本发明涉及检测过敏原的方法，尤其是涉及一种鱼类过敏原小清蛋白的金磁酶联免疫检测方法。
背景技术
鱼类是人类重要的食物来源，味道鲜美且营养丰富，新鲜鱼肉中富含15％～20％的全价蛋白，1％～10％的脂肪，并富含不饱和脂肪酸，鱼类含无机盐1～2％，包括钙、磷、钾、铜、锌、硒等。海鱼含碘特别丰富，每kg鱼类含碘达500～1000μg，淡水鱼含碘为50～400μg；鱼类特别是鱼肝含有极丰富的维生素a、维生素bl、维生素b2、维生素d以及烟酸。我国是水产养殖大国,占世界养殖水产品产量的70％以上，淡水渔业总面积达1760万公顷，占国土面积的1.8％。我国海关总署统计,2016年我国水产品进出口总量827.91万吨，进出口总额301.12亿美元。可见渔业的发展，给国家经济带来巨大的效益。
食物过敏也称为食物变态反应或消化系统变态反应、过敏性胃肠炎等，是由于某种食物或食品添加剂等引起的ige介导和非ige介导的免疫反应，而导致消化系统内或全身性的变态反应。鱼类是世界粮农组织指出的八大过敏原食物之一，因食用鱼类导致过敏的事件时有发生,过敏疾病给广大人群带来的巨大的困扰。鱼类过敏可导致患者出现皮肤红肿、哮喘、鼻炎等过敏性症状，严重时还伴随着虚脱、休克，甚至危及生命，严重影响着过敏人群的身体健康和生活质量。
鱼类中的主要过敏原是pv，pv主要存在于鱼的白色肉中，是一种钙离子结合的酸性蛋白，分子大小大约在10～12kd左右。鱼类及其加工制品种类日益丰富，适用人群年龄范围逐渐扩大。然而当下，对于小清蛋白的检测还是停留在实验研究阶段，对于怎样快速、方便、准确的检测鱼类过敏原pv对于人类来说则显得越来越重要。目前，检测鱼类主要过敏原pv的手段有荧光标记抗体法(专利号：201210153421.9)、生物素标记抗体检测法(专利号：201110196761.5)、快速免疫磁珠层析法(专利号：201010521189.0)、毛细管电泳检测法(专利号：201610236444.4)。上述检测手段操作繁琐，例如：实时荧光pcr技术对操作人员技术要求较高同时易出现假阳性，毛细管电泳检测法需要使用阴离子交换柱和电泳；有的检测手段最低检测限有待提高，例如：免疫磁珠层析法对pv的最低检测限为0.16mg/ml。
技术实现要素：
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种鱼类过敏原小清蛋白的金磁酶联免疫检测方法。
本发明检测方法具有高效、便捷、准确的特性，在实际现场快速检测中具有重要意义。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种鱼类过敏原小清蛋白的金磁酶联免疫检测方法，包括以下步骤：利用金磁免疫探针与酶标抗原以及不同浓度的鱼类小清蛋白进行混合，所述金磁免疫探针由金磁复合纳米粒子与单克隆抗体组成，使其相互竞争单克隆抗体，一段时间后，使用磁块使其磁性分离，使用tmb作为显色底物，硫酸作为终止液终止反应，检测不同浓度鱼类小清蛋白混合下，混合上清液的吸光值；
不同浓度的鱼类小清蛋白与酶标抗原的竞争力不同，其抑制酶标抗原与金磁探针上抗体的结合的能力也不同。以抑制率(％)作为纵坐标，添加鱼类小清蛋白浓度的对数值作为横坐标，绘制标准曲线，通过od值的测定，即可达到检测待测样品中过敏原小清蛋白含量的目的。
所述鱼类小清蛋白的提取和纯化的制备步骤：
取鱼肌肉绞成肉糜，采用热抽提法，将其均质后以抽提液提取，离心，取上清煮沸，离心，取上清，加入饱和度60％硫酸铵溶液搅拌，静置后离心，取上清加入饱和度100％硫酸铵搅拌，静置后离心，取沉淀，最后将沉淀溶解于超纯水中，透析过夜，得到鱼类小清蛋白。
一个可选取的实施方式为：取鱼肌肉绞成肉糜，采用热抽提法，将其均质后以抽提液提取，离心10000rpm，4℃，20min，取上清煮沸10min，离心，取上清，加入饱和度60％硫酸铵溶液搅拌30min，静置1h后离心，取上清加入饱和度100％硫酸铵搅拌30min，静置1h后离心，取沉淀，最后将沉淀溶解于超纯水中，透析过夜，得到鱼类小清蛋白。
所述金磁复合纳米粒子为fe3o4-pei-au1-pei-au2，是在fe3o4-pei的表面通过静电吸附包被少量的au颗粒，制备fe3o4-pei-au1复合纳米微粒；重复以上反应吸附第二层金，即fe3o4-pei-au1-pei-au2。
所述金磁免疫探针的制备方法为：取金磁复合纳米粒子溶于pbs缓冲液中，洗数遍，然后向其中加入单克隆抗体，震荡反应，反应结束后吸取上清液，用pbst缓冲液洗三遍，加入3％bsa的pbs，封闭，pbst洗涤液冲洗后，溶于pbs缓冲液中，即得到所述金磁免疫探针。
一个可选取的实施方式为：取5mg金磁复合纳米粒子溶于5ml0.01m，ph7.5的pbs缓冲液中，洗三遍，然后向其中加入权利要求2中制备的单克隆抗体，37℃震荡反应60min，反应结束后吸取上清液，测定od280值，用0.01m，ph7.4的pbst缓冲液洗三遍，加入2ml3％bsa的pbs在37℃封闭2h，pbst洗涤液冲洗3遍后，溶于5mlpbs缓冲液中，使其浓度为1mg/ml，即得到所述金磁免疫探针，以留使用。
所述单克隆抗体采用以下方法制备得到：
第一步，动物的免疫，初步得到免疫抗体，
第二步，细胞融合，杂交瘤细胞的筛选和纯化，体外获得产生抗体的细胞株，
第三步，腹水抗体的获得，体内获得最终单克隆抗体。
动物的免疫，初步得到免疫抗体采用以下方法：
使用纯化后pv(parvalbumin)免疫4只雌性4-6周小鼠，每次100ug/只，第1次采用福氏完全佐剂，与蛋白液等体积混匀，后4次免疫采用福氏不完全佐剂，每2周免疫1次，测定小鼠血清效价，取免疫效果最佳者于融合前3d用，纯化后pv(parvalbumin)蛋白尾腹腔注射加强免疫(100g)，免疫3次后，经尾静脉采血测定血清中抗体效价，以便杂交瘤的培养、筛选。
细胞融合，杂交瘤细胞的筛选和纯化，体外获得产生抗体的细胞株的方法如下：
分别收集免疫小鼠脾细胞和sp2/0骨髓瘤细胞以约1：5的比例在50％聚乙二醇作用下诱导细胞融合，融合后的细胞沉淀用10ml无血清培养液轻悬终止peg的作用，1000r/min离心5min，将细胞团轻悬于120mlhat选择培养液中，铺于96孔培养板，每孔100ul，置于37℃，5％co2培养箱中培养，1周后显微镜下可观察到细胞团，无菌条件下将培养板每孔的单个细胞团吸起放入96孔板ht培养液中，继续培养，当96孔板中细胞长至视野1/3时，间接elisa法进行检测细胞上清效价，阳性孔用有限稀释法进行亚克隆，连续三次亚克隆呈阳性的细胞孔进行扩大培养。
腹水抗体的获得，体内获得最终单克隆抗体的方法如下：
向6周龄以上balb/c小鼠腹腔注射0.5ml/只石蜡，诱导1周后腹腔注射杂交瘤细胞，7-10d后可产生腹水，收集腹水后使用辛酸-硫酸铵法对收集腹水进行纯化，最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)、蛋白免疫印迹法(western-blot)以及商业化试剂盒检测纯化后单克隆抗体纯度、特异性与抗体亚型。
所述酶标抗原制备方法为：使用过碘酸钠氧化法，将小清蛋白过敏原使用辣根过氧化物酶(hrp)进行酶标，以留使用。
本发明金磁酶联免疫检测方法，ic50为40.1ng/ml，lod为2.8ng/ml，对小清蛋白检测的批内变异系数为4.3％-9.6％，批间变异系数为5.5％-11.7％，此外该方法与食品中其它主要过敏原蛋白交叉反应率均小于1％。表明该检测方法重复性良好，特异性较强。
与现有技术相比，本发明检测体系可以提高检测灵敏度和特异性，在食品安全检测中有重要的实际应用价值。
附图说明
图1是经过纯化后的鲫鱼小清蛋白电泳图谱；
图2是经过纯化的鲫鱼小清蛋白单克隆抗体电泳图谱；
图3是鲫鱼小清蛋白单克隆抗体western-blot显影图；
图4是金磁酶联免疫体系标准曲线。
具体实施方式
一种鱼类过敏原小清蛋白的金磁酶联免疫检测方法，包括以下步骤：
利用金磁免疫探针与酶标抗原以及不同浓度的鱼类小清蛋白进行混合，所述金磁免疫探针由金磁复合纳米粒子与单克隆抗体组成，使其相互竞争单克隆抗体，一段时间后，使用磁块使其磁性分离，使用tmb作为显色底物，硫酸作为终止液终止反应，检测不同浓度鱼类小清蛋白混合下，混合上清液的吸光值；
不同浓度的鱼类小清蛋白与酶标抗原的竞争力不同，其抑制酶标抗原与金磁探针上抗体的结合的能力也不同。以抑制率(％)作为纵坐标，添加鱼类小清蛋白浓度的对数值作为横坐标，绘制标准曲线，通过od值的测定，即可达到检测待测样品中过敏原小清蛋白含量的目的。
所述鱼类小清蛋白的提取和纯化的制备步骤：取鱼肌肉绞成肉糜，采用热抽提法，将其均质后以抽提液提取，离心10000rpm，4℃，20min，取上清煮沸10min，离心，取上清，加入饱和度60％硫酸铵溶液搅拌30min，静置1h后离心，取上清加入饱和度100％硫酸铵搅拌30min，静置1h后离心，取沉淀，最后将沉淀溶解于超纯水中，透析过夜，得到鱼类小清蛋白。
所述金磁复合纳米粒子为fe3o4-pei-au1-pei-au2，是在fe3o4-pei的表面通过静电吸附包被少量的au颗粒，制备fe3o4-pei-au1复合纳米微粒；重复以上反应吸附第二层金，即fe3o4-pei-au1-pei-au2。
所述金磁免疫探针的制备方法为：取5mg金磁复合纳米粒子溶于5ml0.01m，ph7.5的pbs缓冲液中，洗三遍，然后向其中加入权利要求2中制备的单克隆抗体，37℃震荡反应60min，反应结束后吸取上清液，测定od280值，用0.01m，ph7.4的pbst缓冲液洗三遍，加入2ml3％bsa的pbs在37℃封闭2h，pbst洗涤液冲洗3遍后，溶于5mlpbs缓冲液中，使其浓度为1mg/ml，即得到所述金磁免疫探针，以留使用。
所述单克隆抗体采用以下方法制备得到：
第一步，动物的免疫，初步得到免疫抗体，
第二步，细胞融合，杂交瘤细胞的筛选和纯化，体外获得产生抗体的细胞株，
第三步，腹水抗体的获得，体内获得最终单克隆抗体。
动物的免疫，初步得到免疫抗体采用以下方法：
使用纯化后pv(parvalbumin)免疫4只雌性4-6周小鼠，每次100ug/只，第1次采用福氏完全佐剂，与蛋白液等体积混匀，后4次免疫采用福氏不完全佐剂，每2周免疫1次，测定小鼠血清效价，取免疫效果最佳者于融合前3d用，纯化后pv(parvalbumin)蛋白尾腹腔注射加强免疫(100g)，免疫3次后，经尾静脉采血测定血清中抗体效价，以便杂交瘤的培养、筛选。
细胞融合，杂交瘤细胞的筛选和纯化，体外获得产生抗体的细胞株的方法如下：
分别收集免疫小鼠脾细胞和sp2/0骨髓瘤细胞以约1：5的比例在50％聚乙二醇作用下诱导细胞融合，融合后的细胞沉淀用10ml无血清培养液轻悬终止peg的作用，1000r/min离心5min，将细胞团轻悬于120mlhat选择培养液中，铺于96孔培养板，每孔100ul，置于37℃，5％co2培养箱中培养，1周后显微镜下可观察到细胞团，无菌条件下将培养板每孔的单个细胞团吸起放入96孔板ht培养液中，继续培养，当96孔板中细胞长至视野1/3时，间接elisa法进行检测细胞上清效价，阳性孔用有限稀释法进行亚克隆，连续三次亚克隆呈阳性的细胞孔进行扩大培养。
腹水抗体的获得，体内获得最终单克隆抗体的方法如下：向6周龄以上balb/c小鼠腹腔注射0.5ml/只石蜡，诱导1周后腹腔注射杂交瘤细胞，7-10d后可产生腹水，收集腹水后使用辛酸-硫酸铵法对收集腹水进行纯化，最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)、蛋白免疫印迹法(western-blot)以及商业化试剂盒检测纯化后单克隆抗体纯度、特异性与抗体亚型。
所述酶标抗原制备方法为：使用过碘酸钠氧化法，将小清蛋白过敏原使用hrp进行酶标，以留使用。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
金磁探针的制备
1、鲫鱼小清蛋白的纯化
(1)鲫鱼小清蛋白粗提物的制备：取鲫鱼鱼肉100g绞成肉糜，采用热抽提法，将其均质后以抽提液(10mmcacl2，0.02mmpmsf，10mmtris-hcl,ph7.5)＝1：5(m/v)提取，离心10000rpm，4℃，20min，取上清煮沸10min，离心，取上清。
(2)硫酸铵分级盐析：取上述上清，加入饱和度60％硫酸铵溶液搅拌30min，静置1h后离心，取上清加入饱和度100％硫酸铵搅拌30min，静置1h后离心,取沉淀。最后将沉淀溶解于超纯水中，透析过夜。
经过纯化后的鲫鱼小清蛋白电泳图谱如图1所示，其中泳道1为marker，泳道2为纯化后的pv。
2、鲫鱼小清蛋白单克隆抗体的制备
动物免疫balb/c小鼠，4只，雌性，4-6周龄。使用纯化后pv免疫，每次100ug/只。第1次采用福氏完全佐剂，与蛋白液等体积混匀，后4次免疫采用福氏不完全佐剂，每2周免疫1次。测定小鼠血清效价，取免疫效果最佳者于融合前3d用，纯化后pv蛋白尾腹腔注射加强免疫(100g)。免疫3次后，经尾静脉采血测定血清中抗体效价。取纯化后pv(10ug/ml，100ml/孔)37℃包被2h；封闭液(1％牛血清白蛋白、0.1％tween20)200ul/孔，37℃封闭2h，磷酸盐缓冲液-吐温-20(pbst)洗板3次；血清稀释后加样，37℃孵育1h，pbst洗板3次；加1：3000稀释的羊抗鼠hrp-igg，37℃孵育45min，pbst洗板3次；加elisa底物a、b液，避光37℃显色15min，2mol/l硫酸100ul每孔终止反应；酶标仪450nm波长下测定od值，p/n>2.1为阳性。
分别收集免疫小鼠脾细胞和sp2/0骨髓瘤细胞以约1：5的比例在50％聚乙二醇作用下诱导细胞融合。融合后的细胞沉淀用10ml无血清培养液轻悬终止peg的作用。1000r/min离心5min，将细胞团轻悬于120mlhat选择培养液中，铺于96孔培养板，每孔100ul，置于加入37℃，5％co2培养箱中培养。1周后显微镜下可观察到细胞团。无菌条件下将培养板每孔的单个细胞团吸起放入96孔板ht培养液中，继续培养。当96孔板中细胞长至视野1/3时，间接elisa法进行检测细胞上清效价，阳性孔用有限稀释法进行亚克隆，连续三次亚克隆呈阳性的细胞孔进行扩大培养。
将6周龄以上balb/c小鼠腹腔注射0.5ml/只石蜡，诱导1周后腹腔注射杂交瘤细胞，7-10d后可产生腹水，收集腹水后使用辛酸-硫酸铵法对收集腹水进行纯化。最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)、蛋白免疫印迹法(western-blot)以及商业化试剂盒检测纯化后单克隆抗体纯度、特异性与抗体亚型。
经过纯化的鲫鱼小清蛋白单克隆抗体电泳图谱如图2所示，其中泳道1为marker，泳道2为纯化后的pv单克隆抗体。
经过纯化的鲫鱼小清蛋白单克隆抗体western-blot显影图如图3所示，其中泳道1为marker，泳道2为pv单克隆抗体杂交条带。
3、金磁免疫探针的制备：金磁复合颗粒fe3o4/au的制备步骤由以下反应组成，第一是在fe3o4-pei的表面通过静电吸附包被少量的au颗粒，制备fe3o4-pei-au1复合纳米微粒；重复以上反应吸附第二层金，即fe3o4-pei-au1-pei-au2。最后制得的金磁复合微粒通过透射电镜表征，常温保存备用。
实施例2：鲫鱼小清蛋白酶标抗原的制备：使用过碘酸钠氧化法，将小清蛋白过敏原使用hrp进行酶标，用于下一步构建金磁酶联免疫体系。
实施例3：应用酶标抗原、金磁探针建立金磁酶联免疫法检测鱼类过敏原小清蛋白
将制备好的金磁免疫探针与各个不同浓度的小清蛋白抗原(0ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml、32ng/ml、64ng/ml、128ng/ml、256ng/ml、512ng/ml共12个浓度，其中0ng/ml作为0号对照值)及小清蛋白酶标抗原混合，使其互相竞争结合pv单抗，一段时间后，使用磁块使其磁性分离，使用tmb作为显色底物，硫酸作为终止液终止反应，测定每管的od450。每个小清蛋白抗原浓度做三个平行，以抑制率(％)作为纵坐标，添加pv浓度的对数值作为横坐标，正确绘制标准曲线。小清蛋白含量越多，金磁免疫探针偶联的酶标抗原的吸光值越低。
金磁酶联免疫体系的标准曲线如图4所示。
实施例4：分别将10ng/ml、40ng/ml、160ng/ml的pv加入金磁酶联免疫检测体系，与酶标抗原竞争结合单抗。一段时间后使用磁块使其分离，使用tmb作为显色底物，硫酸作为终止液终止反应，测定每组的od450。每个浓度小清蛋白抗原做三个平行。计算抑制率，对应求出待检测抗原浓度，计算回收率。
表1本发明的方法检测不同稀释浓度的pv
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。