增强免疫比浊法、基于一种单克隆抗体和一种多克隆抗体的胶乳增强免疫比浊法，虽然灵敏度足够高可以做到血尿同检，但由于试剂生产成本高，不利于市场推广。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是解决目前市场上检测灵敏度低(只能检测血清中rbp)或生产成本高(能同时检测血清和尿液中的rbp，但是基于双粒径的技术方案生产成本较高)的技术缺陷，提供一种基于单粒径并可同时检测血清和尿液样本中视黄醇结合蛋白的试剂盒。本发明所述试剂盒不仅提高了试剂灵敏度，还大大提高了测量范围，可以同时检测血液与尿液样本中的视黄醇结合蛋白含量，同时兼容市场上大多数生化检测设备，可直接进入市场。本发明解决上述技术问题所采用的技术手段为：一种基于单粒径并可同时检测血清和尿液样本中视黄醇结合蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括试剂r1、试剂r2和校准品a、校准品b，其中：所述试剂r1组分为：50～120mmhepes缓冲液、0.1％proclin300、1～5％nacl、0.1～1％曲拉通，其余为纯化水，ph6.5～8.5；所述试剂r2包括乳胶-多克隆抗体交联物和试剂r2缓冲液，所述乳胶-多克隆抗体交联物占所述试剂r2的质量百分比为0.05～1.0％，所述试剂r2缓冲液组分为：50～120mmhepes缓冲液、0.1％proclin300、1～5％蔗糖、1～5％nacl、0.1～1％曲拉通，其余为纯化水，ph为6.5～8.5；所述乳胶-多克隆抗体交联物采用胶乳颗粒和多克隆抗体制备得到；所述胶乳颗粒为粒径为80～200nm的聚苯乙烯胶乳；所述多克隆抗体与所述乳胶颗粒的比例为25～100μg:1mg；所述试剂r2是含有乳胶-多克隆抗体交联物的缓冲液；所述校准品a包括校准品a稀释液和视黄醇结合蛋白；所述校准品a稀释液组分为：50～150mmhepes缓冲液、0.1％proclin300、1～5％蔗糖、1～5％nacl、0.1～1％曲拉通，其余为纯化水，ph为6.5～8.5；所述视黄醇结合蛋白的浓度梯度为140.00、70.00、35.00、15.00、5.00、0.00mg/l；所述校准品b包括校准品b稀释液和视黄醇结合蛋白；所述校准品b稀释液组分为：50～150mmhepes缓冲液、0.1％proclin300、1～5％蔗糖、1～5％nacl、0.1～1％曲拉通，其余为纯化水，ph为6.5～8.5；所述视黄醇结合蛋白的浓度梯度为20.00、10.00、5.00、2.50、1.00、0.00mg/l。优选地，所述试剂r1组分为：80mmhepes缓冲液、0.1％proclin300、2％nacl、0.5％曲拉通，其余为纯化水，ph为7.0。优选地，所述试剂r2组分为：所述乳胶-多克隆抗体交联物占所述试剂r2的质量百分比为0.5％，所述试剂r2缓冲液组分为：80mmhepes缓冲液、0.1％proclin300、3％的蔗糖、2％nacl、0.5％曲拉通，其余为纯化水，ph为8.0。优选地，所述胶乳颗粒为粒径为130nm的聚苯乙烯胶乳。优选地，所述多克隆抗体与乳胶颗粒的比例为75μg:1mg。优选地，所述校准品a稀释液组分为：100mmhepes缓冲液、0.1％proclin300、3％的蔗糖、1％nacl、0.5％曲拉通，其余为纯化水，ph为8.0。优选地，所述校准品b稀释液组分为：100mmhepes缓冲液、0.1％proclin300、3％的蔗糖、1％nacl、0.5％曲拉通，其余为纯化水，ph为6.0。一种基于单粒径并可同时检测血清和尿液样本中视黄醇结合蛋白的试剂盒，所述试剂r2的制备方法为：(1)将粒径为80～200nm的胶乳颗粒用ph9.0的50mm硼酸缓冲液稀释到终浓度为1％，室温反应5min；(2)加入edc，使edc:胶乳＝10～150μg:1mg，室温反应30min；(3)加入兔抗人rbp多克隆抗体，使兔抗人rbp多克隆抗体:胶乳＝25～100μg:1mg，混合搅拌，室温反应1h；(4)加入bsa，使bsa终浓度为1％，室温封闭2h；(5)室温15,000rpm离心去除上清；(6)用50～120mmhepes缓冲液、0.1％proclin300、1～5％蔗糖、1～5％nacl、0.1～1％曲拉通，其余为纯化水，ph为6.5～8.5溶解所述步骤(5)中去除上清后的胶乳-兔抗人rbp多克隆抗体，使其终浓度为0.05～1.0％，超声分散后置于4℃备用。本发明还提供了一种将所述的试剂盒在血清和尿液样本中检测视黄醇结合蛋白的应用。上述技术方案中，所述％为重量百分率。本发明的基本原理：本发明采用单粒径胶乳增强免疫比浊法开发本产品，其基本原理是在单粒径的高分子胶乳微球的表面包被高效价的视黄醇结合蛋白多克隆抗体，当与视黄醇结合蛋白结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，产生一定的浊度，改变反应液透光性能，在一定抗体存在时，浊度的大小与样本中视黄醇结合蛋白的高低呈正比。在特定条件下取得校准曲线，将测定的样本浊度通过校准曲线算出样本中的视黄醇结合蛋白。与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下优点：本发明提供的基于单粒径胶乳和多克隆抗体开发的视黄醇结合蛋白检测试剂盒，具有血尿同测、操作简单、灵敏度高、线性范围宽、成本低(不仅体现在仅适用一种粒径和多克隆抗体就能满足检测要求，还体现在制备乳胶-多克隆抗体时仅离心一次就能满足标记需求)且利于市场推广的优点，能够达到现有技术中需要双粒径胶乳和至少一种单克隆抗体开发的视黄醇结合蛋白检测试剂盒的检测效果。同时该检测试剂盒兼容市场上大多数生化检测设备，可直接进入市场。附图说明图1为本发明试剂盒血清样本灵敏度测定评价结果图；图2为本发明试剂盒尿液样本灵敏度测定评价结果图；图3为本发明试剂盒血清样品线性范围测量图；图4为本发明试剂盒尿液样品线性范围测量图；图5为本发明试剂盒血清相关性评价结果图；图6为本发明试剂盒尿液相关性评价结果图。具体实施方式为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于对本发明进一步说明，而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容后，该领域的技术人员对本发明作出一些非本质的改动或调整，仍属于本发明的保护范围。本发明所涉及的化学试剂均为国产试剂。视黄醇结合蛋白(rbp)购自菲鹏生物科技股份有限公司。多克隆抗体(兔抗人rbp)购自安捷伦科技丹麦有限公司。胶乳购自jsrlifescience。实施例1试剂的配置1.1试剂r1的配置在试剂配置过程中，按照下表浓度进行配置，配置好后过0.22μm滤膜，置于4℃备用。组分配比一配比二配比三hepes/mm5080120proclin300/％0.10.10.1nacl/％125曲拉通/％0.10.51ph6.57.08.51.2试剂r2的配置1.2.1试剂r2缓冲液的配置在试剂配置过程中，按照下表浓度进行配置试剂r2缓冲液，配置好后过0.22μm滤膜，置于4℃备用。组分配比一配比二配比三hepes/mm5080120proclin300/％0.10.10.1蔗糖/％135nacl/％125曲拉通/％0.10.51ph6.57.08.51.2.2试剂r2的制备(1)将粒径为130nm的胶乳颗粒，用ph9.0为50mm硼酸缓冲液稀释到终浓度为1％，室温反应5min；(2)加入edc，使edc:胶乳＝75μg:1mg，室温反应30min；(3)加入兔抗人rbp多克隆抗体，使兔抗人rbp多克隆抗体:胶乳＝75μg:1mg，混合搅拌，室温反应1h；(4)加入bsa，使bsa终浓度为1％，室温封闭2h；(5)室温15,000rpm离心去除上清；(6)用试剂r2缓冲液溶解所述步骤(5)中去除上清后的胶乳-兔抗人rbp多克隆抗体，使其终浓度为0.50％，超声分散后置于4℃备用。1.3校准品a的配置在试剂配置过程中，按照下表浓度进行配置，配置好后过0.22μm滤膜，置于4℃备用。然后按照校准品a中视黄醇结合蛋白的浓度梯度为140.00、70.00、35.00、15.00、5.00、0.00mg/l的比例将rbp进行梯度稀释。组分配比一配比二配比三hepes/mm50100150proclin300/％0.10.10.1蔗糖/％135nacl/％115曲拉通/％0.10.51ph6.58.08.51.4校准品b的配置在试剂配置过程中，按照下表浓度进行配置，配置好后过0.22μm滤膜，置于4℃备用。然后按照校准品b中视黄醇结合蛋白的浓度梯度为20.00、10.00、5.00、2.50、1.00、0.00mg/l的比例将rbp进行梯度稀释。组分配比一配比二配比三hepes/mm50100150proclin300/％0.10.10.1蔗糖/％135nacl/％115曲拉通/％0.10.51ph6.56.08.5实施例2试剂盒检测过程2.1试验条件：主波长600nm反应方向正向反应温度37℃反应方法两点终点法2.2操作过程：在au480读点为11～27。实施例3灵敏度性能评价(以实施例1中配比2进行实验，并按照实施例2检测)3.1血清样本灵敏度测定评价以0.9％的nacl为空白样本，选取一份低值血清样本进行倍比稀释，配制出不同浓度(0、1、2、2.5、3mg/l)的样本，每个样本重复测定10次，计算均值和标准差，结果见下表和图1，从中可见，本发明试剂盒的对血清rbp的检测灵敏度为1mg/l。浓度(mg/l)0122.53stdv0.320.090.160.120.12average0.380.911.812.603.283sd0.960.280.490.350.37average-3sd/0.631.312.242.31average+3sd0.57////cv83％10％9％5％4％3.2尿液样本灵敏度测定评价以0.9％的nacl为空白样本，选取一份低值尿液样本进行倍比稀释，配制出不同浓度(0、0.05、0.10、0.15、0.20mg/l)的样本，每个样本重复测定10次，计算均值和标准差，结果见下表和图2，从中可见，本发明试剂盒的对尿液urbp的检测灵敏度为0.1mg/l。浓度(mg/l)00.050.100.150.20sd0.020.030.010.020.02average-0.020.080.100.360.493sd0.060.090.020.060.07average-3sd/-0.010.070.300.42average+3sd0.05////cv-129％37％7％6％5％实施例4线性性能评价(以实施例1中配比2进行实验，并按照实施例2检测)4.1血清线性评价用0.9％nacl按照1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0的稀释比例对高值rbp血清样本进行倍比稀释，每个浓度重复测定3次，计算其均值，将样品的测量值与稀释比例进行相关对比，求出回归方程，并通过回归方程计算样本的理论值，结果见图3，从图中可知，在样本浓度小于140mg/l的范围内能够保持保持良好的线性，即r2大于0.99。4.2尿液线性评价用0.9％nacl按照1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0的稀释比例对高值urbp尿液样本进行倍比稀释，每个浓度重复测定3次，计算其均值，将样品的测量值与稀释比例进行相关对比，求出回归方程，并通过回归方程计算样本的理论值，结果见图4，从图中可知，在样本浓度小于22mg/l的范围内能够保持保持良好的线性，即r2大于0.99。实施例5相关性评价(以实施例1中配比2进行实验，并按照实施例2检测)5.1血清相关性评价分别采用本发明试剂盒和西门子公司的试剂盒检测血清中rbp做相关性实验，使用au480全自动生化分析仪对40份人血清样本(包含正常和异常样本)进行测定，按照各自测定方法进行测定，对测定值进行相关分析，结果见图5(x、y轴均为测定值，单位mg/l)。由图中可知，本发明试剂盒和对照试剂盒的相关系数为r2＝0.9973，回归方程为y＝0.961x+0.6877。该结果表明本发明试剂盒与对照试剂盒具有很好的相关性、特异性和准确性。5.2尿液相关性评价分别采用本发明试剂盒和西门子公司的试剂盒检测尿液样本中urbp做相关性实验，使用au480全自动生化分析仪对40份人尿液样本(包含正常和异常样本)进行测定，按照各自测定方法进行测定，对测定值进行相关分析，结果见图6(x、y轴均为测定值，单位mg/l)。由图可知，本发明试剂和对照试剂的相关系数为r2＝0.9979，回归方程为y＝1.0033x+0.127。该结果表明本发明试剂与对照试剂具有很好的相关性、特异性和准确性。实施例6不同配比试剂实验评价(按照实施例2检测)6.1血清样本灵敏度评价6.1.1配比一浓度(mg/l)0122.53sd0.430.170.250.210.12average-0.160.921.792.303.273sd1.300.520.710.630.36average-3sd/0.391.081.672.91average+3sd1.14////cv-278％19％13％9％4％6.1.2配比二浓度(mg/l)0122.53stdv0.320.090.160.120.12average0.380.911.812.603.283sd0.960.280.490.350.37average-3sd/0.631.312.242.31average+3sd0.57////cv83％10％9％5％4％6.1.3配比三浓度(mg/l)0122.53sd0.520.130.220.280.30average-0.120.961.842.333.263sd1.560.380.670.850.89average-3sd/0.581.171.482.37average+3sd1.44////cv-449％13％12％12％9％从上述三个表中可知，测定血清样本，配比二的灵敏度最佳为1.0mg/l，配比一的灵敏度为2.5mg/l，配比三的灵敏度为3.0mg/l，因此，配比二相对于配比一和配比三为最佳配比。三个配比测定样本相关性和线性均符合要求。6.2尿液样本灵敏度评价6.2.1配比一浓度(mg/l)00.050.100.150.20sd0.060.030.030.010.01average-0.010.080.140.150.213sd0.180.100.080.040.04average-3sd/-0.020.060.110.17average+3sd0.16////cv-489％41％18％9％6％6.2.2配比二浓度(mg/l)00.050.100.150.20sd0.020.030.010.020.02average-0.020.080.100.360.493sd0.060.090.020.060.07average-3sd/-0.010.070.300.42average+3sd0.05////cv-129％37％7％6％5％6.2.3配比三浓度(mg/l)00.050.100.150.20sd0.040.040.040.020.02average0.010.090.200.190.203sd0.130.120.130.070.06average-3sd/-0.030.070.120.15average+3sd0.14////cv738％44％22％12％9％从上述三个表中可知，测定尿液样本，配比二的灵敏度最佳为0.1mg/l，配比一的灵敏度为0.2mg/l，配比三的灵敏度为0.2mg/l，因此，配比二相对于配比一和配比三为最佳配比。三个配比测定样本相关性和线性均符合要求。对比例1以实施例1中所述配比2配置试剂r2缓冲液，试剂盒的制备方法与实施例1所述试剂盒的制备方法基本相同，区别在于试剂r2中胶乳粒径有所不同(如下表所示，按照实施例2检测)。1.1血清样本灵敏度评价1.1.1配比一浓度(mg/l)0122.53sd0.430.210.220.170.14average-0.160.961.842.373.203sd1.300.630.670.510.43average-3sd/0.341.171.862.76average+3sd1.14////cv-278％22％12％7％5％1.1.2配比二浓度(mg/l)0122.53stdv0.320.090.160.120.12average0.380.911.812.603.283sd0.960.280.490.350.37average-3sd/0.631.312.242.31average+3sd0.57////cv83％10％9％5％4％1.1.3配比三浓度(mg/l)0122.53sd0.610.570.550.140.17average-0.340.781.712.273.213sd1.821.701.661.430.52average-3sd/-0.920.051.842.69average+3sd1.48////cv-177％73％32％6％5％从上述三个表中可知，测定血清样本，配比二的灵敏度最佳为1.0mg/l，配比一的灵敏度为2.5mg/l，配比三的灵敏度为2.5mg/l，因此，配比二相对于配比一和配比三为最佳配比。三个配比测定样本相关性和线性均符合要求。1.2尿液样本灵敏度评价1.2.1配比一浓度(mg/l)00.050.100.150.20sd0.060.030.020.010.01average-0.020.070.150.150.213sd0.190.100.060.030.03average-3sd/-0.020.080.120.18average+3sd0.17////cv-417％44％15％7％5％1.2.2配比二浓度(mg/l)00.050.100.150.20sd0.020.030.010.020.02average-0.020.080.100.360.493sd0.060.090.020.060.07average-3sd/-0.010.070.300.42average+3sd0.05////cv-129％37％7％6％5％1.2.3配比三浓度(mg/l)00.050.100.150.20sd0.050.290.040.030.02average-0.050.190.180.190.213sd0.140.870.110.090.05average-3sd/-0.680.070.110.16average+3sd0.13////cv-295％156％20％15％8％从上述三个表中可知，测定尿液样本，配比二的灵敏度最佳为0.1mg/l，配比一的灵敏度为0.2mg/l，配比三的灵敏度为0.2mg/l，因此，配比二相对于配比一和配比三为最佳配比。三个配比测定样本相关性和线性均符合要求。对比例2以实施例1中所述配比2配置试剂r2缓冲液，试剂盒的制备方法与实施例1所述试剂盒的制备方法基本相同，区别在于试剂r2中edc含量有所不同(如下表所示，按照实施例2检测)。2.1血清样本灵敏度评价2.1.1配比一浓度(mg/l)0122.53sd0.350.250.190.160.12average-0.270.921.892.43.153sd1.060.760.580.490.35average-3sd/0.161.311.912.80average+3sd0.79////cv-132％27％10％7％4％2.1.2配比二浓度(mg/l)0122.53stdv0.320.090.160.120.12average0.380.911.812.603.283sd0.960.280.490.350.37average-3sd/0.631.312.242.31average+3sd0.57////cv83％10％9％5％4％2.1.3配比三浓度(mg/l)0122.53stdv0.610.670.130.140.17average-0.340.611.962.273.213sd1.822.020.380.430.52average-3sd/-1.411.581.842.69average+3sd1.48////cv-177％110％6％6％5％从上述三个表中可知，测定血清样本，配比二的灵敏度最佳为1.0mg/l，配比一的灵敏度为2.0mg/l，配比三的灵敏度为2.0mg/l，因此，配比二相对于配比一和配比三为最佳配比。三个配比测定样本相关性和线性均符合要求。2.2尿液样本灵敏度评价2.2.1配比一浓度(mg/l)00.050.100.150.20sd0.040.030.020.010.01average-0.070.090.160.150.213sd0.130.100.070.020.03average-3sd/-0.010.090.130.18average+3sd0.07////cv-66％38％15％5％5％2.2.2配比二浓度(mg/l)00.050.100.150.20sd0.020.030.010.020.02average-0.020.080.100.360.493sd0.060.090.020.060.07average-3sd/-0.010.070.300.42average+3sd0.05////cv-129％37％7％6％5％2.2.3配比三浓度(mg/l)00.050.100.150.20sd0.040.040.040.020.02average-0.010.100.180.170.213sd0.110.110.110.050.05average-3sd/-0.010.070.120.16average+3sd0.10////cv-522％38％20％10％8％从上述三个表中可知，测定尿液样本，配比二的灵敏度最佳为0.1mg/l，配比一的灵敏度为0.15mg/l，配比三的灵敏度为0.15mg/l，因此，配比二相对于配比一和配比三为最佳配比。三个配比测定样本相关性和线性均符合要求。对比例3以实施例1中所述配比2配置试剂r2缓冲液，试剂盒的制备方法与实施例1所述试剂盒的制备方法基本相同，区别在于胶乳-多克隆抗体配比及在试剂r2中所占比例有所不同(如下表所示，按照实施例2检测)。3.1血清样本灵敏度评价3.1.1配比一浓度(mg/l)0122.53sd0.200.270.200.170.11average-0.290.981.912.433.143sd0.610.800.590.510.33average-3sd/0.191.321.922.80average+3sd0.31////cv-69％27％10％7％4％3.1.2配比二浓度(mg/l)0122.53stdv0.320.090.160.120.12average0.380.911.812.603.283sd0.960.280.490.350.37average-3sd/0.631.312.242.31average+3sd0.57////cv83％10％9％5％4％3.1.3配比三浓度(mg/l)0122.53sd0.170.490.150.130.17average-0.210.671.962.273.173sd0.521.480.450.380.50average-3sd/-0.811.511.902.67average+3sd0.31////cv83％74％8％6％5％从上述三个表中可知，测定血清样本，配比二的灵敏度最佳为1.0mg/l，配比一的灵敏度为2.0mg/l，配比三的灵敏度为2.0mg/l，因此，配比二相对于配比一和配比三为最佳配比。三个配比测定样本相关性和线性均符合要求。3.2尿液样本灵敏度评价3.2.1配比一浓度(mg/l)00.050.100.150.20sd0.090.040.030.010.01average0.020.080.160.150.213sd0.260.110.080.030.02average-3sd/-0.030.080.120.19average+3sd0.28////cv581％45％17％6％9％3.2.2配比二浓度(mg/l)00.050.100.150.20sd0.020.030.010.020.02average-0.020.080.100.360.493sd0.060.090.020.060.07average-3sd/-0.010.070.300.42average+3sd0.05////cv-129％37％7％6％5％3.2.3配比三浓度(mg/l)00.050.100.150.20sd0.030.030.030.020.01average-0.020.100.170.170.213sd0.080.100.090.060.03average-3sd/0.000.070.110.19average+3sd0.06////cv-127％32％19％12％5％从上述三个表中可知，测定尿液样本，配比二的灵敏度最佳为0.1mg/l，配比一的灵敏度为0.15mg/l，配比三的灵敏度为0.2mg/l，因此，配比二相对于配比一和配比三为最佳配比。三个配比测定样本相关性和线性均符合要求。上述说明并非对发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本
技术领域：
的普通技术人员在发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。当前第1页12