基于扫描振镜的共聚焦与环形全内反射双模式显微镜系统的制作方法

本发明属于超分辨显微成像领域，尤其涉及基于扫描振镜的共聚焦与环形全内反射双模式显微镜系统。

背景技术

在生物学的研究中，不仅要求实时成像，还要求分辨率高，这就对显微镜的性能提出了很高的要求。正是因为有这种需要，许多的研究人员致力于开发一种即可以突破衍射极限，同时又可以实时成像的超分辨显微镜。荧光显微镜的衍射极限受到两个光路衍射极限的限制，即激发光的衍射极限和发射光的衍射极限。而要突破衍射极限，可以考虑突破激发光的衍射极限或者突破发射光的衍射极限。如果考虑激发光的衍射极限，这类别的超分辨显微镜有fed(fluorescenceemissiondifference，荧光激发差分)显微镜、sfed显微镜、tp-fed显微镜、sted(stimulatedemissiondepletion，受激发射损耗)荧光显微镜等；如果考虑发射光的衍射极限，这类别的超分辨显微镜有共聚焦显微镜，针孔相加再相减fed等；如果考虑两种光路的衍射极限，这类显微镜有同时擦除(sted)再减去短寿命光子(g-sted)显微镜等。

激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源，点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小光点，该点被照射后发出的荧光被显微物镜收集，并沿原照射光路回送到二向色镜。双向色镜将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。两者的几何尺寸一致，并且相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这样来自焦平面的光，可以会聚在探测孔之内成像，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上重建出清晰的整个焦平面的共聚焦图像。

还有一种针对于薄层样品成像的显微镜，即环形全内反射荧光显微镜。通过使用超过临界角的入射光束，可以形成指数衰减的倏逝波，从而抑制了深层信号的干扰，实现100nm左右的薄层高信噪比成像。因此全内反射显微镜常被用于观察细胞表面生物过程的观察，比如囊泡的内吞和外排、细胞骨架的动态建模、细胞膜表面的神经递质传递等。传统单个方位角入射的全内反射显微镜由于照明不均匀而引入一些散斑(干涉条纹等)。为了消除散斑影响，360°方位角照明的全内反射显微镜被提出，每一张图像均是360°照明角度积分平均所得，这种显微镜就是环形全内反射荧光显微镜。

由于激光扫描共聚焦显微镜和环形全内反射荧光显微镜这两类都被广泛使用，因此可以将这两类显微镜通过设计组合在一起形成一套全新的系统。

技术实现要素：

本发明提供了一种基于扫描振镜的共聚焦与环形全内反射荧光显微镜双模式显微镜系统，该显微镜系统只需使用一套扫描振镜，即可完成共聚焦的点扫描成像，也可完成环形全内反射荧光显微镜的宽场成像。该种方法和装置具有装置简单、操作方便等特点。

本发明提供的基于扫描振镜的共聚焦与环形全内反射荧光显微镜双模式显微镜系统，包括光源，同时，具有设置在光路上的可移动的第一二向色镜以及驱动第一二向色镜移动的驱动器，用于分离激光扫描共聚焦显微镜系统的激发光和荧光信号；具有设置在位于可移动的第一二向色镜的透射光路的二维扫描振镜和反射光路的滤波片，二维扫描振镜系统用于实现激光扫描共聚焦显微镜的点扫描和环形全内反射荧光显微镜系统改变激光入射方位角，滤波片用于滤除杂散光；具有设置在透射光路的可移动第一反射镜以及用于驱动第一反射镜移动的驱动器，用于选择激光扫描共聚焦显微镜系统或环形全内反射荧光显微镜系统；具有设置在透射光路的可移动的第二二向色镜以及驱动第二二向色镜移开的驱动器，用于分离环形全内反射荧光显微镜系统的激发光和荧光信号；具有设置在透射光路的可旋转第二反射镜以及驱动第二反射镜转动180度的驱动器，用于使激光扫描共聚焦显微镜系统的激发光和荧光信号改变90度的方位角或者环形全内反射荧光显微镜系统的荧光信号改变90度的方位角；还具有与二维扫描振镜系统、驱动器以及探测器通讯连接的处理控制器。

本申请具有激光扫描共聚焦显微镜模式和环形全内反射荧光显微镜系统模式，所述第一二向色镜的反射光路上设有第一荧光探测器；所述第一二向色镜的透射光路上依次设有：二维扫描振镜，可移动的第一反射镜和可旋转的第二反射镜；具有设置在所述第一反射镜和第二反射镜的反射光路上的可移动的第二二向色镜和样品台；以及位于第二反射镜反射光路上的第二荧光探测器；并设有控制所述第一二向色镜、二维扫描振镜、第一反射镜和第二反射镜以及与所述第一荧光探测器和第二荧光探测器连接的处理控制器；

在处于激光扫描共聚焦显微镜模式时，控制所述的第一反射镜和第二二向色镜从光路上移开，透过第一二向色镜的激发光经第二反射镜反射后投射到样品台，产生的荧光原路返回经第一二向色镜进入第一荧光探测器；

在处于环形全内反射荧光显微镜系统模式时，控制第一二向色镜移出光路和调整第一反射镜和第二反射镜的反射方向，由二维扫描振镜出射的激发光经第一反射镜和第二二向色镜反射后投射到样品台，产生的荧光透过第二二向色镜，由第二反射镜反射进入第二荧光探测器。

本发明中，所述的第一反射镜、第一二向色镜和第二二向色镜的运动轨迹为垂直光路方向平移。采用第一二向色镜、第一反射镜、第二反射镜和第二二向色镜的移动或旋转实现激光扫描共聚焦显微镜和环形全内反射荧光显微镜的切换；处理控制器可控制二维扫描振镜系统进行扫描改变激光扫描共聚焦显微镜的激发光扫描样品位置和改变环形全内反射荧光显微镜的激发光入射方位角，也控制第一二向色镜、第一反射镜、第二反射镜和第二二向色镜的移动和旋转，同时收集激光扫描共聚焦显微镜探测器的信号和环形全内反射荧光显微镜探测器的信号，并对采集到的激光扫描共聚焦显微镜的信号进行后期数据处理和算法重构和环形全内反射荧光显微镜的信号进行后期数据处理，得到二维超分辨图像并将其显示在显示屏上。

本发明的显微镜系统中，用于共聚焦显微镜系统的荧光探测器是pmt，即光电倍增管，光电倍增管是可将微弱光信号通过光电效应转变成电信号并利用二次发射电极转为电子倍增的电真空器件。光电倍增管接收的荧光信号传输到处理控制器进行后续的处理，最后重构恢复出样品图像并将其显示在显示屏上。

本发明的显微镜系统中，用于环形全内反射荧光显微镜显微镜系统的第一荧光探测器是ccd，ccd是电荷耦合器件，一种用电荷量表示信号大小，用耦合的方式传输信号的探测元件。ccd接收的图像传输到处理控制器进行后续的处理之后，将显示在显示屏上。

具体的方案为探测光路模块包括：用于收集样品发出的荧光信号的显微物镜；激光扫描共聚焦显微镜系统具有用于透射入射光、反射荧光的第一二向色镜；用于接收二向色镜反射的荧光信号的pmt，即第二荧光探测器；二向色镜和pmt之间依次设置有用于滤去杂散光的滤波片和用于将样品发出的荧光信号耦合到光纤中的透镜；环形全内反射荧光显微镜系统用于透射入射光、反射荧光的第二二向色镜；用于接收二向色镜反射的荧光信号的ccd。

显微物镜为了能使得入射光发生全内反射并最大限度的收集样品发出的荧光信号，宜采用较大数值孔径。

再一个具体的方案为光源为激光器；激光器与第一二向色镜之间依次设置有用于对激光器发出的激发光光束进行滤波的单模光纤以及对单模光纤中的激光光束进行准直和扩束的准直透镜；二维扫描振镜系统与透射路的第一反射镜间设置有用于聚焦从二维扫描振镜系统出射的激发光束的扫描透镜；第二反射路反射镜前后设置有用于转移物像关系使入射光束聚焦在显微物镜后瞳面相对位置的4f系统。

基于扫描振镜的共聚焦与环形全内反射荧光显微镜的双模式显微镜系统，包括以下步骤：

1)当用于激光扫描共聚焦成像时，第一二向色镜、第一反射镜、第二反射镜和第二二向色镜需要的操作是：

a)激光准直镜后面的第一二向色镜需保留在光路中，一方面是将激发光透射到二维扫描平台上，另一方面是将荧光信号反射到滤波片上；

b)扫描透镜后的第一反射镜需要移开，使激发光直接到达场镜；

c)第二二向色镜需移开，以便激发光直接到达显微物镜和荧光信号直接到达反射镜；

d)第二反射镜需要向左偏转，以便将激发光送到显微物镜上和将荧光信号送到场镜上；

2)当用于环形全内反射荧光显微镜成像时，虚线框内的第一二向色镜、第一反射镜、第二反射镜和第二二向色镜需要的操作是：

a)激光准直镜后面的第一二向色镜需要移开，减少激发光的损耗；

b)扫描透镜后的第一反射镜需要保留在光路中，以便将激发光反射到场镜上；

c)第二二向色镜需保留在光路中，一个方面是用于将激发光反射到物镜上，进而到达样品激发荧光，另一个方面是将荧光信号透射到达反射镜，进而使ccd成像；

d)第二反射镜需要向右偏转，需要将荧光信号送到成像透镜成像在ccd的感光面上；

本发明的显微镜系统中，要求激光准直镜后面的第一二向色镜、扫描透镜后的第一反射镜、第二二向色镜和二向色镜下方的第二反射镜是可以移动的。

本发明原理如下：

当物质被某种波长的入射光照射，电子吸收光子后被激发，立即向低能级跃迁并发出光子，发射光比入射光的波长要长，频率低。停止光照射后，发光现象随即消失，这种发射光被称为荧光。可以利用荧光染料将样品进行荧光标记，然后通过激发光照射样品使样品被照射的部分激发荧光，再荧光导入探测器，进而对样品进行成像。

全内反射的原理：全内反射是一种普遍存在的光学现象。一束平面波从折射率为n1的介质进入到折射率为n2的介质中，入射光在界面上一部分发生反射，另一部分则发生透射。入射角θ1和透射角θ2之间要满足snell定律：

n1sinθ1＝n2sinθ2

入射角当θ1足够大的时候，使得sinθ2＝(n1sinθ1)÷n2＞1，由于sin函数不可能存在大于1的情况，因此在介质2中的无透射光存在，而只在介质1中有反射光存在，这就是全反射，使sinθ2＝(n1sinθ1)÷n2＝1时的θ1的角度称为临界角θc。虽然在介质2中无透射光存在，但是在介质2的表面很薄的一层中存在着一种倏逝波，它的频率和入射波的频率一样，其强度(单位面积和单位时间的能量)随着离开界面的垂直距离而呈指数衰减，i(z)＝i(0)e^-z/d。

全内反射荧光显微镜显微镜就是使入射的激发光的入射角大于临界角，然后在样品表面形成倏逝场对样品表面进行薄层照明，进而激发荧光，荧光被显微物镜收集。这种薄层照明抑制了深层信号的干扰，分辨率更高，用于观察细胞表面生物过程。荧光信号透射过二向色镜被反射镜反射后，被成像透镜成像在探测器上。为了照明均匀消除散斑，0-360°范围内多个方位角照明的全内反射显微镜被提出，每一张图像均是多个照明角度得到的图像积分平均所得，即环形全内反射荧光显微镜。

全内反射荧光显微镜是一种在单分子层次上直接对生物结构或化学结构成像的方法。与传统的荧光显微成像方法相比，单分子成像方法的优势和不同之处在于，其直接在分子级别上进行荧光标记，并且采用低背景、高灵敏度的成像记录方法，以大大提高荧光成像的信噪比，实现对单分子级别的荧光成像。

共聚焦显微镜的成像原理：激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源，点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被显微物镜收集，并沿原照射光路回送到二向色镜。荧光光束二向色镜反射到聚焦透镜聚焦后被探测器接收。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。两者的几何尺寸一致，并且相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的荧光信号，转为数字信号传输至处理控制器进行数据的处理和图像的重构，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。

相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果：

(1)使用一套显微镜系统实现宽场和小视场的成像，节约了成本；

(2)简化了显微镜结构，只需使用一套扫描振镜系统就可以完成激光扫描共聚焦显微镜的扫描和环形全内反射荧光显微镜的扫描；

(3)装置简单，操作方便。

附图说明

图1为本发明基于扫描振镜的共聚焦与环形全内反射荧光显微镜的双模式显微镜系统的结构示意图；

图2为本发明中一种激光扫描共聚焦显微镜系统的结构示意图；

图3为本发明中环形全内反射荧光显微镜显微镜系统的结构示意图；

图4为本发明中环形全内反射荧光显微镜显微镜系统照明的示意图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。

如图1所示，基于扫描振镜系统的共聚焦和环形全内反射荧光显微镜显微镜系统由两部分组成。

第一个部分包括将光纤出射的激发光进行准直和扩束的准直透镜3，透射激发光和反射荧光的二向色镜4，滤除杂散光的滤波片5，将荧光耦合到光纤中的聚焦透镜6，扫描样品的二维扫描系统8，消除二维扫描系统8形成的畸变和将激发光聚焦于焦点的fθ透镜9，用于组成4f系统的场镜14和16，用于与显微物镜组成4f系统的场景11，用于选择显微镜工作模式的反射镜10，用于反射激光扫描共聚焦显微镜的激发光和荧光以及用于反射环形全内反射荧光显微镜的荧光的反射镜12，用于反射环形全内反射荧光显微镜激发光的反射镜15，用于反射环形全内反射荧光显微镜激发光和透射荧光的二向色镜17。

第二部分包括激光器1，用于滤波的单模光纤2，用于收集激光扫描共聚焦显微镜的荧光信号的探测器pmt7和用于环形全内反射荧光显微镜成像的探测器21ccd，显微物镜18，样品19和处理控制器20。

四个虚线框内(二向色镜4、二向色镜17、反射镜10和反射镜12)的器件表示可移动或旋转。

单模光纤2、准直透镜3，二向色镜4和二维扫描系统8依次位于激光器1出射光束的光轴之上；准直透镜3的光轴与垂直方向平行。

fθ透镜9，反射镜10，场镜11和反射镜12依次位于经二维扫描系统8反射后光束的光轴之上；fθ透镜9的光轴与水平方向平行。

滤波片5和聚焦透镜6依次位于经二向色镜4反射后光束的光轴之上；滤波片5的光轴与水平方向平行。

场镜14和反射镜15依次位于经反射镜10反射后光束的光轴之上；场镜14的光轴与垂直方向平行。

场镜16和二向色镜17依次位于经反射镜15反射后光束的光轴之上；场镜16的光轴与水平方向平行。

反射镜12，二向色镜17，显微物镜18和样品19依次位于一条光轴之上；显微物镜18的光轴与垂直方向平行。

处理控制器20一方面控制二维扫描振镜系统进行扫描以改变激光扫描共聚焦显微镜的激发光扫描样品的位置和改变环形全内反射荧光显微镜的激发光的入射方位角，另一方面控制二向色镜4、反射镜10、反射镜12和二向色镜17的移动和旋转，同时收集激光扫描共聚焦显微镜探测器的信号和环形全内反射荧光显微镜探测器的信号，并对采集到的激光扫描共聚焦显微镜的信号进行后期数据处理和算法重构以及对环形全内反射荧光显微镜的信号进行后期数据处理，得到二维超分辨图像并将其显示在显示屏上。

当使用共聚焦显微镜系统时，其显微镜系统和图2的激光扫描共聚焦显微镜系统相似(只是本发明使用了光纤，光纤代替了针孔2和7)，在图2中，激光器1发出的激光经过针孔2后在经过准直透镜3形成平行光到达二向色镜4，被二向色镜4透射进入二维扫描系统9，激光两次反射之后通过fθ透镜10将光束经过二维扫描系统9的桶形畸变和枕形畸变消除并同时将光束聚焦在焦点。激光经过场镜11到达反射镜12，激光被反射到显微物镜13后焦面，然后通过显微物镜将激光聚焦在显微物镜焦面即样品14上，激光被显微物镜聚焦于样品上的一个点，因此要得到完整的样品图像，必须对样品进行扫描，完成对样品扫描功能的器件是二维扫描振镜系统。显微物镜13和场镜11组成4f系统，且fθ透镜10和场镜11的焦点重合，因此显微物镜13的后焦面与fθ透镜10的焦平面共轭，激光通过二维扫描振镜系统在fθ透镜10的焦平面扫描相当于在样品上扫描；激发光激发的荧光原路返回到二向色镜4上，被二向色镜反射都滤波片5上，滤波片的作用是滤除杂散光。荧光聚焦透镜6之后再经过针孔7进入探测器pmt8。由于针孔2平面和针孔7平面共轭，因此显微物镜焦平面上的点同时聚焦于针孔2与针孔7，只有焦平面的光才能通过针孔7，焦平面以外的散射光并不能通过针孔7，即不会在针孔7处成像，因此非观察点的背景呈黑色，反差增加，成像清晰，这就是共聚焦的由来。

在本发明系统中，共聚焦显微镜系统原理参照图2的解释，还需要注意的是要移动图1的一些器件。根据上面图2的解释，反射镜10需要移开，二向色镜14需要移开。反射镜12的斜面需要偏向左边，使显微物镜出射的荧光信号被反射到聚焦透镜13上。

当使用环形全内反射荧光显微镜显微镜系统时，其显微镜系统和图3的环形全内反射荧光显微镜显微镜系统相似，不同之处在于多了反射镜10和15，具体的步骤通过图3进行说明。激光器1发射的激光被单模光纤滤波之后被准直透镜3扩束和准直。二维扫描振镜系统4将激光在以不同的偏转角输出，输出的激光通过fθ透镜5将扫描产生的畸变消除，然后激光聚焦在fθ透镜5的焦平面上，由于不同的时间二维扫描振镜系统4输出的激光的偏转角不一样，因此激光聚焦在fθ透镜5的焦平面上的位置随时间不一样。由于fθ透镜5的焦点与场镜6的焦点重合，因此场镜6的出射激光平行于光轴。场镜7和场镜6的参数是完全一致，它们的焦点也重合，组成4f系统。4f系统出射的激光经过二向色镜8被反射聚焦于显微物镜9后焦面，由于物镜后焦面与fθ透镜5的焦平面共轭，因此激光在fθ透镜5的焦平面扫描就相当于在物镜后焦面扫描。其中激光扫描的轨迹是一个圆环，且必须保证到平行光出射到样品10上的入射角大于临界角。激光扫描是为了形成均匀场照明来消除散斑。激发的荧光信号经过显微物镜9后到达二向色镜8，被二向色镜8透射到反射镜11上，被反射镜反射到成像透镜后成像于探测器13ccd上，ccd将图像传给处理控制器14进行处理和显示。

在本发明系统中，环形全内反射荧光显微镜显微镜系统原理参照图3的解释，还需要注意的是要移动图1的一些器件。根据上面图3的解释，二向色镜4需移开，反射镜10需留在光路中，使激发光被反射于场镜14上，二向色镜17要留在光路中，实现对激发光的反射和荧光信号的透射，反射镜12的斜面需要偏向右边，使荧光信号反射到成像透镜后成像于探测器21ccd上。

图4表示环形全内反射荧光显微镜的照明示意图。激发光通过二维扫描振镜系统被循环聚焦在显微物镜1的后焦面上，轨迹为a、b、d和c四个点形成的环。激发光经过显微物镜1将其准直扩束为平行光照射于样品上，必须保证入射到样品上的平行光的入射角大于临界角，可以通过调节激发光聚焦到显微物镜后焦面的位置来调节入射于样品表面的入射角。聚焦于显微物镜后焦面的位置越偏离显微物镜中心，入射到样品表面的入射角越大。

参见图1，本实施例的基于扫描振镜的共聚焦与环形全内反射双模式显微镜系统，工作流程如下：

1、当用作激光扫描共聚焦显微镜时：

a)通过处理控制器20设置将反射镜10和二向色镜17移开，将反射镜12斜面方向偏向左边；

b)打开激光器的电源、二维扫描振镜的电源和探测器的电源，通过处理控制器使激光器、二维扫描振镜和探测器开始工作；

c)显示屏显示探测器收集到的荧光信号经过处理和重构的图像。

2、当用作环形全内反射荧光显微镜时：

a)通过处理控制器20设置将和二向色镜14移开，将反射镜12斜面方向偏向右边；

b)打开激光器的电源、二维扫描振镜的电源和探测器的电源，通过处理控制器使激光器、二维扫描振镜和探测器开始工作；

c)显示屏显示探测器收集到的样品图像信息经过处理后的图像。

以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。