双层电泳胶染色装置、自动化电泳胶染色装置及使用方法与流程

本发明属于分子生物学领域，特别涉及双层电泳胶染色装置、自动化电泳胶染色装置及使用方法。

背景技术

电泳胶染色技术主要是针对蛋白胶、dna胶的染色，常用的电泳胶染色方法主要有染料染色法(如考染法)、银染法、负染法和荧光染色法。

目前，各种电泳胶染色技术灵敏度相对较高，染色过程中出现的各种干扰容易使电泳胶出现杂质，影响实验结果，加之染色过程繁琐，操作复杂，不仅易污染电泳胶且容易出现试剂浪费的现象；而直接接触试剂也会影响人体安全。

染色过程中的注意事项包括：所有的染色器皿都要洗干净，染色过程中水的级别要求比较高，染色过程中避免手去接触凝胶，必须戴上一次性手套或无粉乳胶手套。

同时，各种染色方法均需要用到装电泳胶的器皿，且往往需要多次加液、排液等操作，实践中，有的操作者用浅边缘的容器(如铁盘、陶瓷盘等)装，通过晃动容器将容器中的水去除，该方法会导致大量的溶液仍存留在容器中，影响染色效果。也有实验人员用手将电泳胶的边缘按住，继而将装置中的水倒出，该方法会导致在胶上留下手指印，影响成像，且极容易导致胶的破裂。发明人在研究过程中，尝试采用虹吸法和用平板将电泳胶托起后倾倒染色液的方法，但发现这两种方法操作起来速度较慢，不便捷，且虹吸的管子易污染电泳胶、无法完全吸尽染色液，而托板操作不当易使电泳胶破裂。电泳胶染色的另一大不便之处是实验人员需要随时观察电泳结果，定时定量加入染色液或排放染色液，极大消耗人力。

目前染色过程中采用的染色装置均存在一定的问题，如操作繁琐、浪费试剂、污染样品等。因此，研发出染色效果佳、简便、无污染、安全、低试剂使用量的自动化染色装置具有重要的现实价值和科学意义，将在在分子生物学研究方具有理想的产业化前景。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种双层电泳胶染色装置。所述的双层电泳胶染色装置使用简便、适应性强、试剂利用率高、不污染电泳胶、安全高、密封好，为凝胶电泳技术后续的染色步骤提供便捷。

本发明的另一目的在于提供所述的双层电泳胶染色装置的使用方法。

本发明的又一目的在于基于所述的双层电泳胶染色装置，提供一种自动化电泳胶染色装置。所述的自动化电泳胶染色装置的自动化程度高、进一步简化操作过程。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种双层电泳胶染色装置，包括第一容器和第二容器，第一容器放置在第二容器内，第一容器的外壁与第二容器的内壁存有空隙，第一容器底部边缘设有多个通孔；第二容器上端盖有上盖。该染色装置在染色过程中不会对电泳胶产生冲击性破坏、密闭安全、利于实现染色液的快速排出和加液且不污染电泳胶。

第一容器的底部与第二容器的底部相接触，除底部接触外，第一容器的外壁与第二容器的内壁不接触。

多个通孔沿着第一容器底部的边缘依次等距分布；通孔的孔径优选为5±2mm，若孔径过大，电泳胶易被通孔绊住，导致破裂。

通孔的间距优选为1～5cm，更优选为2～4cm，最优选为2cm。

第一容器与第二容器之间的空隙优选为2±1cm。即第一容器的外壁到第二容器的内壁的间距优选为2±1cm。

为避免电泳胶被勾破，第一容器选用表面平整光滑的材料制成，优选为塑料、陶瓷、不锈钢中的至少一种；更优选为塑料。

第二容器的材质优选为塑料、陶瓷、不锈钢和铁中的至少一种；进一步优选为塑料。

所述的双层电泳胶染色装置的使用方法，具体包括如下步骤：将电泳胶置于第一容器中，然后向第一容器和第二容器之间的空隙中加入溶液，使溶液浸没电泳胶，换液时将第一容器从第二容器中提起，使电泳胶从溶液中分离，弃去第二容器中的溶液。

所述的溶液可根据具体染色方法进行调整。以银染法为例，所述的溶液可为固定液、敏化液、银染液、显色液、终止液、漂洗溶剂等。

当使用双层电泳胶染色装置同时采用摇床进行振摇时，摇床的转速优选为10～60r/min；进一步优选为40r/min。过高的转速将引起电泳胶的折叠、破裂，而转速过低会导致染色不均匀。

一种自动化电泳胶染色装置，包括第一容器、第二容器、加液装置、排液装置、加液管、排液管、供液容器、废液桶；第一容器放置在第二容器内，第一容器的外壁与第二容器的内壁存有空隙，第一容器底部边缘设有多个通孔，第二容器上端盖有上盖，上盖设有至少两个通孔；加液管的一端通过上盖的一个通孔伸至第一容器和第二容器之间的空隙内，加液管的另一端连接供液容器，加液装置设置在加液管上；排液管的一端通过上盖的另一个通孔伸至第一容器和第二容器之间的空隙内且伸至第二容器的底部，排液管的另一端连接废液桶，排液装置设置在排液管上。

当染色方法为银染法时，优选有六个加液装置，六根加液管，六个供液容器，上盖设有七个通孔，一根加液管的一端通过上盖的一个通孔伸至第一容器和第二容器之间的空隙内，该根加液管的另一端连接一个供液容器，一个加液装置设置在该根加液管上。一个加液装置，一根加液管，一个供液容器组成一个供液设备。

上盖的通孔优选设于上盖边缘。从俯视方向上看，上盖的通孔落在第一容器外壁与第二容器内壁之间的空隙内。

所述的加液装置设有智能校准模块，对流量或者分配液量进行校准，进一步控制并提高流量精度。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明无需直接接触电泳胶，即可将染色装置中的液体排干净，解决了现有技术中在电泳胶染色过程中采用手指按压倾倒，在电泳胶留下明显的手指印，污染电泳胶；或晃动低边缘染色装置将容器中水摇出的方法仍有大量染色液残留在染色装置中，即影响染色效果又造成试剂浪费等问题。

(2)本发明的自动化电泳胶染色装置可实现自动加液、排液，操作便捷，且塑料染色装置质地较软，不会对电泳胶造成破坏。该技术与虹吸法和用平板将电泳胶托起后倾倒染色液的方法相比，优越性显著；在电泳胶染色技术方面具有很强的创新性和实际价值。

(3)自动化电泳胶染色装置具有操作实用性强、自动化程度高、可重复利用、适用于任何电泳胶等优点。

附图说明

图1是双层电泳胶染色装置的正视图。

图2是双层电泳胶染色装置的侧视图。

图3是双层电泳胶染色装置的俯视图(不含上盖)。

图4是自动化电泳胶染色装置的俯视图。

图5是自动化电泳胶染色装置的主视图。

图6是采用本发明的自动化电泳胶染色装置或平板法对电泳胶的影响结果照片图；其中，a为采用自动化电泳胶染色装置(污染体系的苏云金芽孢杆菌)得到的照片图；b为平板法(无机盐体系的苏云金芽孢杆菌)得到的照片图。

图7是双层电泳胶染色装置、虹吸法对电泳胶的影响结果照片图；其中，a、b为采用双层电泳胶染色装置(接触过三苯基锡的苏云金芽孢杆菌)得到的照片图；c为采用手按压法(苏云金芽孢杆菌营养菌)得到的照片图。

图8是在双层电泳胶染色装置中加入150ml(每块胶)的染色液的结果照片图。

图9是在双层电泳胶染色装置中加入250ml(每块胶)的染色液的结果照片图。

图10是在双层电泳胶染色装置中加入500ml(每块胶)的染色液的结果照片图。

其中，零部件和对应的标号如下：

1是双层电泳胶染色装置，2是摇床，3是加液装置，4是排液装置，5是加液管，6是排液管，7是供液容器，8是废液桶，1-1是上盖，1-2是第一容器，1-3是第二容器，1-4是通孔。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1双层电泳胶染色装置的制备

1.材料

(1)双层电泳胶染色装置：尺寸不一样的塑料、铁、不锈钢、陶瓷容器(该方法可依照电泳胶的规格制备成任意相应规格的染色装置，由于本实施例试验用的电泳胶为13cm，染色装置内衬设计为长18cm、宽14cm、高5cm，外层为长20cm、宽16cm、高5cm)。实际实验中染色装置数量可根据胶的数量进行对应调整。

(2)打孔装置：打孔机。

(3)通过常规方法制备得到的空胶体。

2.方法

用打孔机在第一容器底部边缘分别开间隔2、3、4、5、6cm、直径为5、10mm的孔，将第一容器置于第二容器内，并给第二容器盖上盖子。往装置中添加500ml的纯水，摇床转速为40r/min，检测排水速度及胶体完整度。

3.结果

不同质地染色装置(第一容器的孔径5mm，间距4cm)的使用情况如表1所示。除铁外，塑料、陶瓷、不锈钢等容器均可作为染色装置。鉴于陶瓷、不锈钢价格较高，且塑料盒易于清洗，不易生锈，价格低廉，电泳胶不易受损，所以实施例中的双层主体染色装置的第一容器及第二容器均采用塑料制造。不同孔径及间距的第一容器组装的染色装置使用效果如表2所示。最终采用第一容器的孔径5mm，孔间距2cm的染色装置。其他规格的电泳胶染色装置可按照比例调整设计孔径和间距。染色装置结构图如图1～3所示，包括第一容器和第二容器，第一容器放置在第二容器内，第一容器的外壁与第二容器的内壁存有空隙，第一容器底部边缘设有多个通孔；第二容器上端盖有上盖。

表1不同材质的染色装置的比较(第一容器的孔径5mm，间距4cm)

表2染色装置第一容器的孔径及间距与使用效果

实施例2自动化电泳胶染色装置的制备

1.材料

加液装置采用自动定时定量加液器(并联6个泵头-6条通道)，排液装置采用单泵头-单通道。软管7根；相应染色试剂瓶；打孔机；双层电泳胶染色装置(塑料材质)；摇床；废液槽。

2.方法

双层电泳胶染色装置上盖边缘开6个加液孔，6个泵头加液装置连接的6条软管通过盖子顶部的加液孔伸入双层电泳胶染色装置的第一容器和第二容器的器壁之间，加液装置另一端的6条软管置于相应的试剂中；盖子上部另一端边缘开1个排液孔，将排液泵连接的软管通过该孔，伸入双层电泳胶染色装置底部(两容器壁之间)，排液装置另一端的软管置于废水槽中。具体装置图见图4、图5。

以银染法为例(其他染色方法，如染料染色法、银染法、负染法和荧光染色法等可根据具体染色流程进行调整)，加液泵及排液泵均采用1000ml/min的流量，根据具体染色流程，染色流程如下：固定(过夜)——敏化(30min)——水洗(10min/次，共4次)——银染(40min)——水洗(1min/次，共4次)——显色(5min)——终止反应(10min)——水洗(5min/次，共3次)，且加液量为每张胶250ml，加液/排液装置运行参数如下：

(1)固定液连接的泵1运行15s；

(2)排液泵分别于0s、30min30s、41min、51min30s、62min、72min30s、113min、114min30s、116min、117min30s、119min、124min30s、135min、140min30s、146min、151min30s后各运行15s；

(3)敏化液连接的泵2于15s后运行15s；

(4)milliq水连接的泵3分别于30min45s、41min15s、51min45s、62min15s，113min15s，114min45s，116min15s，117min45s，135min15s，140min45s，146min15s后各运行15s；

(5)银染液连接的泵4于72min45s后运行15s；

(6)显色液连接的泵5于119min15s后运行15s；

(7)终止液连接的泵6于124min45s后运行15s；

固定液连接的泵1于前一天开始运行，第二天其它泵再开始运行，具体设置根据具体染色流程而定。

3结果

加液装置设有彩色液晶屏幕和智能校准模块，彩色液晶屏幕可实时显示运行状态，包括液体流量及电机转速等，同时该装置具有智能校准功能，可以对流量或者分配液量进行校准，确保流量精度。经过自动化加液及排液装置的改装，自动化电泳胶染色装置可极大程度地实现自动化，减少人力。加液装置和排液装置属于现有成熟的技术，但目前未应用于电泳胶染色过程中。

实施例3自动化电泳胶染色装置及平板对电泳胶染色的影响

1.材料

跑完双向凝胶电泳的蛋白胶(来源：经无机盐体系培养和三苯基锡污染体系培养的苏云金芽孢杆菌bacillusthuringiensis；购自广东省微生物菌种保藏中心；gimcc1.817)。

获得上述蛋白胶的基本方法如下：将无机盐离子体系(30mgl^-1kh2po4，20mgl^-1nacl，30mgl^-1nh4cl和10mgl^-1mgso4)培养2天的菌体与无机盐基础上添加三苯基锡污染物(1mgl^-1)培养2天的菌体洗净离心，获得底部沉淀的菌体，菌体再重悬于裂解液，用超声破碎仪破碎菌体，获得蛋白溶液，对蛋白溶液进行定量后进行凝胶双向电泳实验；

自动化电泳胶染色装置；

单层密闭染色装置加常规光滑平板，用于托起胶体，然后将染液倒出，为现有技术中常用方法。

银染染色液(以下配制均为两块胶用量，增加胶块量时，等比例增加试剂即可)：

(1)固定液：200ml无水乙醇、50ml乙酸，超纯水定容至500ml；

(2)敏化液：150ml无水乙醇、20.5g无水乙酸钠、1.58gna2s2o3·5h2o，超纯水定容至500ml；

(3)银染液：1g硝酸银溶解在500ml超纯水，临用前加入200μl甲醛溶液；

(4)显色液：12.5g无水碳酸钠溶解500ml超纯水，临用前加入100μl甲醛溶液；

(5)终止液：7.3gedta-na·2h2o溶解500ml超纯水。

2.方法

采用自动化电泳胶染色装置或者用平板托起电泳胶后将盒中液体倾倒，以下8个步骤均需要多次固液分离(取胶)的操作；

以下整个染色过程均在摇床上进行，摇床转速为40r/min；

(1)固定：置于固定液过夜；

(2)敏化：在敏化液中敏化30min；

(3)水洗：milliq水漂洗4次，每次10min；

(4)银染：在银染液中染色40min，避光操作；

(5)快速水洗：milliq水漂洗4次，每次约1min；

(6)显色：在显色液中显色5～10min，以胶上的点基本显现出来且没有横纹竖纹的条带出现为准；

(7)终止：加入终止液作用10min，终止反应；

(8)漂洗：milliq水漂洗3次，每次5min。

3结果

由图6可知，采用本发明的自动化电泳胶染色装置的效果优于平板法，采用平板托起电泳胶过程中，电泳胶容易在平板上出现折叠现象，折叠后的电泳胶容易在折叠处裂开，且采用平板将电泳胶托起过程较困难，过程较缓慢，影响染色效果。

实施例4自动化电泳胶染色装置及手指按压法对电泳胶染色的影响

1.材料

跑完双向凝胶电泳的蛋白胶(来源：与三苯基锡接触过及未接触过的苏云金芽孢杆菌bacillusthuringiensis；购自广东省微生物菌种保藏中心；gimcc1.817)。

获得上述蛋白胶的基本方法如下：将营养体系(3gl^-1牛肉膏，10gl^-1蛋白胨和5gl^-1nacl)培养的菌体与营养体系培养后再经过三苯基锡污染物(1mgl^-1)培养1天的菌体洗净离心，获得底部沉淀的菌体，菌体再重悬于裂解液，用超声破碎仪破碎菌体，获得蛋白溶液，对蛋白溶液进行定量后进行凝胶双向电泳实验。

单层密闭染色装置；

双层自动化电泳胶染色装置；

软管一根；

银染染色液同实施例3。

2.方法

(1)自动化电泳胶染色装置操作方法同实施例3。

(2)虹吸法：将染色装置放置于高处，水位高于废液桶中液面，将装满液体(液体与染色装置中的液体相同)的管道一端伸入染色装置液面下，随后管道另一端打开，通过液压差实现自动排液。

3.结果

结果如图7所示，从图7c可以看出，即使操作过程中穿戴无粉橡胶手套，手按压过后，电泳胶上仍存留着明显的手指印(箭头指示的方框区域)，而图7a是染色过程中采用双层电泳胶染色装置的电泳胶，背景干净无杂质，操作简便。虹吸法(图7b)处理蛋白胶过程虽然效果较好，但是处理过程非常麻烦，每次排液均需要用虹吸法，排液不能排的非常干净，且需要往管道里面注入液体，耗费时间和试剂。

实施例5不同量染色液及摇床转速对自动化电泳胶染色装置染色的影响

1.材料

跑完双向凝胶电泳的蛋白胶(来源：与三苯基锡接触过的苏云金芽孢杆菌bacillusthuringiensis；广东省微生物菌种保藏中心；gimcc1.817)。获得上述蛋白胶的基本方法如下：将经过三苯基锡污染物(1mgl^-1)培养1天的菌体洗净离心，获得底部沉淀的菌体，菌体再重悬于裂解液，用超声破碎仪破碎菌体，获得蛋白溶液，对蛋白溶液进行定量后进行凝胶双向电泳实验；

双层电泳胶染色装置；

银染染色液配方同实施例3，每块胶、每个步骤的染色液用量分别为150、250、500ml。

2.方法

不同量染色液对电泳胶染色的影响：步骤同实施例3，摇床转速为40r/min，染色液用量分别为150、250、500ml。

摇床转速对电泳胶染色的影响：步骤同实施例3，摇床转速分别为40、60、80、100r/min，染色液用量为250ml。

3.结果

不同量染色液对电泳胶的影响如图8～10所示，当每块胶的用量为150ml时，染色过程中易出现局部电泳胶未被液体覆盖的现象，导致局部电泳胶模糊。250ml及500ml染色液的染色效果较佳，鉴于试剂成本考虑，采用250ml的用量。

摇床转速对双层电泳胶染色装置染色的影响如表3所示，40r/min条件下，电泳胶完整无损，不易折叠；60r/min条件下，染色过程中电泳胶易折叠；80r/min或100r/min条件下，电泳胶易折叠破裂。因此采用40r/min的转速。

表3摇床转速对双层电泳胶染色装置染色的影响

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。