用于体液样品中的粒子分析的自聚焦系统和方法与流程

相关申请的交叉引用

本专利申请是2013年3月15日提交的美国临时专利申请no.61/799,152的非临时性申请并要求其优先权权益，所述临时专利申请的内容以引用方式并入本文。本申请还涉及美国专利申请no.14/215,834、14/216,533、14/216,339、14/216,811和14/217,034；以及均提交于2014年3月17日的多份国际专利申请no.(sheathfluid,flowcell,dynamicrange,contrastagent,hematology)(鞘流体、流通池、动态范围、对比剂、血液学)。这些专利提交中的每一者的内容均以引用方式并入本文。

背景技术：

本公开涉及使用全自动化或部分自动化设备区分和定量样品中的粒子(诸如血细胞)的粒子分析(包括对流体样品中的粒子成像)的装置、系统、组合物和方法领域。本公开还涉及可用于分析得自受试者的样品中的粒子的粒子和/或细胞内细胞器配向液体(particleand/orintracellularorganellealignmentliquid,pioal)，用于制备所述液体的方法，以及使用所述液体检测和分析粒子的方法。本发明还公开了可用于进行基于图像的生物流体样品分析的组合物、系统、设备和方法。本公开的组合物、系统、设备和方法还可用于对生物流体中的粒子(诸如红血细胞、网织红细胞、有核红血细胞、血小板)进行检测、计数和表征，以及用于基于图像和形态的白血细胞分类计数、分类、子分类、表征和/或分析。

血细胞分析是用于提供患者健康状态的概况的最常执行的医学检验之一。血液样品可从患者身体抽取并储存在含有抗凝血剂以防止凝结的试管中。全血样品通常包含三大类血细胞，包括红血细胞(红血球)、白血细胞(白血球)和血小板(凝血细胞)。每一类可进一步分为成员亚类。例如，五大类型或亚类的白血细胞(wbc)具有不同的形状和功能。白血细胞可包括中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。也存在红血细胞类型的亚类。样品中粒子的外观可根据病理状况、细胞成熟度和其他原因而不同。红血细胞亚类可包括网织红细胞和有核红血细胞。

用于估计rbc、wbc或血小板浓度的血细胞计数可以由人工方式或使用自动化分析仪进行。当血细胞计数以人工方式进行时，将一滴血作为薄层涂片而施加到显微镜载片上。传统上，对显微镜载片上的干燥、染色血涂片的人工检查已被用来确定五种类型的白血细胞的数量或相对量。已将组织学染料和染剂用于对细胞或细胞结构染色。例如，瑞氏染剂是已用于对血涂片染色以在光学显微镜下检查的组织学染剂。全血计数(cbc)可使用自动化分析仪获得，其中一种类型基于粒子或细胞沿着小管通过感测区时的阻抗或动态光散射而对血液样品中的不同粒子或细胞的数量计数。自动化cbc可采用多种仪器或方法区分不同类型的细胞，这些细胞包括rbc、wbc和血小板(plt)，它们可单独地进行计数。例如，要求最小粒度或体积的计数技术可用于仅对大细胞计数。血液中的某些细胞(诸如异常细胞)可能无法正确计数或识别。彼此粘附的小细胞可能被错误地计数为大细胞。当怀疑计数有误时，可能需要对仪器结果进行人工复查以确认和识别细胞。

自动化血细胞计数技术可涉及流式细胞术。流式细胞术涉及提供窄的流路，以及对单个血细胞的通过进行感测和计数。流式细胞术方法已用于检测悬浮在流体中的粒子，诸如血液样品中的细胞，以及用于分析粒子的粒子类型、尺寸和体积分布以便推断出血液样品中相应粒子类型或粒子体积的浓度。分析悬浮在流体中的粒子的合适方法的例子包括沉降、微观表征、基于阻抗的计数和动态光散射。这些工具易出现测试误差。另一方面，准确表征粒子的类型和浓度在诸如医学诊断的应用中可能至关重要。

在基于成像的计数技术中，使用耦合到数码相机的显微镜物镜镜头捕获可能正在通过观察区的制备样品的像素数据图像。像素图像数据可用数据处理技术加以分析，并且还显示在监视器上。

具有流通池的自动化诊断系统的多个方面在授予turner等人的美国专利no.6,825,926以及均授予kasdan等人的美国专利no.6,184,978、6,424,415和6,590,646中有所公开，它们据此以引用方式并入，如同在本文完整示出一样。

使用动态光散射或阻抗的自动化系统已用于获得全血计数(cbc)：总白血细胞计数(wbc)、红血细胞总细胞体积(rbc分布)、血红蛋白hgb(血红蛋白在血液中的量)；平均细胞体积(mcv)(红细胞的平均体积)；mpv(平均plt体积)；血细胞比容(hct)；mch(hgb/rbc)(每个红血细胞的血红蛋白的平均量)；和mchc(hgb/hct)(细胞中血红蛋白的平均浓度)。自动化或部分自动化方法已用来方便白血细胞五部分分类计数和血液样品分析。

虽然此类目前已知的粒子分析系统和方法连同相关的医学诊断技术可为医生、临床医生和患者提供真正的益处，但是仍需要进一步的改进。本发明的实施例为这些待解决的需求中的至少一些提供了解决方案。

技术实现要素：

本发明的实施例涵盖某些聚焦技术，其允许血液学系统和方法产生存在于流体血液样品中的粒子的高质量图像。此类高质量图像为实现高区分水平提供了基础，其允许使用具有高放大倍率和高数值孔径的物镜的光学系统，从而用于准确地对细胞分类。示例性光学配向或聚焦技术有利于产生具有高分辨率水平的图像，且具有与输运粒子的流体样品的薄带相对应的短视野深度。

在一些情况下，可定期地重新聚焦血液学系统以针对局部温度和其他因素的变化进行调整。例如，如本文所述的自聚焦技术可补偿存在于血液学分析仪中的热膨胀或其他因素，它们会改变成像物镜与流通池之间的距离，从而例如通过产生偏离焦点的图像而对成像结果造成负面影响。本发明的实施例还涵盖用于血液学仪器的自聚焦系统和方法，其涉及使成像系统自动地聚焦而无需聚焦液体或溶液或其他用户干预。例如，示例性自聚焦技术可涉及获得对相对于流通池固定的靶标的初始聚焦，而非使用基于使出现于图像中的主题自身的对比度最大化的技术。

本发明的某些实施例至少部分地基于这样的观察：流通池内的料流位置不会响应于温度波动而变化，并且可涉及使靶标聚焦在流通池的某处，然后使用固定偏移量实现对样品料流的良好聚焦。此类方法可在不使用流过流通池的聚焦溶液的情况下具体实施，并且可自动地且对用户完全透明化地执行。

根据一些实施例，本发明涉及用于使包含悬浮于液体中的粒子的样品成像的视觉分析仪，其中装置包括耦合到样品源和耦合到pioal源的流通池，其中流通池限定内部流路，流通池被配置成将被pioal包封的带形样品料流的流引导穿过流通池中的观察区。与高光学分辨率成像设备相关的物镜镜头设置在与带形样品料流相交的光轴上。物镜和流通池之间的相对距离可通过耦合到控制器的电机驱动器的操作来改变，以便在光敏元件阵列上分辨和采集数字化图像。自聚焦光栅或成像靶标设置在相对于流通池固定的位置处，自聚焦光栅位于离制备的带形样品料流的平面的预定距离处。光源照明带形样品料流和自聚焦光栅。至少一个数字处理器与耦合的控制器相连以操作电机驱动器。处理器还被布置用于分析数字化图像。处理器测定自聚焦光栅的位置以生成聚焦图像，然后使物镜和流通池在离聚焦位置的预定距离(例如，位移距离)内相对地位移，以将高光学分辨率成像设备聚焦于带形样品料流。

在一个方面，本发明的实施例涵盖使用粒子分析系统使血液流体样品中的粒子成像的方法。粒子分析系统可被配置用于几何流体聚焦。在一些情况下，该系统可被配置用于组合式粘度和几何流体聚焦。在一些情况下，粒子可包含在具有样品流体粘度的血液流体样品中。示例性方法可包括使鞘流体沿着粒子分析系统的流通池的流路流动。在一些情况下，鞘流体可具有与样品流体粘度相差一个处于预定粘度差范围内的粘度差的鞘流体粘度。方法还可包括将血液流体样品注入流通池内的流动鞘流体以使得血液流体样品流体以流动料流宽度大于流动料流厚度的样品流动料流流动，样品流动料流流过流路尺寸的缩减段并横越成像轴。此外，方法可包括通过使具有相对于流通池固定的位置的成像靶标成像来使图像捕获设备聚焦。而且，方法可包括使用图像捕获设备在流动料流内采集适用于粒子表征和计数的粒子的聚焦图像，其中使用位移距离使图像捕获设备聚焦于样品流动料流。根据一些实施例，鞘流体与血液流体样品之间的粘度差与流路尺寸的缩减段相结合，有效地在成像轴处流体聚焦样品流动料流，同时鞘流体中的粘度剂保持样品流动料流中的细胞的活力，使细胞从样品流动料流延伸到流动鞘流体中时细胞的结构和内容物完整。在一些情况下，样品流动料流在成像轴处具有约2μm至约10μm范围内的厚度。在一些情况下，流路在成像轴处具有约150μm的厚度。在一些情况下，成像靶标位于观察孔窗口上，所述观察孔窗口设置在样品流动料流与图像捕获设备之间。在一些情况下，成像靶标位于照明窗口上，并且样品流动料流设置在照明窗口与图像捕获设备之间。在一些情况下，位移距离为零。在一些情况下，成像靶标位于照明窗口与观察孔窗口之间。在一些情况下，在采集步骤中，通过基于位移距离调节图像捕获设备的焦距而使图像捕获设备聚焦于样品流动料流。

根据一些实施例，采集聚焦图像的方法包括使用位移距离调节图像捕获设备与流通池之间的距离。在一些情况下，调节图像捕获设备与流通池之间的距离包括移动图像捕获设备的部件。图像捕获设备的部件可为图像捕获设备的变焦镜头、反射镜、或包括图像捕获设备的组件。在一些情况下，调节图像捕获设备与流通池之间的距离包括移动流通池。在一些情况下，调节图像捕获设备与流通池之间的距离包括移动图像捕获设备的至少光学元件和流通池。在一些情况下，位移距离为沿着成像轴在成像靶标与样品流动料流之间的距离。在一些情况下，位移距离为图像捕获设备与靶标之间的第一焦距和图像捕获设备与样品流动料流之间的第二焦距之间的距离差。在一些情况下，方法包括自聚焦步骤，所述自聚焦步骤涉及将测试流体样品注入鞘流体中以形成流通池内的测试样品流动料流；使用图像捕获设备获得成像靶标的第一聚焦图像，使得聚焦的成像靶标和图像捕获设备限定第一焦距；使用图像捕获设备获得测试样品流动料流的第二聚焦图像，使得聚焦的测试样品流动料流和图像捕获设备限定第二焦距；以及通过计算第一焦距与第二焦距之间的差值获得位移距离。在一些情况下，测试流体样品是相同的血液流体样品并且测试样品流动料流与样品流动料流相同。在一些情况下，自聚焦步骤建立与图像捕获设备相关的焦平面，并且焦平面相对于图像捕获设备保持静止。在一些情况下，使用温度诸如样品流体温度、鞘流体温度、流通池温度或图像捕获设备温度，使图像捕获设备聚焦于样品流动料流。在一些情况下，可使用温度诸如成像位点处的流通池温度、成像位点上游位置处的流通池温度和成像位点下游位置处的流通池温度，使图像捕获设备聚焦于样品流动料流。在一些情况下，可使用温度变化率诸如样品流体温度变化率、鞘流体温度变化率、流通池温度变化率或图像捕获设备温度变化率，使图像捕获设备聚焦于样品流动料流。

根据一些实施例，方法可包括检测自聚焦再引发信号，以及响应于自聚焦再引发信号而重复自聚焦和图像采集步骤。在一些情况下，自聚焦再引发信号包括或基于温度的变化、聚焦质量的降低、流逝的时间间隔、或用户输入。在一些情况下，图像捕获设备对样品流动料流的聚焦独立于图像捕获设备的温度进行。在一些情况下，成像靶标包括用于将图像捕获设备的成像轴相对于样品流动料流定位的刻度。在一些情况下，成像靶标包括相对于成像轴配向的光圈，使得成像粒子设置在由光圈限定的孔内，并且在自聚焦期间使光圈的一个或多个边缘部分成像。在一些情况下，通过如下方式使图像捕获设备聚焦于样品流动料流：实施图像捕获设备围绕成像轴进行的轴向旋转、流通池围绕沿着成像轴延伸且在成像设备的视野内的轴线进行的轴向旋转、图像捕获设备围绕沿着流路延伸的轴线进行的顶端旋转、流通池围绕沿着流路且在流路内的轴线进行的顶端旋转、图像捕获设备围绕横越流路和成像轴的轴线进行的倾斜旋转、和/或流通池围绕横越流路和成像轴且在图像捕获设备的视野内的轴线进行的倾斜旋转。在一些情况下，通过实施流通池的旋转(该旋转以图像捕获设备的视野为中心)而使图像捕获设备聚焦于样品流动料流。在一些情况下，图像捕获设备的自聚焦包括从多个焦点位置中确定最佳焦点位置。

在另一方面，本发明的实施例涵盖使血液流体样品中的粒子成像的方法。示例性方法可包括使鞘流体沿着流通池的流路流动，以及将血液流体样品注入流通池内的流动鞘流体以使得血液流体样品以流动料流宽度大于流动料流厚度的样品流动料流流动。流通池可具有相关的温度。方法还可包括在与流通池相关的温度处于第一温度时，使图像捕获设备沿着成像轴聚焦于流动料流达到第一焦点状态，以及使用处于第一焦点状态的图像捕获设备采集流动料流内的第一亚组粒子的第一聚焦图像。方法还可包括确定与流通池相关的温度已经历从第一温度到第二温度的变化，以及响应于温度的变化及流通池温度与所需焦点之间的已知关系而自动地将图像捕获设备的焦点从第一焦点状态调节到第二焦点状态。此外，方法可包括使用图像捕获设备在第二焦点状态下采集流动料流内的第二亚组的粒子的第二聚焦图像。在一些情况下，调节图像捕获设备的焦点涉及使用温度的变化及流通池温度与所需焦点之间的已知关系来调节图像捕获设备与流通池之间的距离。在一些情况下，调节图像捕获设备的焦点涉及使用温度的变化及流通池温度与所需焦点之间的已知关系来调节图像捕获设备的焦距。在一些情况下，调节图像捕获设备的焦点涉及实施图像捕获设备围绕成像轴进行的轴向旋转、流通池围绕沿着成像轴延伸且在成像设备的视野内的轴线进行的轴向旋转、图像捕获设备围绕沿着流路延伸的轴线进行的顶端旋转、流通池围绕沿着流路且在流路内的轴线进行的顶端旋转、图像捕获设备围绕横越流路和成像轴的轴线进行的倾斜旋转、和/或流通池围绕横越流路和成像轴且在图像捕获设备的视野内的轴线进行的倾斜旋转。在一些情况下，通过实施流通池的旋转(该旋转以图像捕获设备的视野为中心)而使图像捕获设备聚焦于样品流动料流。

在另一方面，本发明的实施例涵盖执行几何流体聚焦或在一些情况下执行组合式粘度和几何流体聚焦以便使血液流体样品中的粒子成像的粒子分析系统。示例性系统可包括具有带有注入管的流路以及具有带有从中穿过的成像轴的成像窗口的流通池。流通池的流路可具有流路尺寸的缩减段。系统还可包括与流路流体连通的鞘流体输入口。此外，系统可包括与注入管流体连通的血液流体输入口。血液流体输入口可被配置用于将血液流体样品注入流通池内的流动鞘流体中以使得血液流体样品以流动料流宽度大于流动料流厚度的样品流动料流流动。在一些情况下，鞘流体可具有大于血液流体样品的粘度的粘度。而且，系统可包括图像捕获设备、被配置成设定图像捕获设备相对于流通池的焦点状态的聚焦机构、以及具有相对于流通池固定的位置的成像靶标。在一些情况下，成像靶标和样品流动料流可沿着成像轴限定位移距离。此外，系统可包括处理器和聚焦模块，所述聚焦模块具有收录有机器可读代码的有形介质，所述机器可读代码在处理器上执行以便操作聚焦机构使用位移距离设定适用于粒子表征和计数的图像捕获设备的焦点状态。在一些情况下，鞘流体与血液流体样品之间的粘度差与流路尺寸的缩减段相结合，有效地在成像轴处流体聚焦样品流动料流，同时鞘流体中的粘度剂保持样品流动料流中的细胞的活力，使细胞从样品流动料流延伸到流动鞘流体中时细胞的结构和内容物完整。在一些情况下，聚焦机构可包括被配置成调节图像捕获设备与流通池之间的距离的驱动电机。在一些情况下，成像靶标位于观察孔窗口上，所述观察孔窗口设置在样品流动料流与图像捕获设备之间。在一些情况下，成像靶标位于照明窗口上，并且样品流动料流设置在照明窗口与图像捕获设备之间。在一些情况下，系统被配置成执行采集步骤，所述采集步骤包括通过基于位移距离调节图像捕获设备的焦距而使图像捕获设备聚焦于样品流动料流。在一些情况下，系统被配置成执行采集步骤以便通过使用位移距离调节图像捕获设备与流通池之间的距离来获得聚焦图像。在一些情况下，系统被配置成通过移动流通池来调节图像捕获设备与流通池之间的距离。在一些情况下，系统被配置成执行自聚焦步骤，所述自聚焦步骤包括将测试流体样品注入鞘流体中以形成流通池内的测试样品流动料流；使用图像捕获设备获得成像靶标的第一聚焦图像，使得聚焦的成像靶标和图像捕获设备限定第一焦距；使用图像捕获设备获得测试样品流动料流的第二聚焦图像，使得聚焦的测试样品流动料流和图像捕获设备限定第二焦距；以及通过计算第一焦距与第二焦距之间的差值获得位移距离。在一些情况下，系统被配置成使用温度诸如样品流体温度、鞘流体温度、流通池温度或图像捕获设备温度，使图像捕获设备聚焦于样品流动料流。在一些情况下，系统被配置成检测自聚焦再引发信号，以及响应于自聚焦再引发信号而重复自聚焦和图像采集步骤。

在另一方面，本发明的实施例涵盖使血液流体样品中的粒子成像的系统。示例性系统可包括具有带有注入管的流路以及具有带有从中穿过的成像轴的成像窗口的流通池、与流路流体连通的鞘流体输入口、以及与注入管流体连通的血液流体输入口。血液流体输入口可被配置用于将血液流体样品注入流通池内的流动鞘流体中以使得血液流体样品以流动料流宽度大于流动料流厚度的样品流动料流流动。系统还可包括图像捕获设备、被配置成设定图像捕获设备相对于流通池的焦点状态的聚焦机构、热耦合到流通池的温度传感器、处理器以及聚焦模块。聚焦模块可包括收录有机器可读代码的有形介质，所述机器可读代码在处理器上执行以便操作聚焦机构响应于温度传感器所感测到的温度变化和温度与所需焦点之间的已知关系，而设定适用于粒子表征和计数的图像捕获设备的焦点状态。在一些情况下，聚焦机构包括被配置成调节图像捕获设备与流通池之间的距离的驱动电机。

在另一方面，本发明的实施例涵盖用于血液流体样品中的细胞的分析的方法。示例性方法可包括使鞘流体沿着流通池的流路流动，以及将血液流体样品注入流通池内的流动鞘流体以使得血液流体样品以流动料流宽度宽于流动料流厚度的样品流动料流流动。样品流动料流可沿着成像轴与流通池的成像窗口偏移第一距离。方法还可包括通过使附连到流通池的成像靶标成像来使图像捕获设备自聚焦。成像靶标可沿着成像轴定位在离成像窗口的第二距离。此外，方法可包括使用图像捕获设备采集流动料流内适用于细胞表征和计数的细胞的聚焦图像。在一些情况下，可使用自聚焦步骤和第一距离与第二距离之间的已知关系而使图像捕获设备聚焦于样品流动料流。

在另一方面，本发明的实施例涵盖用于血液流体样品中的细胞的分析的系统。示例性系统可包括具有带有注入管的流路以及具有带有从中穿过的成像轴的成像窗口的流通池。系统还可包括与流路流体连通的鞘流体输入口以及与注入管流体连通的血液流体输入口。血液流体输入口可被配置用于将血液流体样品注入流通池内的流动鞘流体中以使得血液流体样品以流动料流宽度大于流动料流厚度的样品流动料流流动。样品流动料流可沿着成像轴与流通池的成像窗口偏移第一距离。系统还可包括可沿着成像轴取向的图像捕获设备。图像捕获设备可包括聚焦机构。此外，系统可包括附连到流通池上的成像靶标。成像靶标可沿着成像轴位于离成像窗口表面的第二距离。而且，系统可包括耦合到聚焦机构的处理器。处理器可被配置成通过使图像捕获设备聚焦于靶标并且通过使用第一距离与第二距离之间的已知关系，采集足以对细胞进行表征和计数的流动料流内的粒子的聚焦图像。

在另一方面，本发明的实施例涵盖用于血液流体样品中的细胞的分析的系统。示例性系统可包括具有带有注入管的流路以及具有带有从中穿过的成像轴的成像窗口的流通池。此外，系统可包括与流路流体连通的鞘流体输入口以及与注入管流体连通的血液流体样品输入口。样品流体输入口可被配置用于将血液流体样品注入流通池内的流动鞘流体中以使得血液流体样品以流动料流宽度大于流动料流厚度的样品流动料流流动。此外，系统可包括可沿着成像轴取向的图像捕获设备，并且图像捕获设备可包括聚焦机构。系统还可包括热耦合到流通池的温度传感器以及耦合到温度传感器和聚焦机构的处理器。在一些情况下，处理器被配置成响应于温度的变化以及温度与所需焦点之间的已知关系而调节图像捕获设备的焦点，以足以对细胞进行表征和计数。

根据一些实施例，视觉分析仪可包括耦合到样品源和鞘流体源的流通池。流通池可限定内部流路，并且可被配置成引导被鞘流体包封的样品流穿过流通池中的观察区。分析仪还可包括在与带形样品料流相交的光轴上具有物镜的高光学分辨率成像设备，并且物镜与流通池之间的相对距离可通过电机驱动器的操作来改变，以便在光敏元件阵列上分辨和采集数字化图像。分析仪还可包括具有相对于流通池固定的位置的自聚焦光栅，自聚焦光栅位于离带形样品料流的平面的位移距离处。位移距离可为预定的。分析仪还可包括被配置成照明带形样品料流和自聚焦光栅的光源。此外，分析仪可包括耦合的至少一个数字处理器以操作电机驱动器并分析数字化图像。处理器可被配置成测定自聚焦光栅的焦点位置并且使高光学分辨率成像设备和流通池在离聚焦位置的位移距离内相对地位移，从而使高光学分辨率成像设备聚焦于带形样品料流。根据一些实施例，自聚焦光栅包括具有有限尺寸的形式并且位移距离是足够的使得当聚焦于带形样品料流时所述形式在数字化图像中基本上不可见。在一些情况下，光轴基本上垂直于带形样品料流。

在另一方面，本发明的实施例涵盖使视觉分析仪聚焦以便进行样品分析的方法。示例性方法可包括使高光学分辨率成像设备聚焦于相对于流通池固定的自聚焦光栅，自聚焦光栅位于离带形样品料流的预定的位移距离，高光学分辨率成像设备在与带形样品料流相交的光轴上具有物镜，高光学分辨率成像设备与流通池之间的相对距离可通过电机驱动器的操作来改变，高光学分辨率成像设备被配置成分辨和采集光敏元件阵列上的数字化图像。此外，方法可包括使电机驱动器在位移距离内操作以使高光学分辨率成像设备聚焦于带形样品料流。

在另一方面，本发明的实施例涵盖使样品中的粒子成像的方法。示例性方法可包括为包含悬浮于液体中的粒子的样品提供视觉分析仪，在视觉分析仪中建立具有粘度更高和更低的层状截面的流。分析仪可包括耦合到样品源和耦合到具有比样品粘度更高的粘度的pioal的源的流通池。流通池可限定内部流路，并且可引导被pioal包封的样品流穿过流通池中的观察区。分析仪还可包括在与带形样品料流相交的光轴上具有物镜的高光学分辨率成像设备，并且高光学分辨率成像设备与流通池之间的相对距离可通过电机驱动器的操作来改变，以便在光敏元件阵列上分辨和采集数字化图像。分析仪还可包括具有相对于流通池固定的位置的自聚焦光栅，自聚焦光栅位于已预定的离带形样品料流的平面的位移距离；被配置成照明带形样品料流和自聚焦光栅的光源；耦合以操作电机驱动器并分析数字化图像的至少一个数字处理器，其中处理器被配置成测定自聚焦光栅的焦点位置并且使高光学分辨率成像设备和流通池在离聚焦位置的位移距离内相对地位移，从而使高光学分辨率成像设备聚焦于带形样品料流。在一些情况下，分析仪可包括耦合到样品源和pioal源的流通池，其中流通池限定内部流路并且被配置成引导被pioal包封的样品流穿过流通池中的观察区；与带形样品料流相交的光轴上具有物镜的高光学分辨率成像设备，物镜与流通池之间的相对距离可通过电机驱动器的操作来改变，以便在光敏元件阵列上分辨和采集数字化图像；具有相对于流通池固定的位置的自聚焦光栅，自聚焦光栅位于已预定的离带形样品料流的平面的位移距离；被配置成照明带形样品料流和自聚焦光栅的光源；耦合以操作电机驱动器并分析数字化图像的至少一个数字处理器，其中处理器被配置成测定自聚焦光栅的焦点位置并且使高光学分辨率成像设备和流通池在离聚焦位置的位移距离内相对地位移，从而使高光学分辨率成像设备聚焦于带形样品料流。

在一些情况下，通过本文描述的系统和方法获得的图像可为数字化图像。在一些情况下，所述图像为显微镜图像。在一些情况下，所述图像可以人工方式或自动化方式观察。

当结合附图来考虑时通过参考下文的具体实施方式，本发明实施例的上述特征和许多其他特征以及伴随的优点将会变得显而易见和得到进一步地理解。

附图说明

图1是以部分横截面表示的且未按比例绘制的示意图，显示了用于使用数字图像处理进行样品图像分析的示例性流通池、自聚焦系统和高光学分辨率成像设备的各操作方面。

图1a和1b示出了根据本发明实施例的光具座布置方式。

图1c是根据本发明实施例的血液学分析仪的框图。

图1d示出了根据本发明实施例的方法的流程图。

图1e示出了根据本发明实施例的示例性模块系统的各方面。

图2是根据示例性实施例的流通池的透视图。

图3是沿着图2所示的流通池的线3-3的纵向正中截面图。

图3a和图3b根据本发明实施例提供了流通池的额外的截面图。

图4示出了根据本发明实施例的成像系统的各方面。

图4a、图4b根据本发明实施例描绘了流通池的各方面。

图4a-1和图4a-2根据本发明实施例分别描绘了在插管出口和图像捕获位点的流通池内的鞘流体(例如pioal)包层和样品流体料流尺寸的横截面视图。

图4k和4l示出了根据本发明实施例的流过流通池的图像捕获位点的样品料流。

图4k-1和4k-2示出了根据本发明实施例的靶标成像位点。

图4k-3描绘了根据本发明实施例的样品流动料流中的粒子配向的各方面。

图4l-1描绘了根据本发明实施例的流通池的流路内的流体流动料流速度剖面的各方面。

图4m和4n示出了根据本发明实施例的示例性细胞内粒子配向特征。

图5示出了根据本发明实施例的聚焦技术的各方面。

图6示出了根据本发明实施例的聚焦技术的各方面。

图7和图8根据本发明实施例描绘了流动料流应变速率的各方面。

图9a描绘了根据本发明实施例的示例性自聚焦靶标。

图9b示出了根据本发明实施例的捕获图像。

图10和11描绘了根据本发明实施例的示例性自聚焦靶标。

图12a描绘了根据本发明实施例的示例性自聚焦靶标。

图12b示出了根据本发明实施例的自聚焦靶标的中心部分的近距离视图。

图13a、13b和13c描绘了根据本发明实施例的流通池温度传感器的视图。

图14a和14b提供了根据本发明实施例的截面侧视图，其示出了聚焦系统和方法的各方面。

图14c描绘了根据本发明实施例的流通池的截面侧视图，其示出了聚焦系统和方法的各方面。

图14d提供了根据本发明实施例的截面侧视图，其示出了聚焦系统和方法的各方面。

图15描绘了根据本发明实施例的自聚焦光栅和聚焦技术的各方面。

图16a和16b示出了根据本发明实施例的聚焦系统和方法的各方面。

具体实施方式

本公开涉及用于分析包含粒子的样品的装置、系统、组合物和方法。在一个实施例中，本发明涉及包括分析仪(可以为例如视觉分析仪)的自动化粒子成像系统。在一些实施例中，视觉分析仪还可以包括便于图像的自动化分析的处理器。

示例性粒子可包括如本文所公开的生物流体样品中的任何有形成分，包括例如球形和非球形粒子。pioal使非球形粒子配向于基本上平行于流动方向的平面中，这导致图像优化。pioal还帮助球形细胞将细胞内结构、细胞器或小叶(lobe)定位、重定位和/或更好定位成基本上平行于流动方向。在一些实施例中，作为粒子对血小板、网织红细胞、有核rbc以及wbc(包括中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)和未成熟的wbc(包括母细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞或晚幼粒细胞)计数和分析。

pioal可被引入流通池并将样品输运穿过成像区，然后朝排放口输运。可将样品流体的料流注入穿过具有平坦开口的插管以建立具有相当大的宽度的流路。例如，pioal可具有比样品流体相对更高的粘度、合适的密度，并且在样品注入时的流速使得样品流体变平为薄带形状。样品流体的带与pioal一起被携带通过观察孔的前面，在观察孔中布置高光学分辨率成像设备和光源以观察带形样品料流。

带形样品料流与pioal一起被携带通过观察孔的前面，在观察孔中布置高光学分辨率成像设备和光源(例如，紫外、可见或红外)以观察带形样品料流。高光学分辨率成像设备和光源可设置在流通池的相对侧以便获得粒子诸如血细胞的背光图像。高光学分辨率成像设备通过流通池中的观察孔捕获样品的像素数据图像。例如，高光学分辨率成像设备以与样品流动速度一致的重复率捕获图像，使得带形样品料流的截面在无大量空隙或重叠的情况下成像。

本发明的实施例提供在用于采集流过流通池的带形样品料流的图像的系统的设计和操作中实施的多种独特结构和功能特征。示例性实施例被配置成获得粒子的充分聚焦图像，所述图像具有足够的清晰度和分辨率以揭示各种粒子诸如血细胞的不同特征，所述不同特征允许粒子和/或细胞类型彼此区分开。

为了使带形样品料流聚焦，可设定高光学分辨率成像设备与带形样品料流之间的距离，使得带形样品料流位于沿着光轴离高光学分辨率成像设备的所需距离(例如，聚焦距离)。

聚焦距离是用于分辨光敏元件阵列上的图像的高光学分辨率成像设备的镜头的特性，也就是由镜头元件的材料、形状和尺寸以及其配置和沿着光轴的设置限定。成像的样品的区域的尺寸以及样品中焦点内的视野深度由镜头配置决定。

可以进行孔调节和变焦调节，但出于简明目的，本发明中的某些实施例使得高光学分辨率成像设备聚焦于带形样品料流中的粒子仅仅需要在正确距离，即分辨带形样品料流中的粒子在光敏元件阵列(例如，电荷耦合设备阵列)上的聚焦图像的距离，使高光学分辨率成像设备与流通池中的带形样品料流相对定位。高光学分辨率成像设备可包括记录或传送用于显示和/或处理和/或传输的静态图像或视频图像的相机。

在一个方面，流通池的对称性质以及样品流体与pioal的注入方式为pioal中的带形样品料流提供流通池内的可重复位置。然而，流通池与高光学分辨率成像设备的相对位置可易于改变并且需要不时位置调节以保持高光学分辨率成像设备与带形样品料流之间的最佳距离，从而提供高质量聚焦图像。

本发明的实施例涵盖用于血液和/或其他生物流体的自动化视觉分析仪系统和方法，其结合自聚焦设备/装置以通过非常精确地设定带形样品料流与高光学分辨率成像设备之间的距离来提供样品的可靠聚焦的图像。在一个方面，本文所公开的自聚焦系统实施例可非常精确地设定带形样品料流与高光学分辨率成像设备之间的距离并且捕获样品的可靠聚焦的图像。在一些实施例中，使用算法确定实现良好聚焦结果的距离。

一个目标是采用为包封在pioal流中的带形样品料流提供稳定且高度可重复的位置的流通池，同时结合高光学分辨率成像设备及保持高光学分辨率成像设备和带形样品料流之间的最佳距离的自聚焦设备/装置，从而提供高质量聚焦图像。

此类装置和方法在本文中公开并要求保护。提供了对称流通池，已发现其产生流通池内的可重复带形样品料流位置。聚焦涉及设定高光学分辨率图像设备相对于带形样品料流的完全正确相对位置，以便保持聚焦于带形样品料流。

有利的是，可使用自聚焦光栅诸如高对比度光栅或类似聚焦靶标，优选具有尖锐对比的特征诸如边缘的平坦靶标，在自聚焦过程中使流通池和/或高光学分辨率图像设备相对于彼此移动，所述自聚焦光栅固定在相对于流通池的适当位置并且用作聚焦对象代替样品本身。带形样品料流是沿着平行于高光学分辨率成像设备的光轴的线离自聚焦光栅的固定距离处的薄带。自聚焦光栅与带形样品料流位置之间的位移距离为恒定距离，该距离被初始测定并且编程到自聚焦工序中。其后的示例性技术是自聚焦于自聚焦光栅，然后使高光学分辨率图像设备和/或流通池相对于彼此位移已知且恒定的预定距离，于是高光学分辨率图像设备与带形样品料流位置之间的距离是提供带形样品料流的高质量聚焦图像的最佳距离。例如，首先，自聚焦算法使高光学分辨率成像设备的位置聚焦于位于离带形样品料流的固定距离处的自聚焦光栅。聚焦于自聚焦光栅后，处理器在固定距离内操作电机驱动器，从而使带形样品料流处于高光学分辨率成像设备的焦点内。

示例性高光学分辨率图像设备包括物镜镜头和相关的像素图像传感器，所述像素图像传感器能够捕获图像，所述图像以足够的放大倍数和分辨率揭示粒子以提供分辨粒子的视觉特征的足够细节。在某些实施例中，与传统尿液分析仪相比，放大倍数要高至少2x(因此拍摄的每张图像提供2x图像面积)，从而生成每个粒子的更详细信息。

pioal流路可对称地布置成使得带形样品料流上方和下方流过等量的pioal，pioal使带形样品料流伸展为薄带并定位于沿着平行于高光学分辨率成像设备的光轴的线离自聚焦光栅的固定距离处。在一个实施例中，自聚焦光栅包括在允许来自后照明源的光透过的开口周围的不透明边界，并且自聚焦光栅的距离能容易且明确地通过自聚焦对照物来定位。然后，通过使高光学分辨率成像设备在预定且恒定的位移距离内相对于流通池位移，而使带形样品料流处于焦点中。没有必要直接自聚焦于样品的图像内容，尽管进一步自聚焦是可以想到的。

自动化聚焦配置包括电机驱动器，所述电机驱动器响应于来自评估一系列距离内的聚焦质量的一个或多个量度并寻找最佳距离的处理器的控制信号，而调节沿着光轴的流通池与高光学分辨率成像设备的相对位置。例如，处理器可评估对比度的量度并操作电机驱动器以便自聚焦。在正常操作中，处理器操作电机驱动器以自聚焦于靶标，然后将高光学分辨率成像设备与流通池之间的距离调节所记录的离靶标的位移，以使带形样品料流处于焦点内。只要设备继续以相同方式移动带形样品料流并且不发生热膨胀或类似混杂因素，带形样品料流的图像就将保持在焦点内。

可使用初步的设置或校准过程测定并记录靶标与流通池中的带形样品料流位置之间的位移距离。准确位移距离(不同流通池可能略微不同)通过初步测试来确定，诸如通过交替地对靶标和测试带形样品料流自聚焦若干次，并记录平均结果作为与流通池相关的常数。

因此，将待成像的样品诸如制备的血液样品或另一种类型的样品沿着限定的流路引导穿过流通池中的观察区。pioal流路优选地是对称的并且样品被注入pioal流的中心，其中样品被pioal流包封。样品和鞘流体材料诸如pioal的流速和粘度及密度特性与流通池的轮廓一起配合，以便使带形样品料流形成为一致地在可重复位置处流过观察区的平带。

样品可通过高光学分辨率成像设备的相机部件成像，并且采集的数字图像将通过至少部分自动化的图像分析过程(包括如本文所述的自聚焦过程)进行分析。

一个目标是区分、分类、子分类和/或计数血液样品以及本文所述的其他生物样品中的可能与特定病症相关的粒子诸如血细胞。在一个方面，本发明的粒子对比剂组合物可与视觉分析仪诸如本文所述的分析仪在方法中结合以提供流动细胞的出奇高质量的聚焦图像。可自动捕获并处理细胞。

图像允许自动化的基于图像的wbc分类计数，以及形态异常的自动化识别，其可用于对受试者是健康还是具有疾病、病症、异常和/或感染进行确定、诊断、预后、预测和/或支持诊断，和/或确定或监测受试者对治疗有响应还是无响应。血液样品中的细胞类目和/或亚类目计数在本发明中用作可以分析的流体的分类的非限制性例子。

在一个方面，与本发明组合物一起使用的图像分析仪可通过非常精确地设定带形样品料流与光学系统的高光学分辨率成像设备之间的距离来捕获样品的可靠聚焦的图像。在一些实施例中，视觉分析仪可与本发明的组合物和算法联合使用以确定可实现良好聚焦结果的所述距离。样品被布置在流通池中并且被照明以允许通过观察孔进行观察。单独的细胞或粒子清楚地出现在捕获的像素数据图像中，且具有揭示属性的足够特征细节，然后将所述属性与已知将细胞的各类目和亚类目彼此区分开的参数进行比较和对比。

一个目标是采用流通池，同时结合本文所述的示例性粒子对比剂组合物以及示例性pioal，从而提供对于粒子识别具有最佳质量和细节的图像。另外，pioal和装置为包封在pioal流中的带形样品料流提供稳定且高度可重复的位置。这与高光学分辨率成像设备及保持高光学分辨率成像设备到带形样品料流的最佳距离的自聚焦设备/装置相结合，提供高质量聚焦图像。

在某些方面，分析仪和处理器可被配置成提供另外的信息以校正与粒子计数器相关的分类误差，并且还测定不同类目和/或亚类目的粒子和样品中每种类目或每种亚类目的粒子中的成员的准确粒子计数或浓度。

根据本公开，提供了包括视觉分析仪的系统以获得包含悬浮在液体中的粒子的样品的图像。该系统可用于例如表征生物流体中的粒子，诸如检测和定量红血球、网织红细胞、有核红血细胞、血小板和白血细胞，包括白血细胞分类计数、分类及子分类和分析。还可以想到其他类似用途，诸如表征其他流体中的血细胞。

辨别血液样品中的血细胞是本主题特别适合的示例性应用。样品通过自动化技术制备并作为薄带形样品料流呈递给高光学分辨率成像设备，以在带形样品料流流经视野的同时周期性地成像。粒子(诸如血细胞)的图像可使用像素图像数据编程的处理技术完全自动地或以有限的人工辅助而彼此区分、分类、子分类和计数，以识别和计数细胞或粒子。除了可以存储并使得就粒子的不寻常或关键特征而言可用的细胞图像之外，输出数据还包括在所记录的样品图像中区分的各特定类目和/或亚类目的细胞或粒子的出现次数。

存在于各图像中的不同粒子的计数可进一步处理，例如用于作为一个整体而累积样品中各区分类目和/或亚类目的细胞的准确且统计上显著的比率。用于视觉辨别的样品可进行稀释，但在稀释的样品中各类目和/或亚类目中的细胞的比例依旧，特别是在处理多个图像之后。

本文所公开的装置和方法可用于基于视觉差别而辨别和定量样品中的细胞。样品可以为生物样品，例如包含白血细胞的体液样品，包括但不限于血液、血清、骨髓、灌洗液、积液、渗出液、脑脊髓液、胸膜液、腹膜液和羊水。在一些实施例中，样品可以为实体组织样品，例如，已进行了处理而产生细胞悬液的生物活检样品。样品也可以为通过处理粪便样品而得到的悬液。样品也可以为包含粒子的实验室或生产线样品，诸如细胞培养样品。术语样品可用于指代得自患者或实验室的样品或其任何级分、部分或等分试样。样品可在一些过程中进行稀释、分成多个部分或进行染色。

在一个方面，本公开的系统、组合物和方法提供流动中的细胞的令人惊讶的高质量的图像。在一个方面，视觉分析仪可用于本公开的方法以提供自动化的基于图像的wbc分类计数。在某些实施例中，本公开的方法涉及视觉差别(包括形态特征和/或异常)的自动化识别，以用于对受试者是健康还是具有疾病、病症、异常和/或感染和/或对治疗响应还是无响应进行确定、诊断、预后、预测和/或支持诊断。该系统在一些实施例中还可以包括粒子计数器。应用包括对流体样品(诸如血液样品)中的细胞进行分类和/或子分类以及计数。也设想了用于对另外类型的粒子和/或其他流体样品中的粒子进行计数的其他类似的用途。本发明的系统、组合物和方法可用于采用任何合适的自动化粒子识别算法进行实时分类及子分类以及图像观察。可存储各样品的捕获图像以日后观察。

在另一方面，本发明的装置、组合物和方法提供令人惊讶更准确的基于图像的细胞分类及子分类和标记，与使用目前的自动化分析仪时的人工复查率相比，所述标记降低人工复查率。所述系统、组合物和方法降低人工复查率并允许在仪器上进行人工复查。此外，本公开的系统、组合物和方法还降低在自动化分析期间标记为需要人工复查的样品的百分比。

本公开还涉及用于将全血计数(cbc)计数器与分析仪(诸如视觉分析仪)相结合的系统、方法和组合物，以便得到cbc以及基于图像的扩展白血细胞分类计数和基于图像的扩展血小板计数，从而延伸血小板计数的有效检测范围。

因此，在一些实施例中，本公开提供用于分析包含粒子(例如，血细胞)的样品的装置和方法。根据本公开，提供视觉分析仪以获得包含悬浮在液体中的粒子的样品的图像。在一些实施例中，视觉分析仪包括流通池和自聚焦部件，其中使包含所关注粒子的液体样品流过具有观察孔的流通池，而耦合到物镜镜头的相机通过所述观察孔捕获粒子的数字图像。流通池耦合到样品流体源，诸如经稀释和/或处理的血液样品或如本文所述的其他体液样品，并耦合到透明鞘流体或粒子和/或细胞内细胞器配向液体(pioal)源。

在一个实施例中，所述装置还包括具有至少一个检测范围的粒子计数器，以及分析仪和处理器。所述分析仪和处理器被配置成提供另外的信息以校正与粒子计数器相关的计数、分类和子分类误差，并且还确定样品中不同类目和/或亚类目的粒子的准确粒子计数或浓度。

本公开在进行基于图像的样品分析中提供可用于粒子和/或细胞内细胞器配向的方法和组合物。在一些实施例中，本公开涉及用于组合式计数和成像系统的方法和组合物，该系统能够执行全血计数(wbc)和基于图像的扩展白血细胞(wbc)分类，而能够鉴定并计数细胞类型，诸如wbc、rbc和/或血小板，包括例如中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、网织红细胞、有核rbc、母细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞或晚幼粒细胞，并提供wbc计数和形态、红血细胞(rbc)计数和形态以及血小板(plt)计数和形态的基于图像的信息。

在其他实施例中，本公开涉及可用于如本文所述的基于图像的粒子分析的pioal。血液样品中的细胞分类和/或子分类计数在本公开中用作可以分析的样品的分类的非限制性例子。在一些实施例中，存在于样品中的细胞还可以包括细菌或真菌细胞以及白血细胞、红血细胞和/或血小板。在一些实施例中，可以分析得自组织或抽吸物的粒子悬液。

辨别血液样品中的血细胞是本主题特别适合的示例性应用。将样品通过自动化技术制备并以带形样品料流形式呈递给高光学分辨率成像设备以在样品流过视野时使其周期性地成像。可使用像素图像数据程序化处理技术仅仅自动地或在有限人工辅助的情况下将粒子(诸如血细胞)的图像彼此区分开、分类、子分类和/或计数，以识别和计数细胞或粒子。除了细胞图像(其可在异常或关键特征的情况下存储和供使用)之外，输出数据包括所记录样品图像中区分开的各特定类目和/或亚类目的细胞或粒子的出现次数。可进一步处理存在于每个图像中的不同粒子的计数，例如用于积累整体样品中每种区分开的类目和/或亚类目的细胞的准确且统计上显著的成比例比率或其函数。也可高度稀释用于视觉区别的样品，但在稀释样品的分布中每种类目和/或亚类目中的细胞的比例依旧，特别是在已处理多个图像后。

在一些方面，样品以自动方式呈递、成像和分析。就血液样品而言，样品可用水或盐水溶液进行充分稀释，这降低一些细胞的视野在未稀释或稀释不够的样品中可能被其他细胞隐藏的程度。细胞可用增强一些细胞方面的对比度的试剂加以处理，例如使用透化剂使细胞膜为可渗透的，以及使用组织学染剂粘附并揭示特征，诸如颗粒和细胞核。在一些实施例中，可能有利的是，对样品的等分试样进行染色以用于对包括网织红细胞、有核红血细胞和血小板的粒子进行计数和表征，以及用于白血细胞分类、表征和分析。在其他实施例中，包含红血细胞的样品可在引入流通池并成像之前进行稀释。

样品制备装置以及用于样品稀释、透化和组织学染色的方法的细节通常使用由一个或多个可编程控制器操作的精密泵和阀实现，并且不是本公开的核心。例子可见于转让给国际遥感成像系统公司(internationalremoteimagingsystems,inc.)的专利，诸如关于可编程控件的us7,319,907。同样，用于借助其属性(诸如相对尺寸和颜色)而区分某些细胞分类和/或子分类的技术可见于与白血细胞相关的us5,436,978。这些专利的公开内容据此以引用方式并入。

为了提高对诸如细胞的粒子进行分类和/或子分类的能力、速度和有效性，有利的是提供清晰的高质量血液细胞图像以通过数据处理系统进行自动化分析。根据本公开，将制备的样品料流以在流通池的相对壁之间具有稳定位置的薄带形式布置。样品料流的定位且其变平成薄带形状可通过引入流通池的pioal的层之间的流动而实现，所述pioal与样品流体的粘度不同并流过对称流动通道。

pioal具有合适的粘度和密度，并且在样品引入流通池时的流速使得样品流体变平为薄带。带形样品料流与pioal一起被携带通过观察孔的前面，其中物镜镜头和光源被布置成允许观察带形样品料流。将样品流体引入，例如，在pioal的流路对称变窄的点处注入。因此，样品流体料流变平并被拉伸成薄带。本公开的pioal可作为鞘流体与本公开的任何视觉分析仪一起使用。在一个实施例中，可将pioal引入流通池的末端以将样品流体一起带向排放口。

观察区中的带形样品料流的尺寸受pioal流路的几何变薄以及样品流体和pioal的差异线速度(导致带形样品料流的变薄和拉伸)的影响。样品与pioal的初始差异线速度可在0.5:1至5:1的范围内。pioal流路横截面可通过降低深度而变薄约10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1、100:1、105:1、110:1、115:1、125:1、130:1、140:1、150:1、160:1、170:1、180:1、190:1或200:1的因子。在一个实施例中，几何变薄为40:1。在一个实施例中，几何变薄为30:1。所考虑的因素为穿过流通池的通过时间，样品通量的所需速率，实现与粒子尺寸相当的带形样品料流厚度，获得粒子和细胞器的配向，实现粒子的焦点内内容物，在操作限值内平衡压力、流动和粘度，优化带形样品料流厚度，获得所需的线速度，可制造性考量，以及所需的样品和pioal体积。

可对插管的长度和容积以及横截面变平进行选择以缩短样品流动不稳定的时期，从而提高通量。在一些实施例中，流动不稳定的时期可小于约3、2.75、2.5、2.25、2、1.75、1.5、1.25或小于约1秒。较小的插管容积也可缩短所述时间并减小在样品运行之间清洗插管所需的稀释剂的体积。在一些实施例中，穿过流通池的通过时间为1、2、3或4秒，或那些时间中任何两个之间的任何范围。在一些实施例中，该通过时间可小于4、3或2秒。

样品流体和pioal的粘度和流速以及流通池的轮廓被布置成使得pioal流变平并将样品流拉伸成薄带，所述薄带在可靠位置一致地穿过观察区。样品流体料流可被压缩成大约2至3μm的流体流厚度。若干血细胞类型都具有大于料流厚度的直径。在平行于流动方向的方向上的剪切力导致在成像条件下在高光学分辨率成像设备的焦平面中粒子的图像投影增加和/或导致粒子内结构(例如，细胞内结构、细胞器或小叶)定位、重定位和/或更好地定位成基本上平行于流动方向。高光学分辨率成像设备视野深度最多为7μm，例如1-4μm。

与带形样品料流一起携带的pioal的流动横截面穿过观察孔(物镜镜头被引导穿过其中)前面的观察区时保持一致。物镜镜头可以是高光学分辨率成像设备或数字图像捕获设备的物镜部件。带形样品料流在流通池内的已知且可重复的位置处(例如，在离流通池的两个壁的已知且可重复的距离处)顺着横跨观察区的路径流动，并在下游排放。

当带形样品料流被携带穿过观察孔前面的观察区时，来自样品中的粒子的光学信息通过分析仪中的检测段检测，从而生成来自样品中所含粒子/细胞的数据。使用该分析仪允许对样品中所含的细胞和/或粒子进行捕获、处理、分类及子分类和计数。pioal液体可通过添加粘度改性剂、缓冲剂、ph调节剂、抗微生物剂、离子强度改性剂、表面活性剂和/或螯合剂而制备。本公开中的分析仪的示例性功能部件和/或特征可包括例如采集和/或处理来自图像分析、样品染色处理、图像处理和/或粒子图像识别、计数和/或分类及子分类的数据的能力。

在一个实施例中，本公开基于以下令人惊讶且出人意料的发现：在pioal中添加适量的粘度剂明显改善流通池中的粒子/细胞配向，从而使焦点内细胞或细胞组分的百分比更高，以及使流动中的细胞和/或粒子的图像的质量更高。添加粘度剂增加对细胞(比如rbc)的剪切力，这改善在基本上平行于流动方向的平面中的细胞配向，从而导致图像优化。这还导致粒子内结构(诸如细胞内结构、细胞器或小叶)基本上平行于流动方向而定位、重定位和/或更好地定位，从而导致图像优化。粘度剂还减少细胞的不良配向，所述细胞通常为直径比流动料流小的细胞，但不限于这些细胞。

直径比流动料流小的细胞(例如，红血细胞)的配向可通过例如增大pioal的粘度或通过增大流速比而获得。这导致rbc平行于流动方向配向。在一些实施例中，rbc不良配向的减少和/或rbc配向的增加通过增大pioal的粘度而实现。

带形样品料流厚度可受样品流体和pioal的相对粘度和流速的影响。样品源和/或pioal源(例如，包括精密容积泵)可被配置成以受控的流速提供样品和/或pioal以优化带形样品料流的尺寸，即作为至少与高光学分辨率成像设备或数字图像捕获设备的视野一样宽的薄带。

与带形样品料流一起携带的pioal的流动横截面穿过观察孔(高光学分辨率成像设备穿过其中而定向)前面的观察区时保持一致带形样品料流在离流通池前壁和后壁任一者的已知且可重复的距离处顺着横跨观察区的路径流动，并在其下游排放。

在一些实施例中，在本发明的任何组合物和/或方法中得到的图像可以为数字化图像。在一些实施例中，所得的图像为显微镜图像。在某些实施例中，所述图像可以人工方式获得。在其他实施例中，获得图像的程序的至少一部分为自动化的。在一些实施例中，使用包括流通池、高光学分辨率成像设备或数字图像捕获设备(任选地具有自聚焦特征)的视觉分析仪获得图像。

在一个实施例中，图像提供与细胞的细胞质、细胞核和/或细胞核组分相关的信息。在一个实施例中，图像提供与细胞的颗粒组分和/或其他形态特征相关的信息。在一个实施例中，图像提供与细胞的细胞质、细胞核和/或颗粒组分相关的信息。颗粒和/或细胞核图像和/或特征对细胞分类及子分类而言，是独立地或彼此相结合地决定性的。

在本发明方法的一个方面，与粒子对比剂组合物接触和/或成像的细胞为有核红血细胞。在另一个方面，本发明的方法涉及用于执行基于图像的红血细胞分类及子分类的方法，其包括：a)对红血细胞的一部分成像；以及b)确定所成像的红血细胞的形态。如本文所用，红血细胞(rbc)可包括例如正常或异常的红血细胞、网织红细胞、有核红血细胞和/或疟疾感染的细胞。在一些实施例中，使用本公开的装置(诸如包括粒子计数器、视觉分析仪和处理器的装置)进行成像。

如本文所用，示例性全血计数(cbc)可包括医生或其他医疗专业人员通常需要的测试板，其提供关于患者血液样品中的粒子和/或细胞的信息。在血流中循环的示例性细胞可通常分成三种类型：包括但不限于例如白血细胞(例如，白血球)、红血细胞(例如，红血球)和血小板(例如，凝血细胞)。

如本文所用，异常高或低的计数可指示存在疾病、障碍和/或病症。因此，cbc是在医学中常常进行的血液检验中的一种，因为其可提供患者一般健康状态的概况。因此，cbc通常在年度体检期间进行。

如本文所用，通常采血师从受试者采集血液样品，而血液一般被抽入通常容纳有抗凝剂(例如edta，有时为柠檬酸盐)以防止其凝结的试管。然后将样品转运到实验室。有时，用巴斯德吸管穿刺手指而抽吸血液以通过自动化计数器立即处理。在一个实施例中，在粒子被包封在鞘流体或pioal中的同时获取粒子图像。在某些实施例中，可在显微镜下在用患者血液的样品制作的载玻片上观察血液样品(血膜或外周涂片)。在某些实施例中，通过自动化分析仪进行全血计数。

如本文所用，一般来讲，血液分析仪可通过窄管路抽吸非常少量的样本。传感器可检测通过管路的细胞的计数和/或数量，并且可识别细胞的类型。示例性传感器可包括光(例如，可见、uv或ir)和/或电阻抗的检测器。示例性检测参数可包括尺寸、体积和/或细胞特征。在某些实施例中，传感器可检测约200nm至约10000nm范围内的波长谱中的可见和不可见光。在某些实施例中，传感器可检测约380nm与约760nm之间的波长。

如本文所用，血液计数的数据/参数包括例如总红血细胞；血红蛋白-血液中血红蛋白的量；血细胞比容或红细胞压积(pcv)；平均红细胞体积(mcv)-红细胞的平均体积(基于该值是高于还是低于预期正常范围而将贫血分类成小红细胞性或大红细胞性贫血。可影响mcv的其他病症包括地中海贫血、网状细胞过多症和酒精中毒)；平均红细胞血红蛋白(mch)-每个红血细胞的血红蛋白的平均量，单位为微微克；平均红细胞血红蛋白浓度(mchc)-细胞中的血红蛋白的平均浓度；红血细胞分布宽度(rdw)-rbc群体的细胞体积的变化；总白血细胞；中性粒细胞(可指示细菌感染，通常在急性病毒感染中增加)。由于细胞核的分段式外观，中性粒细胞有时称为“segs”(分段中性粒细胞)。不太成熟的中性粒细胞的细胞核不分段，但具有带式或细长形状。不太成熟的中性粒细胞(最近从骨髓释放到血流中的那些)称为“band”(带状中性粒细胞)。血细胞计数的其他数据/参数也可包括例如淋巴细胞(例如，在一些病毒感染诸如腺热的情况下以及在慢性淋巴细胞白血病(cll)中增加，或因hiv感染而减少)；单核细胞(可在细菌感染、肺结核、疟疾、落基山斑疹热、单核细胞性白血病、慢性溃疡性结肠炎和局限性肠炎中增加)；嗜酸性粒细胞(例如，在寄生虫感染、哮喘或变态反应中增加)；嗜碱性粒细胞(例如，在骨髓相关病症诸如白血病或淋巴瘤中增加)。

如本文所用，血液计数的数据/参数还可以包括例如与血小板相关的数据，包括血小板数、其在血液中的大小和大小范围的相关信息；平均血小板体积(mpv)-血小板平均大小的度量。

在本发明的方法的另一个方面，与粒子对比剂组合物接触和/或成像的细胞为异常细胞，诸如疟疾感染的细胞、非典型淋巴细胞。在本发明的一些方面，细胞是可用于对病症、疾病、感染和/或综合征识别、预测、诊断、预后或支持诊断的异常细胞。

在本发明的方法的另一方面，细胞为血小板。

除非另外明确指明，否则本发明中提及的“粒子”应当理解为涵盖分散于流体中的任何离散的或有形的物体。如本文所用，“粒子”可包括生物流体中的所有可测量且可检测(例如，通过图像和/或其他可测量参数)的组分。粒子具有任何材料、任何形状和任何尺寸。在某些实施例中，粒子可包括细胞。粒子的例子包括但不限于细胞，包括血细胞、胎儿细胞、上皮细胞、干细胞、肿瘤细胞，或细菌、寄生生物或任何前述例子的碎片或生物流体中的其他碎片。血细胞可以为任何血细胞，包括可能存在于生物流体中的任何正常或异常、成熟或未成熟的细胞，例如红血细胞(rbc)、白血细胞(wbc)、血小板(plt)和其他细胞。成员也包括未成熟的或异常的细胞。未成熟的wbc可包括晚幼粒细胞、中幼粒细胞、早幼粒细胞和母细胞。除了成熟的rbc之外，rbc的成员还可以包括有核rbc(nrbc)和网织红细胞。plt可包括“巨大”plt和plt团块。血细胞和有形成分在本公开的其他地方进一步描述。

示例性例子可包括生物流体样品中的有形成分，包括例如球形和非球形粒子。在某些实施例中，粒子可包括非球形组分。非球形组分的图像投影可在高光学分辨率成像设备的焦平面中最大化。在某些实施例中，非球形粒子在高光学分辨率成像设备的焦平面中配向(在基本上平行于流动方向的平面中配向)。在一些实施例中，作为粒子对血小板、网织红细胞、有核rbc以及wbc(包括中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)和未成熟的wbc(包括母细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞或晚幼粒细胞)计数和分析。

如本文所用，可检测和可测量的粒子参数可包括例如大小、形状、对称性、轮廓和/或其他特性的基于视觉和/或非图像的指标。

样品可为分离和/或制备的生物样品，包括例如体液样品、血液、血清、脑脊髓液、胸膜液、腹膜液、唾液、精液、泪液、汗液、母乳、羊膜液、灌洗液、骨髓穿刺液、渗漏液、渗出液、或从受试者获得的其他样品(例如，经处理产生细胞悬液的活检样品、或包含粒子的实验室或生产线样品)。在一些实施例中，样品可以为实体组织样品，例如，已进行了处理而产生细胞悬液的生物活检样品。样品也可以为通过处理粪便样品而得到的悬液。样品也可为包含粒子的实验室、化学、工业或生产线样品，诸如细胞培养样品。术语样品可用于指代得自患者或实验室的样品或其任何级分、部分或等分试样。在一些方法中可将样品稀释、分成多个部分、或用对比剂处理。

本文所公开的方法适用于来自广泛生物体的样品，所述生物体包括哺乳动物，例如人类、非人灵长类(例如，猴)、马、牛或其他牲畜、狗、猫或其他作为宠物饲养的哺乳动物、大鼠、小鼠或其他实验室动物；禽类，例如鸡；爬行动物，例如短吻鳄；鱼类，例如鲑鱼或其他养殖品种；以及两栖动物。

可通过任何常规方法，例如排泄、抽取、收获、抽吸或活检，来获得样品。样品可来自被认为健康的受试者，例如作为日常体检的一部分而采集的样品。样品也可来自具有失调、有失调风险或疑似具有失调的受试者。失调可由疾病、遗传异常、感染、损伤或未知原因引起。作为另外一种选择或除此之外，方法可用于在治疗失调的过程期间监测受试者。如果存在对治疗和/或疗法的非响应性的迹象，临床医生可选择替代或辅助药剂。根据受试者的病症和具体失调(如果有的话)，可每日、每周、每月或每年采集一次(或两次、三次等等)样品。

粒子可根据样品而有所差异。粒子可为生物细胞，例如，血细胞、胎儿细胞、干细胞、肿瘤细胞或其碎片。在一些实施例中，粒子可为感染因子，例如病毒或细菌。

本发明中提及的“血细胞”应当理解为涵盖可能存在于生物流体中的任何正常或异常、成熟或未成熟细胞，例如，红血细胞(rbc)、白血细胞(wbc)、血小板(plt)和其他细胞。一般来讲，正常rbc、plt和wbc分别具有6-8μm、2-3μm和8-15μm范围内的粒径。正常rbc、plt和wbc分别以3.9-5.7×10¹²个细胞/l、1.4-4.5×10¹¹个细胞/l、3.5-11×10⁹个细胞/l的近似浓度范围存在于来自正常患者的全血样中。参见barbaraj.bain,bloodcells,apracticalguide,4thed.,blackwellpublishing,2007,34-36(barbaraj.bain，《血细胞，实用指南》，第4版，布莱克威尔出版公司，2007年，第34-36页)。

提及的“有形成分”应当理解为涵盖存在于生物流体样品中的非流体成分。有形成分包括例如基于科学分类或生理功能的血细胞的类别，包括红血球(rbc)、白血球(wbc)和血小板(plt)、wbc团块、白血球的亚类别，所述白血球的亚类别包括成熟淋巴细胞和未成熟白血球诸如单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞。可用于本文的“有形成分”也将包括粒子诸如微生物、细菌、真菌、寄生生物或其碎片或其他细胞碎片。wbc的主要成员包括但不限于中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。成员也包括未成熟的或异常的细胞。例如，未成熟wbc可包括晚幼粒细胞、中幼粒细胞、早幼粒细胞。除了成熟的rbc之外，rbc的成员还可以包括有核rbc(nrbc)和网织红细胞。plt可包括正常plt和“巨大”plt，“巨大”plt的尺寸接近正常wbc的尺寸。本发明中提及的一类目和/或亚类目粒子的“成员”应当理解为涵盖一类目或亚类目粒子内的单独粒子。

除非另外明确指明，本发明中提及的一“类目”粒子应当理解为涵盖使用至少一种测量的、检测的或推导的检测标准诸如尺寸、形状、质构或颜色所检测的一群粒子。在一些实施例中，通过本发明的装置计数的至少一种类目和/或亚类目的粒子的成员将为有形成分的相同类型。

此类粒子可在“通道”中检测。本发明中提及的“通道”应当理解为涵盖粒子计数器的一部分，该部分包括耦合到信号源的检测器，从而提供随符合至少一个通道检测标准的粒子的较强或较弱检测而变化的输出。例如，通道检测标准可基于粒子的尺寸或体积。在一些实施例中，粒子计数器中的通道数量为一个。在一些其他实施例中，粒子计数器中的通道数量为两个或更多个。

粒子计数器的一个通道中检测到的一种类目和/或亚类目的粒子可包括不同类别和亚类别的粒子以及两种或更多种亚类别的粒子的成群成员。本发明中提及的一“类目”粒子应当理解为涵盖与测量的、检测的或推导的标准诸如尺寸、形状、质构或颜色相对应的一群粒子。在一些实施例中，通过本发明的装置计数的至少一种类目和/或亚类目的粒子的成员将为有形成分的相同类型。

如本文所用，术语高光学分辨率成像设备可包括能够获得粒子图像的设备，所述图像具有充分的视觉差别以区分形态特征和/或变化。示例性高光学分辨率成像设备可包括光学分辨率为1μm或更低(包括例如0.4至0.5μm，诸如0.46μm)的设备。

如本文所用，粒子对比剂组合物可适于与粒子和/或细胞内细胞器配向液体(pioal)组合用于视觉分析仪以分析得自受试者的样品中的粒子。示例性pioal可用于例如得自受试者的样品中的不同类型的粒子的自动化识别方法。

在另一方面，在获得图像时细胞可被包封在pioal中。在本文描述了合适的示例性细胞内细胞器配向液体。

如本文所用，“配向”可部分通过球形和/或非球形粒子的配向来表征。例如，粒子诸如非球形粒子可配向在基本上平行于流动方向的平面中。在某些实施例中，非球形粒子的配向通过这样的粒子取向来表征，该取向增大了非球形粒子在成像条件下在高光学分辨率成像设备的焦平面中的图像投影。粒子诸如球形粒子可具有增加量的粒子和细胞的焦点内粒子内内容物，从而能有效地产生用于粒子分类和子分类的视觉差别。粒子诸如球形粒子的粒子内结构可定位、重定位和/或更好定位成基本上平行于流动方向。例如，细胞内结构、细胞器或小叶也可定位、重定位和/或更好定位成基本上平行于流动方向。

本发明中提及的一“类别”粒子应当理解为涵盖基于科学分类的一群粒子。例如，三种主要类别的血细胞存在于全血样中，包括rbc、wbc和plt。

本发明中提及的粒子的“成员”应当理解为涵盖一类目或亚类目粒子中的粒子。例如，每种类目的血细胞可进一步分成亚类目或成员。wbc的主要成员包括但不限于中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。成员也包括未成熟的或异常的细胞。例如，未成熟wbc可包括晚幼粒细胞、中幼粒细胞和早幼粒细胞。除了成熟的rbc之外，rbc的成员还可以包括有核rbc(nrbc)和网织红细胞。plt可包括正常plt和“巨大”plt，“巨大”plt的尺寸接近正常wbc的尺寸。

提及的“未成熟细胞”应当理解为涵盖某些发育阶段中，例如骨髓内部或从骨髓释放不久之后但在完全发育成成熟细胞之前的细胞。

提及的“异常细胞”应当理解为涵盖具有异常形态特性的细胞或与某些疾病或病症相关的细胞、或者可能在某些情况下与某些疾病或病症相关的异常。特定疾病的例子包括但不限于红细胞增多症、多血症、贫血症、幼红细胞减少症、白细胞增多症、白细胞减少症、淋巴细胞增多症、淋巴细胞减少症、粒细胞增多症、粒细胞减少症或粒细胞缺乏症、中性粒细胞增多症、中性粒细胞减少症、嗜酸性粒细胞增多症、嗜酸性粒细胞减少症、嗜碱性粒细胞增多症、嗜碱性粒细胞减少症、血小板增多症、血小板减少症和全血细胞减少症。一种类别的细胞在血流中可增多或减少。在一些条件下，比正常白细胞大得多的异常细胞以小浓度存在于血液样品中。尺寸、形状、颜色和/或细胞内结构的变化可与某些疾病或病症相关。

本发明中提及的粒子的“计数”或“粒子计数”应当理解为涵盖从粒子计数器的一个通道获得的粒子的数量。本发明中提及的粒子的某类别或成员的“浓度”应当理解为意指每单位体积(例如每升)或已知体积的每个样品的粒子的数量。例如，粒子计数器可为各类目的粒子提供计数或浓度或其他基于计数的函数，同时视觉分析仪可为每种类目或亚类目的粒子提供计数、浓度、比率或其他基于浓度的参数。

本发明中提及的“比率”应当理解为涵盖粒子的两种类目/亚类目、类别或成员的任何定量的和/或成比例的比率。此类比率的例子包括但不限于按浓度、重量和/或按粒子数量的比率。通常比率涉及一种类目、类别或成员的计数相对于另一种这样的类目、类别或成员的计数的数字分数。在一些实施例中，也可使用加权的计数或加权的和/或成比例的比率进行确定。

血液学–粒子分析系统

现在转到附图，图1示意性地示出了示例性流通池22，所述流通池用于将样品流体传送经过高光学分辨率成像设备24的观察区23，所述高光学分辨率成像设备被配置用于使用数字图像处理使样品流动料流32中的微观粒子成像。流通池22耦合到可经受处理(诸如与粒子对比剂组合物接触并加热)的样品流体源25。流通池22还耦合到一个或多个粒子和/或细胞内细胞器配向液体(pioal)源27，诸如粘度大于样品流体的粘度的透明甘油溶液。

样品流体被注入通过样品进料管29的远端28的变平开口，并在一定的点进入流通池22的内部，在所述点已基本上确立了pioal流，从而在带形样品料流的上方和下方(或在其相对侧上)产生稳定和对称的pioal层流。样品和pioal料流可由精密计量泵提供，该泵使pioal与注入的样品流体一起沿着基本上变窄的流路移动。pioal在流路变窄的区21中包封并压缩样品流体。因此，在区21的流路厚度降低可有助于样品料流32的几何聚焦。样品流体带32被包封并与pioal一起被携带到变窄区21的下游，从而在高光学分辨率成像设备24的观察区23前面通过或以其他方式穿过观察区23，在所述成像设备中例如使用ccd48采集图像。处理器18可接收来自ccd48的像素数据作为输入。样品流体带与pioal一起流向排放口33。

如这里所示，变窄区21可具有近侧流路部分21a和远侧流路部分21b，近侧流路部分具有近侧厚度pt而远侧流路部分具有远侧厚度dt，以使得远侧厚度dt小于近侧厚度pt。样品流体可因此在位于近侧部分21a远侧和远侧部分21b近侧的位置注入通过样品管29的远端28。因此，当pioal料流被区21压缩时，样品流体可进入pioal包层，其中样品流体注入管具有远侧出口，样品流体穿过该远侧出口注入流动鞘流体中，该远侧出口由流通池的流路尺寸的缩减段界定。

具有物镜镜头46的数字高光学分辨率成像设备24沿着与带形样品料流32相交的光轴而定向。物镜46和流通池33之间的相对距离可通过操作电机驱动器54而改变，以便在光传感器阵列上分辨和采集聚焦的数字化图像。

本发明提供自动实现高光学分辨率成像设备24的正确工作位置以对带形样品料流32聚焦的技术。流通池结构22可被配置成使得带形样品料流32在限定样品流体的流路的流通池内具有固定且可靠的位置，以pioal层之间的薄带形式穿过流通池22中的观察区23。在某些流通池实施例中，pioal的流路的横截面在一定点处对称变窄，在该点处将样品插入穿过平坦孔口诸如在孔口具有矩形内腔的管29、或插管。变窄流路(例如，以20:1的比率或以20:1至70:1之间的比率在横截面积上几何变窄)连同pioal与样品流体之间的粘度差以及任选地与样品流相比的pioal的线速度差配合使样品横截面以约20:1至70:1的比率压缩。在一些实施例中，该横截面厚度比率可为40:1。

在一个方面，流通池22的对称性质以及样品流体与pioal的注入方式为两层pioal之间的带形样品料流32提供流通池22内的可重复位置。因此，方法变量(诸如样品和pioal的特定线速度)不会倾向于使带形样品料流从其流动位置发生位移。相对于流通池22的结构，带形样品料流32位置是稳定且可重复的。

然而，流通池22与光学系统的高光学分辨率成像设备24的相对位置可易于改变并且可受益于不时位置调节以保持高光学分辨率成像设备24与带形样品料流32之间的最佳或所需距离，从而提供带形样品料流32中的包封粒子的高质量聚焦图像。根据一些实施例，高光学分辨率成像设备24与带形样品料流32之间可存在获得包封粒子的聚焦图像的最佳或所需距离。可首先通过自聚焦或其他技术使高光学分辨率成像设备24位于离具有相对于流通池22的固定位置的自聚焦靶标44的最佳或所需距离处，从而将光学器件相对于流通池22准确地定位。例如由于初始校准步骤，精确地知道自聚焦靶标44与带形样品料流32之间的位移距离。在对自聚焦靶标44自聚焦后，然后使流通池22和/或高光学分辨率成像设备24在自聚焦靶标44与带形样品料流32之间的已知位移距离内位移。因此，高光学分辨率成像设备44的物镜镜头精确聚焦于包含包封粒子的带形样品料流32。

本发明的示例性实施例涉及对聚焦或成像靶标44自聚焦，成像靶标44是限定沿着高光学分辨率成像设备或数字图像捕获设备24的光轴的已知位置的高对比度图形。靶标44可具有相对于带形样品料流32的位置的已知位移距离。对比度测量算法可特别地用于靶标特征。在一个例子中，高光学分辨率成像设备24的位置可沿着平行于高光学分辨率成像设备或数字图像捕获设备的光轴的线改变，以找到这样的深度或距离，在该深度或距离处，在沿着图像中已知与对比图形的边缘交叉的像素的线出现的各像素亮度值中可发现一个或多个最大差分幅度。在一些情况下，自聚焦光栅沿着平行于光轴的线没有变化，该线也是这样的线，机动化控制器沿着该线操作以调节高光学分辨率成像设备24的位置，从而提供记录的位移距离。

这样，可能不必要自聚焦或依靠于可在不同图像之间变化、就对比度而言不太高度受限定、或可能位于一系列位置的某处的图像内容方面，作为确定供参考的距离位置的基础。由于发现了对于自聚焦靶标44的最佳或所需焦点的位置，高光学分辨率成像设备物镜24与流通池22的相对位置可位移记录的位移距离从而为带形样品料流32中的粒子提供最佳或所需焦点位置。

根据一些实施例，高光学分辨率成像设备24可分辨如由穿过照明开口(窗口)43施加的光源42所背光照明的带形样品料流32的图像。在图1中所示的实施例中，照明开口43的周边形成自聚焦靶标44。然而，目标是通过光敏元件阵列上的高光学分辨率成像设备光学器件46，诸如集成电荷耦合设备，来采集带形样品料流32的精确聚焦图像。

高光学分辨率成像设备24及其光学器件46被配置成分辨在距离50处位于焦点内的带形样品料流32中的粒子的图像，所述距离可以是光学系统的尺寸、镜头的形状、以及其材料的折射率的结果。在一些情况下，高光学分辨率成像设备24与带形样品料流32之间的最佳或所需距离并未变化。在其他情况下，可改变流通池22与高光学分辨率成像设备及其光学器件46之间的距离。高光学分辨率成像设备24和/或流通池22相对于彼此移动得更靠近或进一步分开(例如，通过调节成像设备24与流通池22之间的距离51)使聚焦点的位置移动到相对于流通池的距离50的末端。

根据本发明的实施例，聚焦靶标44可位于离带形样品料流32的一定距离处，在这种情况下在来自照明源42的光所用的开口43的边缘处直接固定于流通池22。聚焦靶标44位于离带形样品料流32的恒定位移距离52处。通常，位移距离52是恒定的，因为带形样品料流32在流通池中的位置保持恒定。

示例性自聚焦工序涉及使用电机54调节高光学分辨率成像设备24与流通池22的相对位置以达到适当的焦距，从而使高光学分辨率成像设备24聚焦于自聚焦靶标44。在该例子中，自聚焦靶标44位于流通池中的带形样品料流32的后面。然后使高光学分辨率成像设备24朝向或远离流通池22移动直到自聚焦工序确定光敏元件上分辨的图像是自聚焦靶标44的精确聚焦图像。然后操作电机54以使高光学分辨率成像设备24与流通池22的相对位置位移，使得高光学分辨率成像设备聚焦于带形样品料流32，也就是通过使高光学分辨率成像设备24远离流通池22移动精确的位移距离52的跨度来进行。在该示例性实施例中，成像设备24被示出为通过电机54来移动以到达焦点位置。在其他实施例中，通过类似装置移动流通池22或移动流通池22和成像设备24两者而获得聚焦图像。

如果聚焦靶标44位于与后照明窗口43对置的前观察孔窗口上，则这些移动方向当然会反向。在这种情况下，位移距离将是前观察孔(未示出)处带形样品料流32与靶标44之间的跨度。

位移距离52等于沿着高光学分辨率成像设备24的光轴的带形样品料流32与自聚焦靶标44之间的距离，其可在工厂校准步骤中确定或由用户确定。通常，一旦确定，位移距离52就不会变化。热膨胀变化和振动可导致高光学分辨率成像设备24和流通池22的精确位置相对于彼此改变，从而需要自聚焦过程的再引发。但对靶标44的自聚焦提供相对于流通池22固定从而相对于带形样品料流32固定的位置参照。同样，位移距离是恒定的。因此，通过对靶标44自聚焦并使高光学分辨率成像设备24和流通池22位移所述位移距离的跨度，结果是高光学分辨率成像设备聚焦于带形样品料流32。

根据一些实施例，聚焦靶标被提供为围绕照明开口43印刷或施加的高对比度圆形。替代聚焦靶标构形在本文别处讨论。当在靶标44的焦点中采集方形或矩形图像时，照明中心周围出现高对比度边界。在开口的内部边缘处搜寻获得图像中的最高对比度的位置使高光学分辨率成像设备自聚焦于靶标44的工作位置。根据一些实施例，术语“工作距离”可指物镜与其焦平面之间的距离并且术语“工作位置”可指成像设备的焦平面。图像的最高对比度量度是处于这样的位置处：最亮白色和最暗黑色测量像素沿着穿过内部边缘的一条线彼此相邻。最高对比度量度可用于评估成像设备的焦平面是否处于相对于靶标44的所需位置中。也可使用其他自聚焦技术，诸如边缘检测技术、图像分割、以及对相邻像素之间的幅度差值进行积分及寻找差值的最高总和。在一种技术中，在涵盖靶标44的任一侧上的工作位置的三个距离处计算差值总和并将所得值与特征曲线匹配，其中最佳距离位于曲线上的峰值处。相关地，示例性自聚焦技术可涉及在不同位置采集流通池靶标的图像并分析图像以使用在靶标的图像最清晰时最大的度量来找到最佳焦点位置。在第一步骤(粗调)期间，自聚焦技术可操作以从在2.5μm间隔采集的一组图像找到初步最佳位置。从该位置处自聚焦技术可随后涉及在0.5μm间隔采集第二组图像(细调)并计算靶标上的最终最佳焦点位置。

在一些情况下，聚焦靶标(自聚焦光栅)可位于将出现样品的视区的周边。还可能的是，聚焦靶标可由位于视野中的对比形状(如图15中所描绘)限定。通常，自聚焦靶标安装在流通池上或者牢牢附接在相对于流通池的固定位置中。在由对自聚焦靶标的图像的对比度最大化作出响应的检测器所控制的定位电机的作用下，装置自聚焦于靶标而非带形样品料流。然后通过使流通池和/或高光学分辨率成像设备相对于彼此位移所述位移距离(已知为自聚焦靶标与带形样品料流之间的距离)，使高光学分辨率成像设备的工作位置或焦平面从自聚焦靶标位移到带形样品料流。因此，带形样品料流出现在采集的数字图像中的焦点中。

为了通过数据处理技术区分粒子类型，诸如红和白血细胞的类目和亚类目，有利的是记录具有足够分辨率和清晰度以展示将一种类目或亚类目与其他区分开的方面的微观像素图像。本发明的目标是便于如所述的自聚焦技术。

在实践实施例中，装置可基于如图1a所示并如图1b中放大的光具座布置方式，其具有照明到安装在万向载体或流通池载体55中的流通池22上的照明源42，对由高光学分辨率成像设备24获得的图像中的流通池22的内容物进行背光照明。载体55安装在电机驱动器上以便可精确地朝向和远离高光学分辨率成像设备24移动。载体55也允许流通池相对于高光学分辨率成像设备或数字图像捕获设备的光学观察轴的精确配向，以使得带形样品料流在正交于带形样品料流成像的区中的观察轴的平面中流动，也就是在如图1中所描绘的照明开口43与观察孔57之间流动。聚焦靶标44可有助于载体55的调节，例如以建立正交于高光学分辨率成像设备或数字图像捕获设备的光轴的带形样品料流的平面。

因此，载体55提供流通池22例如相对于图像捕获设备24或图像捕获设备物镜的位置和取向的非常精确的线性和角度调节。如这里所示，载体55包括两个枢轴点55a、55b以有利于载体和流通池相对于图像捕获设备的角度调节。角度调节枢轴点55a、55b位于相同平面中并且以流通池通道(例如，在图像捕获位点)为中心。这允许在不引起流通池位置的任何线性平移的情况下调节角度。载体55可围绕枢轴点55a的轴线或围绕枢轴点55b的轴线或围绕这两条轴线旋转。此类旋转可由处理器和流通池移动控制机构控制，诸如由图4中所描绘的处理器440和流通池控制机构442控制。

返回参照图1b，可以看出图像捕获设备24和载体55(连同流通池22)中的任一者或两者可沿着三维中的各条轴线(例如，x、y、z)旋转或平移。因此，用于调节图像捕获设备的焦点的示例性技术可包括实施图像捕获设备24围绕成像轴的轴向旋转，例如使设备24围绕轴线x旋转。还可通过流通池22和/或载体55围绕沿着成像轴延伸的轴线，例如围绕轴线x，并在成像设备的视野内的轴向旋转来实现焦点调节。在一些情况下，焦点调节可包括图像捕获设备的顶端旋转(例如，围绕轴线y的旋转)。在一些情况下，焦点调节可包括流通池的顶端旋转(例如，围绕轴线y或围绕枢轴点55a的旋转)。如此处所描绘，枢轴点55a对应于沿着流通池的流路并在流通池的流路内延伸的y轴。在一些情况下，焦点调节可包括图像捕获设备的倾斜旋转(例如，围绕轴线z的旋转)。在一些情况下，焦点调节可包括流通池的倾斜旋转(例如，围绕轴线z或围绕枢轴点55b的旋转)。如此处所描绘，枢轴点55b对应于横越流路和成像轴的z轴。在一些情况下，可通过实施流通池的旋转(例如围绕轴线x)使得该旋转以图像捕获设备的视野为中心而使图像捕获设备聚焦于样品流动料流。可实施本文所述的三维旋转调节以便考虑分析仪系统的一个或多个部件中的位置漂移。在一些情况下，可实施三维旋转调节以便考虑分析仪系统的一个或多个部件中的温度波动。在一些情况下，分析仪系统的调节可包括使成像设备24沿着轴线x平移。在一些情况下，分析仪系统的调节可包括使载体55或流通池22沿着轴线x平移。

根据一些实施例，用于获得包含悬浮于液体中的粒子的样品的图像的视觉分析仪包括流通池22，其耦合到样品源25并耦合到pioal材料源27，如图1中所描绘。如图3的剖面图中可以看出，流通池22限定在流动方向(图3中从右到左或者图1中从底部到顶部)对称地变窄的内部流路。流通池22被配置成引导被pioal包封的样品流32穿过流通池中的观察区，即在观察孔57后面。

再次参照图1，具有物镜镜头46的数字高光学分辨率成像设备24沿着与带形样品料流32相交的光轴而定向。物镜46和流通池33之间的相对距离可通过操作电机驱动器54而改变，以便在光传感器阵列上分辨和采集聚焦的数字化图像。

自聚焦光栅44具有相对于流通池22固定的位置，位于离带形样品料流32的平面的位移距离52。在所示实施例中，自聚焦光栅(靶标44)在高光学分辨率成像设备24采集的图像中可见的位置直接施加到流通池22。在另一个实施例中，靶标如果未以一体化方式直接施加到流通池的主体，则可承载于相对于流通池22和其中的带形样品料流32牢牢固定在适当位置的部件上。

光源42可为稳定源或可为在操作高光学分辨率成像设备光敏元件时闪光的频闪灯，所述光源被配置成照明带形样品料流32并且还有助于靶标44的对比度。在所描绘的实施例中，照明来自背光照明。

图1c提供了框图，示出了示例性血液学分析仪的另外方面。如这里所示，分析仪100c包括耦合的至少一个数字处理器18以操作电机驱动器54并分析如在相对于靶标自聚焦光栅44的不同焦点位置处采集的来自光敏元件阵列的数字化图像。处理器18被配置成测定自聚焦光栅44的焦点位置，即自聚焦于靶标自聚焦光栅44并且从而确定高光学分辨率成像设备24与自聚焦光栅44之间的最佳距离。这可通过图像处理步骤来实现，诸如施加算法以评估第一距离处图像中的对比度水平，该算法可施加到整个图像或至少自聚焦光栅44的边缘。处理器使电机54移动到另一个位置并评估该位置或边缘处的对比度，并且在两次或更多次迭代后测定使自聚焦光栅44上的焦点的精确度最大化(或如果已移动到该位置，则将优化焦点的精确度)的最佳距离。处理器依赖于自聚焦靶标自聚焦光栅44与带形样品料流之间的固定间距，处理器18然后控制电机54将高光学分辨率成像设备24移动到正确距离以聚焦于带形样品料流32。更具体地讲，处理器操作电机以使高光学分辨率成像设备与带形样品料流32之间的距离位移所述位移距离52(例如如图1所描绘)，带形样品料流从靶标自聚焦光栅44位移所述位移距离52。这样，高光学分辨率成像设备聚焦于带形样品料流。

电机54可包括精度略微小于高光学分辨率成像设备或数字图像捕获设备所成像的区别性特征(特别是血细胞的各方面)的齿轮步进电机。如果调节高光学分辨率成像设备24的位置以将光学物镜的位置定位于带形样品料流的宽度内，则带形样品料流中的细胞/粒子的视图在焦点内。自聚焦光栅44可位于高光学分辨率成像设备或数字图像捕获设备的视野的边缘处，并且因此不会干扰观察。

此外，当高光学分辨率成像设备在位移距离内移动并且自聚焦光栅偏离焦点时，出现在焦点内的特征是血细胞而非自聚焦光栅。在图15的实施例中，例如，自聚焦光栅由视野中的形状限定。所述形状为有限尺寸的相对薄的离散形式，并且因此在移动位移距离之后，当聚焦于带形样品料流时所述形式在数字化图像中基本上不可见。在尺寸适合血液学(血细胞)成像应用的流通池中，典型的位移距离可为例如50至100μm。在一些实施例中，自聚焦特征保持高光学分辨率成像设备处于最佳焦距的1μm内。

可调节流通池内部轮廓以及pioal和样品流速以使得样品形成带形料流。料流可与包封在带形样品料流中的粒子大约一样薄或甚至更薄。白血细胞可具有例如约10μm的直径。通过提供厚度小于10μm的带形样品料流，当带形样品料流被鞘流体或pioal拉伸时细胞可以取向。令人惊讶的是，带形样品料流沿着变窄流路在粘度与带形样品料流不同(诸如更高粘度)的pioal层内的拉伸有利地往往会使非球形粒子在基本上平行于流动方向的平面中配向，并对细胞施加力，从而改善细胞的细胞内结构的焦点内内容物。高光学分辨率成像设备24的光轴基本上正交(垂直)于带形样品料流的平面。带形样品料流在成像点的线速度可为例如20-200mm/s。在一些实施例中，带形样品料流的线速度可为例如50-150mm/s。

带形样品料流厚度可受样品流体和pioal的相对粘度和流速的影响。返回参照图1，样品源25和/或pioal源27(例如，包括精密容积泵)可被配置成以可控的流速提供样品和/或pioal以优化带形样品料流32的尺寸，即作为至少与高光学分辨率成像设备24的视野一样宽的薄带。

在一个实施例中，pioal的源27被配置成以预定的粘度提供pioal。该粘度可与样品的粘度不同，并且可以高于样品的粘度。对pioal的粘度和密度、样品材料的粘度、pioal的流速和样品材料的流速进行协调以在离自聚焦光栅的位移距离处维持带形样品料流，并具有预定的尺寸特性，诸如有利的带形样品料流厚度。

在实践实施例中，pioal具有比样品更高的线速度和比样品更高的粘度，从而将样品拉伸成平带。在一些情况下，pioal粘度可为最多至10厘泊。

在图1c中所示的实施例中，用于分析从光敏元件阵列获得的像素数字图像的相同数字处理器18也用于控制自聚焦电机54。然而，通常高光学分辨率成像设备24并不会对每张捕获的图像自聚焦。自聚焦过程可周期性地(在当天开始时或在轮班开始时)或例如在适当传感器检测到温度或其他工艺变化时或在图像分析发现可能需要重聚焦时完成。在一些情况下，自动化自聚焦过程可在约10秒的持续时间内进行。在一些情况下，自聚焦工序可在处理一个齿条的样品(例如，每个齿条10个样品)之前进行。在其他实施例中还可以使血液学图像分析由一个处理器完成，并且使单独的处理器，任选地与其自身光敏元件阵列相关联，被布置用于处理自聚焦于固定靶标44的步骤。

数字处理器18可被配置成在程序化时间或在程序化条件下或根据用户需求自聚焦，并且还被配置成执行基于图像的粒子的分类和子分类。示例性粒子包括细胞、白血细胞、红血细胞等等。

在一个实施例中，图1或图1c的数字处理器18被配置成检测自聚焦再引发信号。自聚焦再引发信号可由检测到的温度变化、如由像素图像日期的参数所识别的聚焦质量的降低、时间的流逝或用户输入而触发。有利的是，从测量图1中所描绘的位移距离52以重新校准的意义上说，不必要重新校准。任选地，自聚焦可程序化以在运行之间以特定频率/间隔重新校准以便进行质量控制和/或保持聚焦。

位移距离52在一个流通池与另一个流通池之间略有差异，但对于给定流通池而言保持恒定。作为装配图像分析仪与流通池时的安装过程，首先估计位移距离，然后在其中执行自聚焦和成像方面的校准步骤期间，测定流通池的准确位移距离并作为常数输入处理器18的程序设计中。

因此，如图1d中的流程图所示，并且参照图1和/或图1c的血液学分析仪，根据所公开的方法和装置进行的过程可涉及校准一次或很少校准。校准可包括聚焦于对比度靶标44、聚焦于带形样品料流32以及记录沿着光轴在这两个位置之间的位移，如步骤110d中所指示。该位移可作为常数记录。然后通过控制电机54并分析来自光敏元件阵列的图像数据，处理器18自聚焦于靶标44并且使高光学分辨率成像设备24和/或流通池22相对于彼此位移所记录的位移距离，如步骤120d中所指示。带形样品料流32进而在焦点内并且可每隔一定间隔，特别是在足以采集在观察孔57处穿过观察区的带形样品料流的部分的基本上不重叠的相邻视图的间隔处，采集(如步骤130d中指示)和处理(如步骤140d中指示)其图像。当自行监测(如步骤150d中指示)揭示数据异常或温度变化(可能因热膨胀的差异而改变高光学分辨率成像设备24与流通池22的相对位置)时，则引发自聚焦(如步骤160d中指示)，之后才恢复常规操作。因此，自聚焦过程可包括检测自聚焦再引发信号，以及响应于自聚焦再引发信号而重复自聚焦和图像采集步骤。在一些实施例中，自聚焦再引发信号可包括或基于温度的变化、聚焦质量的降低、流逝的时间间隔、或用户输入。

带形样品料流的线速度可被充分限制以防止在光传感器阵列的图像曝光时间数字化图像的运动模糊。光源可任选地为闪烁以短时间施加高入射振幅的闪光灯。由于自聚焦光栅44和图像处于相同视野，光源被配置成同时照明带形样品料流和自聚焦光栅。然而，在其他实施例中，用于成像和用于自聚焦的视野可不同，例如单独地照明和/或成像。

所讨论的开发具有方法以及装置方面。聚焦视觉分析仪的方法包括在相对于流通池22固定的自聚焦光栅44上聚焦高光学分辨率成像设备24，其可以为数字高光学分辨率成像设备或数字图像捕获设备，其中自聚焦光栅44位于离带形样品料流32的位移距离52处。数字高光学分辨率成像设备24具有物镜，其光轴与带形样品料流32相交。物镜与流通池22之间的相对距离通过操作电机驱动器54而改变，而沿着光轴在高光学分辨率成像设备与最佳聚焦点之间的距离是已知的。数字高光学分辨率成像设备被配置成在光传感器阵列上分辨和收集数字化图像。操作电机驱动器以在自聚焦过程中在自聚焦光栅上聚焦。然后在所述位移距离上操作电机驱动器，从而在带形样品料流上聚焦高光学分辨率成像设备。

可以使用对靶标的自聚焦和位移所述位移距离来获得适于对带形样品料流聚焦的距离。然而，有利的是，每次图像捕获不需要或不重复自聚焦。然而，在某些条件下开始自聚焦。可检测或生成自聚焦再引发信号，从而引起如下步骤：重聚焦于自聚焦光栅，在位移距离内操作电机驱动器，以及使高光学分辨率成像设备重聚焦于带形样品料流。自聚焦再引发信号可由例如温度的变化、聚焦质量的降低、时间的流逝、其他工艺参数或用户输入的检测而引起。

图1e为示例性模块系统的简化框图，该框图广义地例示了可如何以分离方式或更集成化的方式实施模块系统100e的个体系统元件。模块系统100e可以是根据本发明实施例的用于使血液样品流体中的粒子成像的粒子分析系统的一部分或与该粒子分析系统相连。模块系统100e非常适于生成与聚焦和成像技术相关的数据或指令、接收与聚焦和成像技术相关的输入、和/或处理与聚焦和成像技术相关的信息或数据，如本文别处所述。在一些情况下，模块系统100e包括经由总线子系统102e电耦合的硬件元件，包括一个或多个处理器104e、一个或多个输入设备106e(诸如用户界面输入设备)、和/或一个或多个输出设备108e(诸如用户界面输出设备)。在一些情况下，系统100e包括网络接口110e和/或成像系统接口140e，该成像系统接口可从成像系统142e接收信号以及/或者将信号传送到成像系统142e。在一些情况下，系统100e包括软件元件，所述软件元件例如在此处被显示为当前正位于存储器114e的工作存储器112e内，为操作系统116e和/或其他代码118e(诸如被配置为实施本文所公开技术的一个或多个方面的程序)。

在一些实施例中，模块系统100e可以包括存储子系统120e，该存储子系统可以存储提供本文所公开的各种技术的功能的基础编程和数据构造。例如，实现如本文所述方法各方面的功能的软件模块可以存储于存储子系统120e中。这些软件模块可由一个或多个处理器104e执行。在分布式环境中，所述软件模块可存储在多个计算机系统上并由所述多个计算机系统的处理器执行。存储子系统120e可以包括存储器子系统122e和文件存储子系统128e。存储器子系统122e可包括多个存储器，包括用于在程序执行期间存储指令和数据的主随机存取存储器(ram)126e，以及其中存储固定指令的只读存储器(rom)124e。文件存储子系统128e可为程序和数据文件提供永久性(非易失性)存储，并且可以包括有形存储介质，该有形存储介质可以任选地收录样品、患者、治疗、评估数据，或其他数据。文件存储子系统128e可以包括硬盘驱动器、连同相关联的可移动介质的软盘驱动器、紧凑型数字只读存储器(cd-rom)驱动器、光盘驱动器、dvd、cd-r、cdrw、固态可移动存储器、其他可移动的介质盒或盘，等等。所述驱动器中的一个或多个可位于在其他位点处耦合到模块系统100e的其他连接计算机上的远程位置处。在一些情况下，系统可以包括存储一个或多个指令序列的计算机可读存储介质或其他有形存储介质，所述一个或多个指令序列在被一个或多个处理器执行时，可导致所述一个或多个处理器执行本文所公开的技术或方法的任何方面。实现本文所公开技术的功能的一个或多个模块可由文件存储子系统128e存储。在一些实施例中，所述软件或代码将提供允许模块系统100e与通信网络130e进行通信的协议。任选地，此类通信可以包括拨号连接通信或互联网连接通信。

应当理解，系统100e可被配置成实施本发明方法的各方面。例如，处理器部件或模块104e可以是微处理器控制模块，该微处理器控制模块被配置成从传感器输入设备或模块132e、从用户界面输入设备或模块106e、和/或从成像系统142e，任选地经由成像系统接口140e和/或网络接口110e以及通信网络130e接收温度参数信号和/或流通池操作参数。在一些情况下，传感器输入设备可包括粒子分析系统或为粒子分析系统的一部分，所述粒子分析系统被装配为获得血液流体样品的图像。在一些情况下，用户界面输入设备106e和/或网络接口110e可被配置成接收由粒子分析系统生成的图像参数信号，所述粒子分析系统被装配为获得图像参数。在一些情况下，成像系统142e可包括粒子分析系统或为粒子分析系统的一部分，所述粒子分析系统被装配为获得与血液流体样品相关的图像参数。

处理器部件或模块104e还可以被配置成将任选地根据本文所公开技术的任何一种处理的粒子分析参数信号或图像参数信号传送到传感器输出设备或模块136e、到用户界面输出设备或模块108e、到网络接口设备或模块110e、到成像系统接口140e、或到它们的任何组合。根据本发明实施例的设备或模块中的每一个可以包括位于被处理器处理的计算机可读介质上的一个或多个软件模块，或硬件模块，或它们的任何组合。可使用多种常用平台(诸如windows、macintosh和unix)中的任何一种，连同多种常用编程语言中的任何一种，来实现本发明的实施例。

用户界面输入设备106e可以包括(例如)触摸板、键盘、指示设备(诸如鼠标)、轨迹球、图形输入板、扫描器、操纵杆、结合到显示器中的触摸屏、音频输入设备(诸如语音识别系统)、麦克风、以及其他类型的输入设备。用户输入设备106e还可以从有形存储介质或从通信网络130e下载计算机可执行代码，该代码具体化为本文所公开方法或其各方面中的任何一者。应当理解，终端软件可以时常更新，并且在适当的情况下被下载到终端。一般来讲，使用术语“输入设备”旨在包括用于将信息输入模块系统100e中的多种传统和专属的设备和方法。

用户界面输出设备106e可以包括(例如)显示子系统、打印机、传真机、或非视觉显示器(诸如音频输出设备)。显示子系统可以是阴极射线管(crt)、平板设备(诸如液晶显示器(lcd))、投影设备等等。显示子系统还可以诸如经由音频输出设备提供非视觉显示。一般来讲，使用术语“输出设备”旨在包括用于从模块系统600向用户输出信息的多种传统和专属的设备和方法。

总线子系统102e提供用于使模块系统100e的各种部件和子系统彼此按预期的方式或根据需要进行通信的机制。模块系统100e的各种子系统和部件无需处于相同的物理位置，而是可以分布在分布式网络内的各个位置处。尽管总线子系统102e被示意性地显示为单根总线，但是总线子系统的另选实施例可以利用多根总线。

网络接口110e可提供通向外部网络130e或其他设备的接口。外部通信网络130e可被配置成根据需要或期望实现与其他方的通信。该外部通信网络由此可以接收来自模块系统100e的电子数据包，并且根据需要或期望将任何信息传输回模块系统100e。如此处所描绘，通信网络130e和/或成像系统接口142e可向成像系统142e传输信息或接收来自成像系统142e的信息，该成像系统被装配为获得对应于血液流体样品的多个图像或图像参数。

除了提供系统内部的此类基础结构通信链接之外，通信网络系统130e还可以为诸如互联网之类的其他网络提供连接，并且可以包括有线、无线、调制、和/或其他类型的接口连接。

对技术人员显而易见的是，可以根据具体要求来使用大量的变型。例如，也可以使用定制的硬件并且/或者可以在硬件、软件(包括便携式软件，诸如小应用程序)或这两者中实现特定的元件。此外，可以采用至其他计算设备(诸如网络输入/输出设备)的连接。模块终端系统100e本身可以是包括计算机终端、个人计算机、便携式计算机、工作站、网络计算机、或任何其他数据处理系统的不同类型的模块终端系统。由于计算机和网络的不断变化的性质，因此图1e中描绘的模块系统100e的描述仅旨在作为出于举例说明本发明的一个或多个实施例的目的的具体例子。模块系统100e的比图1e中所描绘的模块系统具有更多或更少部件的许多其他构形是可能的。模块系统100e的模块或部件中的任何一个或此类模块或部件的任何组合可以与本文所公开的粒子分析和/或成像系统实施例中的任何一个耦合、或集成到其中、或以其他方式被配置成与其建立连接。相关地，以上论述的硬件和软件部件中的任何一个可以与在其他位置处使用的其他医疗评估或治疗系统集成在一起或被构造成与所述系统接合。

在一些实施例中，模块系统100e可以被配置成接收输入模块处的血液流体样品的一种或多种图像参数。可将图像参数数据传输到评估模块，在评估模块处，可基于图像数据的分析来预测或确定诊断或其他结果。图像或诊断数据可以经由输出模块输出至系统用户。在一些情况下，模块系统100e可例如通过使用诊断模块来确定血液流体样品的诊断结果。诊断信息可以经由输出模块输出至系统用户。任选地，该诊断的某些方面可以由输出设备确定，并且传输至诊断系统或诊断系统的子设备。可将与血液流体样品或从其获得样品的患者相关的多个数据中的任何一个输入到模块系统中，包括年龄、体重、性别、治疗史、病史，等等。可以基于这种数据来确定治疗方案或诊断评价的参数。

相关地，在某些情况下，系统包括被配置成接收图像数据作为输入的处理器。任选地，处理器、存储介质或这两者可以结合在血液学或粒子分析机器内。在一些情况下，血液学机器可以生成用于输入到处理器中的图像数据或其他信息。在一些情况下，处理器、存储介质或这两者可以整合在计算机内，并且该计算机可以与血液学机器进行通信。在一些情况下，处理器、存储介质或这两者可以整合在计算机内，并且该计算机可以经由网络与血液学机器进行远程通信。

流通池

流通池22的实际实施例进一步在图2和3中描绘。如这里所示，流通池22可以与样品源25耦合并且还可以耦合到pioal材料源27。样品流体经由插管29例如通过插管29的远侧出口31而注入流通池22。通常，pioal鞘流体在其通过流通池中的弯曲通道段41从源27向观察区23行进时不处于层流状态。然而，流通池22可被配置成使得pioal鞘流体在流过将样品流体引入流动鞘流体中的远侧出口31时为层流或变成层流，或显示出平坦的速度剖面(velocityprofile)。样品流体和pioal可以大致如箭头a所示的方向沿着流通池22流动，然后经由排放口33流出流通池22。流通池22限定以流动方向a对称变窄(例如，在过渡区21)的内部流路20。流路的对称性有助于样品料流稳健而居中的流动。流通池22被配置成引导被pioal包封的样品流32通过流通池中的观察区23，即在观察孔57背后。与观察孔57相关联的是自聚焦光栅44。流通池22还具有被配置成接受或接纳显微镜物镜(未示出)的倒圆或凹陷座58。

根据一些实施例，自聚焦光栅44可具有相对于流通池22固定的且位于离带形样品料流32平面一定位移距离的位置。在这里所示的实施例中，自聚焦光栅(靶标44)在高光学分辨率成像设备(未示出)通过观察孔57采集的图像中可见的位置直接施加到流通池22。流通池22可由第一或上部区段或层22a和第二或下部区段或层22b构成。如这里所示，玻璃或透明窗格60附接到第一区段22a或与第一区段一体化。窗格60可限定流通池内的样品流路的至少一部分。来自光源42的光可穿过自聚焦光栅44的孔隙或通路行进，以便照明在流动料流32内流动的样品粒子。

在一些情况下，窗格60的厚度可具有约150μm至约170μm范围内的值。如上所述，窗格60可限定或形成流路或鞘流体(例如piaol)通道的一部分。通过使用薄窗格60，可以将显微镜物镜置于非常靠近样品流体带的位置，并因此得到沿着流路流动的粒子的高倍放大图像。

图3a描绘了流通池实施例的各方面，其中成像轴355与远侧过渡区部分316之间的距离为约8.24mm。远侧过渡区部分316与插管出口331之间的距离为约12.54mm。插管出口331与鞘流体入口301之间的距离为约12.7mm。插管出口331与近侧过渡区部分318之间的距离为约0.73mm。图3b描绘了流通池实施例的各方面，其中插管出口已被移动到相对于过渡区更远侧的位置，如相比于图3a实施例。如这里所示，插管远端向流通池的变窄过渡区推进，并且成像轴355与远侧过渡区部分316之间的距离在约16mm至约26mm的范围内。在一些情况下，成像轴355与远侧过渡区部分316之间的距离为约21mm。

返回参照图1，流通池内部轮廓(例如，在过渡区21)以及pioal和样品流速可被调整成使得样品形成为带形料流32。料流可与包封在带形样品料流中的粒子大约一样薄或甚至更薄。白血细胞可具有例如约10μm的直径。通过提供厚度小于10μm的带形样品料流，当带形样品料流被鞘流体或pioal拉伸时细胞可以取向。令人惊讶的是，带形样品料流沿着变窄流路在粘度与带形样品料流不同(诸如更高粘度)的pioal层内的拉伸有利地往往会使非球形粒子在基本上平行于流动方向的平面中配向，并对细胞施加力，从而改善细胞的细胞内结构的焦点内内容物。高光学分辨率成像设备24的光轴基本上正交(垂直)于带形样品料流的平面。带形样品料流在成像点的线速度可为例如20-200mm/s。在一些实施例中，带形样品料流的线速度可为例如50-150mm/s。

带形样品料流厚度可受样品流体和pioal的相对粘度和流速的影响。样品源25和/或pioal源27(例如，包括精密容积泵)可被配置成以可控的流速提供样品和/或pioal以优化带形样品料流32的尺寸，即作为至少与高光学分辨率成像设备24的视野一样宽的薄带。

在一个实施例中，pioal的源27被配置成以预定的粘度提供pioal。该粘度可与样品的粘度不同，并且可以高于样品的粘度。对pioal的粘度和密度、样品材料的粘度、pioal的流速和样品材料的流速进行协调以在离自聚焦光栅的位移距离处维持带形样品料流，并具有预定的尺寸特性，诸如有利的带形样品料流厚度。

在实践实施例中，pioal具有比样品更高的线速度和比样品更高的粘度，从而将样品拉伸成平带。pioal粘度可为最高10厘泊。

还参照图2和3，流通池的内部流路在带形样品料注入pioal的点的下游变窄，以产生带形样品料流厚度，例如最多至7μm，和/或内部流路产生500-3,000μm的带形样品料流宽度。在示例性实施例中，如图1中所描绘，流通池的内部流路始于样品料流注入pioal的点的上游的变窄过渡区。

在另一个实施例中，内部流路变窄以产生厚度为2-4μm的带形样品料流厚度，和/或内部流路形成宽度为2000μm的带形样品料流。这些尺寸尤其可用于血液学。料流在此情况下的厚度小于一些粒子(诸如处于其松弛状态的红血细胞)的直径。因此，这些粒子可变成重新取向，以使其更宽的尺寸面向成像轴，这可有助于展现出区别特性。

带形样品料流的线速度可被充分限制以防止在光传感器阵列的图像曝光时间数字化图像的运动模糊。光源可任选地为闪烁以短时间施加高入射振幅的闪光灯。由于自聚焦光栅44和图像处于相同视野，光源被配置成同时照明带形样品料流和自聚焦光栅。然而，在其他实施例中，成像和自聚焦的视野可以不同，例如单独地照明和/或成像。

所讨论的开发具有方法以及装置方面。聚焦视觉分析仪的方法包括在相对于流通池22固定的自聚焦光栅44上聚焦高光学分辨率成像设备24，其可以为数字高光学分辨率成像设备或数字图像捕获设备，其中自聚焦光栅44位于离带形样品料流32的位移距离52处。数字高光学分辨率成像设备24具有物镜，其光轴与带形样品料流32相交。物镜与流通池22之间的相对距离通过操作电机驱动器54而改变，而沿着光轴在高光学分辨率成像设备与最佳聚焦点之间的距离是已知的。数字高光学分辨率成像设备被配置成在光传感器阵列上分辨和收集数字化图像。操作电机驱动器以在自聚焦过程中在自聚焦光栅上聚焦。然后在所述位移距离上操作电机驱动器，从而在带形样品料流上聚焦高光学分辨率成像设备。

所述方法还可以包括使带形样品料流形成带形。呈现带形以使得高光学分辨率成像设备的光轴基本上垂直于带形样品料流，即与带形料流的平面正交。

图4描绘了用于使血液流体样品中的粒子成像的系统400的各方面。如这里所示，系统400包括样品流体注入系统410、流通池420和图像捕获设备430以及处理器440。流通池420提供任选地与样品料流相结合而传递鞘流体流的流路422。根据一些实施例，样品料流注入系统410可包括插管或管412或与插管或管412耦合。样品流体注入系统410可与流路422流体连通，并且可以操作而将样品流体424注入穿过插管412的远侧出口413并进入流通池420内的流动鞘流体426中以便提供样品流体料流428。例如，处理器440可包括存储介质或与之有效地关联，所述存储介质具有计算机应用程序，当由处理器执行时，所述计算机应用程序被配置成使样品流体注入系统410将样品流体424注入流动鞘流体426中。如这里所示，鞘流体426可通过鞘流体注入系统450而引入流通池420中。例如，处理器440可包括存储介质或与之有效地关联，所述存储介质具有计算机应用程序，当由处理器执行时，所述计算机应用程序被配置成使鞘流体注入系统450将鞘流体426注入流通池420中。

样品流体料流428具有邻近注入管412的第一厚度t1。流通池的流路422具有流路尺寸的缩减段使得样品流体料流428的厚度从初始厚度t1减小到邻近图像捕获位点432的第二厚度t2。图像捕获设备430与图像捕获位点432配向以便在流通池420的图像捕获位点432对来自第一样品流体的第一多个粒子成像。

处理器440与样品流体注入系统410、图像捕获设备430以及任选鞘流体注入系统450耦合。处理器440被配置成终止第一样品流体向流动鞘流体426中的注入并开始第二样品流体向流动鞘流体426中的注入，使得引发样品流体瞬变。例如，处理器440可包括存储介质或与之有效地关联，所述存储介质具有计算机应用程序，当由处理器执行时，所述计算机应用程序被配置成使样品流体注入系统410将第二样品流体注入流动鞘流体426中，使得引发样品流体瞬变。

另外，处理器440被配置成在样品流体瞬变后并在对第一多个粒子成像的4秒内引发在流通池420的图像捕获位点432捕获第二样品流体中的第二多个粒子的图像。例如，处理器440可包括存储介质或与之有效地关联，所述存储介质具有计算机应用程序，当由处理器执行时，所述计算机应用程序被配置成在样品流体瞬变后并在对第一多个粒子成像的四秒内使图像捕获设备430引发在流通池420的图像捕获位点432捕获来自第二样品流体的第二多个粒子的图像。

在一些实施例中，处理器440可包括存储介质或与存储介质操作性地相连，所述存储介质具有计算机应用程序，所述计算机应用程序被配置成在被处理器执行时导致流通池移动控制机构442调节流通池420例如相对于图像捕获设备430的位置。在一些实施例中，处理器440可包括存储介质或与存储介质操作性地相连，所述存储介质具有计算机应用程序，所述计算机应用程序被配置成在被处理器执行时导致图像捕获设备移动控制机构444调节图像捕获设备430例如相对于流通池420的位置。移动控制机构442、444可包括分别促进和产生流通池和图像捕获设备中的移动的电机、万向接头以及其他机械特征。在一些情况下，流通池控制机构442和/或图像捕获设备控制机构444可包括高精度步进电机控制器，其提供图像捕获设备相对于流通池的机动化和自动化聚焦。如图1中所描绘，处理器可控制图像捕获设备24的移动。相似地，如图1b中所描绘，处理器可控制流通池载体55的移动。

因此，本发明的实施例涵盖执行组合式粘度和几何流体聚焦以便使血液流体样品中的粒子成像的粒子分析系统。示例性系统可包括具有带有注入管的流路以及具有带有从中穿过的成像轴的成像窗口的流通池。流通池的流路可具有流路尺寸的缩减段。此外，分析仪系统可包括与流路流体连通的鞘流体输入口以及与注入管流体连通的血液流体输入口。血液流体输入口可被配置用于将血液流体样品注入流通池内的流动鞘流体中以使得血液流体样品以流动料流宽度大于流动料流厚度的样品流动料流流动。鞘流体可具有大于血液流体样品的粘度的粘度。而且，分析仪系统可包括图像捕获设备和聚焦机构，所述聚焦机构设定图像捕获设备相对于流通池的焦点状态。此外，系统可包括具有相对于流通池固定的位置的成像靶标，其中成像靶标和样品流动料流限定沿着成像轴的位移距离。系统还可包括处理器和聚焦模块，所述聚焦模块具有收录有机器可读代码的有形介质，所述机器可读代码在处理器上执行以便操作聚焦机构使用位移距离设定适用于粒子表征和计数的图像捕获设备的焦点状态。鞘流体与血液流体样品之间的粘度差，与流路尺寸的缩减段相结合，可有效地在成像轴处流体聚焦第一和第二样品流体，同时保持血液流体样品中的细胞的活力。在一些情况下，聚焦机构可包括被配置成调节图像捕获设备与流通池之间的距离的驱动电机。

在一些情况下，分析仪系统400可包括与流通池420热耦合的温度或热传感器448，如图4中所描绘。聚焦模块可与处理器操作性地相连，可包括有录有机器可读代码的有形介质，所述机器可读代码在处理器上执行以便操作聚焦机构(例如，流通池控制机构442或图像捕获设备控制机构444)，从而响应于温度传感器所感测到的温度变化和温度与所需焦点之间的已知关系，而设定适用于粒子表征和计数的图像捕获设备的焦点状态或焦平面。

如图4a中所描绘的流通池实施例中所示，流路尺寸的缩减段(例如，在过渡区419a)可由流路422a的相对壁421a、423a限定。相对壁421a、423a可沿着流路422a径向向内成一角度，通常围绕将样品流体料流428a二等分的横向平面451a对称。平面451a可将样品料流428a二等分，其中样品料流在样品料流428a离开插管或样品注入管412a的远侧部分427a的位置处具有第一厚度t1。相似地，平面451a可将样品料流428a二等分，其中样品料流在样品料流428a经过图像捕获位点432a的位置处具有第二厚度t2。根据一些实施例，第一厚度t1具有约150μm的值，而第二厚度t2具有约2μm的值。在此类情况下，样品带料流的压缩比为75:1。根据一些实施例，第一厚度t1具有约50μm至约250μm范围内的值，而第二厚度t2具有约2μm至约10μm范围内的值。当样品料流流体流过流通池时，带在加速和被拉伸时变薄。流通池的两个特征可有助于样品流体带的变薄。首先，鞘流体包层与样品流体带之间的速度差可起到降低带的厚度的作用。其次，过渡区的渐缩几何形状可起到降低带的厚度的作用。

通常，第一厚度t1远大于样品粒子的大小，因此粒子被完全包含在样品带料流内。然而，第二厚度t2可小于某些样品粒子的尺寸，因此那些粒子可延伸到样品流体之外并进入周围的鞘流体中。如图4a中所示，样品带料流可总体上沿着与其离开插管并朝图像捕获位点行进的相同平面流动。

流通池还可以在远侧插管部分427a与图像捕获位点432a之间提供分隔距离430a。根据一些实施例，样品流体注入管412a的远侧部分427a可定位在离图像捕获位点432a的轴向分隔距离430a处，其中轴向分隔距离432a具有约21mm的值。在一些情况下，轴向分隔距离430a具有约16mm至约26mm范围内的值。

插管出口与图像捕获位点之间的轴向分隔距离430a可影响样品流体从出口向图像捕获位点行进时流体的传递时间。例如，相对更短的轴向分隔距离430a可有助于更短的传递时间，而相对更长的轴向分隔距离430a可有助于更长的传递时间。

插管远侧部分427a处的出口相对于流路过渡区419a或相对于流路过渡区419a的近侧部分415a的位置也可推断出样品流体从出口向图像捕获位点行进时流体的传递时间。例如，鞘流体可在近侧部分415a具有相对更慢的速度，而在近侧部分415a与远侧部分416a之间的位置具有相对更快的速度。因此，如果将远侧部分427a处的插管出口定位在近侧部分415a，则样品流体到达图像捕获位点将花费更长的时间，这不仅因为行进距离更长，还因为样品流体在离开插管远侧端口后的初始速度更慢(由于更慢的鞘流体速度)。换句话说，样品流体存在于流通池的较厚部分(例如，靠近近侧部分415a)的时间越长，则样品到达图像捕获位点所花的时间越长。反之，如果将远侧部分427a的插管出口定位在近侧部分415a的远侧(例如，在近侧部分415a与远侧部分416a之间的中心位置，如图4a中所描绘)，则样品流体到达图像捕获位点所花的时间将更短，这不仅是因为行进距离更短，还因为样品流体在离开插管远侧端口后的初始速度更快(由于更快的鞘流体速度)。如本文其他地方所讨论，鞘流体在穿过过渡区419a流动时因区419a的变窄横截面积而被加速。

根据一些实施例，传递时间越短，图像捕获位点处采集图像可用的时间越多。例如，当从插管远侧顶端到成像区域的传递持续时间缩短时，可以在特定的时长内处理更多的样品，并相关地可以在特定的时长内获得更多的图像(例如，每分钟的图像数)。

虽然存在与将插管远侧部分427a的出口定位在更靠近图像捕获位点432a的位置相关的优点，但在所述出口与捕获位点之间维持一定的距离也是可取的。例如，如图3中所描绘，成像设备的光学物镜或前透镜可定位在流通池22的底座58中。如果插管的出口31太靠近座58，则样品流体在被注入鞘流体中后可能不够稳定，而不能在图像捕获位点提供所需的成像性质。相似地，可能有利的是将渐缩过渡区21保持在离观察区23一定的距离处，以使得渐缩区不干扰接纳图像捕获设备物镜的座58的定位。

继续参照图4a，样品流体注入管412a的下游端427a可定位在流路过渡区419a的近侧部分415a的远侧。相关地，样品流体注入管412a的下游端427a可定位在流路过渡区419a的远侧部分416a的近侧。因此，根据一些实施例，样品流体可从注入插管412a在过渡区419a内的某一位置注入流通池。

根据一些实施例，流路尺寸的缩减段(例如，在流路过渡区419a)的对称性起到限制血液流体样品中的粒子不良配向的作用。例如，这种对称性可有效将血液流体样品中的红血细胞成像取向不良配向限制到低于约20％。

根据一些实施例，本文所公开的方法可起到使血液计数分析期间的标记率(flaggingrate)低于样品的30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％或5％的作用。

根据一些实施例，图像捕获位点432a具有约150μm×150μm与400μm×400μm之间的视野433a。在一些情况下，图像捕获位点432a具有约275μm×275μm的视野433a。在一些情况下，视野可根据长度乘以宽度加以限定。如果表示为表面积，则275μm×275μm视野具有75,625μm²的面积。根据一些实施例，视野可由成像设备物镜及其放大倍数确定。在一些情况下，视野可对应于由采集光学元件(例如，物镜、镜筒透镜和相机)成像的场(区域)范围。在一些情况下，视野远小于图像捕获位点处的透明区的观察孔。

图4a-1和图4a-2示出了当样品料流从插管出口向图像捕获位点行进时流体聚焦对样品料流的影响。如图4a-1中所示，样品料流可具有约150μm的高度h(s)和约1350μm的宽度w(s)。另外，pioal鞘料流可具有约6000μm的高度h(p)和约4000μm的宽度w(p)。在流体聚焦之后，如图4a-2中所示，样品料流可具有约2μm的高度h(s)和约1350μm的宽度w(s)。另外，pioal鞘料流可具有约150μm的高度h(p)和约4000μm的宽度w(p)。在一个实施例中，pioal鞘料流在插管出口处的横截面积是图像捕获位点附近的横截面积的40倍。

根据一些实施例，其可用于确定图像捕获位点处的流通池通道的横截面。这可对应于如图4a-2中所描绘的约150μm的pioal鞘流体料流高度h(p)和约4000μm的宽度w(p)。其还可用于确定在图像捕获位点处流过流通池的合并样品和鞘流体的体积流速。当已知横截面积和流速时，可以确定图像捕获位点处的合并样品和鞘流体的速度。

根据一些实施例，样品和鞘流体穿过流通池的流动可用平行板轮廓模型估算。相关地，样品流体料流的中心的流速(例如，如图4a-2中所描绘)可为合并样品和鞘流体料流的平均流速的约1.5倍。

根据一些实施例，在插管出口处的样品流的横截面积(例如，图4a-1中的w(s)×h(s))为成像位点处的样品流的横截面积(例如，图4a-2中的w(s)×h(s))的40倍。在成像区域处的鞘流体的体积流速可为约45μl/s。在成像区域处的样品流体的体积流速可为约0.232μl/s。在一些情况下，在成像位点处的合并的鞘流体和样品料流的横截面积为600,000μm²。在一些情况下，在成像位点处的平均流动料流速度为75mm/s。

流速或速度可作为产生清晰和聚焦的细胞图像的速率而确定。示例性流速和速度的发现是基于观察到的在成像位点实现一定样品流动料流带形或特性的两个样品的流速。例如，在约75mm/s(或20-200mm/s范围内)的流速下，细胞不会流动得过慢以使得在连续图像中存在细胞的重叠，也不会流动得过快以使得形成幻影效应(模糊的图像)。相关地，通过避免过高的流速，可以节省更多的试剂和样品。根据一些实施例，最佳的或所需的线速度可通过改变体积流量(泵速)或插管形状而实现。

穿过图像捕获区的样品料流的流动速度也可与图像捕获设备相对于流通池功能的性能相关。例如，如果样品料流流动得过快，则可能难以获得样品中所含的粒子的清晰图像(例如，图像捕获设备的快门速度可能过慢，从而产生模糊的图像)。相似地，如果样品料流流动得过慢，则图像捕获设备可能获得同一粒子的连续图像(例如，同一粒子保持在两次图像捕获期间的捕获帧中)。在一些实施例中，样品带的速度可相对于图像捕获速率进行调节(例如，通过调整多个流通池操作参数中的任何一个)，以使得在帧捕获之间存在最少的流动，并因此能对高百分比的样品成像。

根据一些实施例，粒子分析系统和相关组件可被配置成使得当鞘流体和流体样品流过流通池时，鞘流体可以45μl/s的鞘流体体积速度流动，而流体样品可以0.232μl/s(或在0.2至0.35μl/s的范围内)的流体样品体积流速流动。在一些情况下，鞘流体流速与样品流体流速的比率为约200。在一些情况下，鞘流体流速与样品流体流速的比率具有约70至200范围内的值。在一些情况下，鞘流体流速与样品流体流速的比率为约193。在一些情况下，鞘流体流速与样品流体流速的比率为约70。在一些情况下，在流通池内流动的鞘流体体积与流体样品体积的比率可在25:1至250:1的范围内。

根据一些实施例，所述系统和相关组件可被配置成使得当鞘流体和流体样品流过流通池420时，鞘流体可以75mm/s的鞘流体速度在成像区域前流动，而流体样品可以130mm/s的流体样品速度在成像区域前流动。在一些情况下，在流通池内流动的鞘流体体积与流体样品体积的比率可在100:1至200:1的范围内。

在一些情况下，流通池可具有约50:1的最小压缩比和约125:1的最大压缩比。在一些情况下，最小压缩比可为约30:1或20:1。该压缩比是指当将图4a-1与图4a-2比较时的流动料流厚度的比率h(s):h(s)。该压缩比可受几何压缩(例如，当将图4a-1与图4a-2比较时的鞘流体厚度的比率h(p):h(p)，其也可大致上对应于图4a中所示的流通池变窄渐缩过渡区419a的尺寸)和流体动力压缩(例如，也对应于速度差)的组合的影响。根据一些实施例，几何压缩比为约40:1。

对应于过渡区的流路尺寸的缩减段可由近侧流路部分和远侧流路部分限定，近侧流路部分具有近侧厚度或高度，而远侧流路部分具有比近侧厚度或高度小的远侧厚度或高度。例如，如图4b的局部视图所示，流路的过渡区419b可在近侧部分415b与远侧部分416b之间具有长度l，其中近侧部分415b具有近侧高度417b，而远侧部分416b具有远侧高度418b。如本文其他地方所述，过渡区的形状或轮廓可以为弯曲的或平滑的，并例如以s形曲线或正切曲线的形式提供。根据一些实施例，近侧高度417b具有约6000μm的值。在一些情况下，近侧高度417b具有约3000μm至约8000μm范围内的值。根据一些实施例，远侧高度418b具有约150μm的值。在一些情况下，远侧高度418b具有约50μm至约400μm范围内的值。

过渡区419a的几何形状可提供在第一流路边界403b与二等分横向平面451b之间的第一角度α1，和在第二流路边界404b与二等分横向平面451b之间的第二角度α2。在一些情况下，角度α1为约45度而角度α2为约45度。在一些情况下，角度α1具有约10度至约60度范围内的值。在一些情况下，角度α2具有约10度至约60度范围内的值。根据一些实施例，角度α1和α2具有相同的值。可对角度α1和α2进行选择以便在样品流体从近侧部分415b向远侧部分416b行进时维持样品流体的层流或最大程度降低样品流体的湍流，继而可增强样品内的粒子沿着横向平面451b的配向。如上文参照图4a所述，过渡区的远侧和近侧边界或部分可以为弯曲的或平滑的，而不是成角度的。

如图4k中所示，穿过流通池420k的图像捕获位点432k流动的样品料流带r可具有约2μm的厚度t。在一些情况下，样品料流带的厚度t可最多为约3μm。通常，小于样品料流厚度的细胞或粒子将被包含在带内。示例性红血细胞(rbc)可呈现为双面凹陷的圆盘并可具有约6.2μm与约8.2μm之间的直径d。另外，示例性红血细胞可具有约2μm与约2.5μm之间的最大厚度t1和约0.8μm与约1μm之间的最小厚度t2。在一些情况下，红血细胞可具有最多约3μm的厚度。示例性人类血小板在尺寸上可以变化，并且也可具有约2μm的厚度或直径。虽然这里未按比例示出，但是流通池可在图像捕获位点处限定值为约150μm的流路厚度f。在一些情况下，流路厚度f具有50μm与400μm之间的值。该流路厚度f还可对应于图4b中所描绘的远侧部分461b的远侧高度418b。

如图4k中所示，样品流体料流的厚度t与粒子(红血细胞)的厚度的比率为约1:1。根据一些实施例，在图像捕获位点处的样品流体料流的厚度t与粒子之一的尺寸的比率在0.25至25的范围内。在一些情况下，厚度t可具有0.5μm至5μm范围内的值。可对鞘流体与样品流体之间的粘度差进行选择以便实现带形样品料流在流通池内的所需定位。

如本文别处和共同待审的美国专利申请no.____中所讨论，样品带r的流体与鞘流体之间的粘度差可起到沿着流动方向配向样品料流中的粒子(例如红血细胞)或使其取向的作用。当如此配向时，如图4k中所示，成像设备或相机可获取红血细胞的图像使得它们看起来为圆的，因为该血细胞的主表面面向相机。这样，红血细胞呈现的配向展示出相对于流动的低阻力。因此，鞘流体和样品流体的相对粘度特性可有助于高百分比或数量的红血细胞面向相机，从而增强粒子分析系统的评估能力。

根据一些实施例，鞘流体的粘度特性起到限制血液流体样品中的粒子不良配向的作用。例如，粘度差可有效将血液流体样品中的红血细胞成像取向不良配向限制到小于约10％。也就是说，样品中的100个红血细胞中的90个或更多个红血细胞可配向以使得其主表面面向成像设备。对称的变窄过渡区可提供20％的值。根据一些实施例，鞘流体具有类似于水的折射率(即n＝1.3330)。在一些情况下，鞘流体的水含量为约89％。除了因粘度差而观察到的配向作用外，还因双侧渐缩过渡区观察到了配向作用。在一些情况下，据观察，双侧(即，对称)渐缩过渡区是相比于不对称渐缩过渡区设计在配向粒子时的有效性的两倍。

红血细胞的有效配向可有助于改善诊断。在一些情况下，可将成像的红血细胞的形状用于确定从其获取样品的患者是否具有特定的生理状况或疾病。例如，具有镰形细胞病的患者存在形状异常(即，镰形形状)的血细胞。因此，通过获得配向红血细胞的高质量图像，可以确保准确的诊断。红血细胞的其他形状变化，例如具有薄周边区域和大平坦中心区域因而看起来具有自行车轮胎轮廓的红血细胞，可使用本发明的配向技术有效地成像。相似地，可出于诊断目的对具有小中心部分和厚周边区域因而红血细胞看起来具有卡车轮胎轮廓的红血细胞成像。本文所公开的改进的成像技术还可用于评估其他红血细胞特性，诸如血红蛋白含量、铁含量等。

不受任何特定理论的束缚，据信，鞘流体的粘度与样品流体的粘度之间的粘度差产生改变的抛物线剖面，其中该剖面大致为抛物线的，并具有对应于加速度增大的流动中心区域的中央隆起，并且该中央隆起有助于样品粒子或粒子内细胞器的配向。根据一些实施例，鞘流体与样品带之间的速度差和粘度差生成剪切力以增加细胞器或细胞内粒子的配向。鞘流体抛物线剖面的示例性方面在共同待审的美国专利申请no.________中有所讨论，该专利申请的内容以引用方式并入本文。

白血细胞通常大于红血细胞和血小板。例如，示例性中性粒细胞和嗜酸性粒细胞可具有约10μm与约12μm之间的直径。示例性嗜碱性粒细胞可具有约12μm与约15μm之间的直径。示例性淋巴细胞(小)可具有约7μm与约8μm之间的直径，而示例性淋巴细胞(大)可具有约12μm与约15μm之间的直径。示例性单核细胞可具有约12μm与约20μm之间的直径。粒子分析系统的构形(包括鞘流体和流体样品带在穿过流通池时它们之间的相互作用)可在白血细胞穿过图像捕获位点432l行进时起到压缩白血细胞的作用，如图4l中所指示。因此，例如，白血细胞(wbc)的中心部分可定位于样品流体带r内，而白血细胞的周边部分可定位于鞘流体内。因此，当带使白血细胞穿过流通池传输时，白血细胞的侧面可延伸到鞘流体中。如上文关于图4k所讨论的样品料流带r的厚度t和流路的厚度f的数值或范围相似地适用于图4l。

根据一些实施例，鞘流体与样品流体之间的粘度差可起到配向存在于诸如白血细胞的细胞内的细胞器或其他细胞内特征的作用。不受任何特定理论的束缚，据信，与鞘流体和样品流体之间的粘度差相关的剪切力可作用于白血细胞而配向细胞内特征。在一些情况下，与鞘流体和样品流体之间的速度差相关的剪切力可有助于这种配向。这些配向作用也可受粒子与样品流体带之间的尺寸差异的影响。例如，如果粒子的部分延伸到样品流体带之外并进入周围的鞘流体中，则与粘度差相关的剪切力可对细胞内特征配向具有明显的影响。

如图4l中所描绘，细胞(诸如白血细胞)的部分可延伸到鞘流体中。本发明的实施例涵盖鞘流体组合物，该鞘流体组合物在细胞暴露于鞘流体时不裂解或破碎细胞或者说是影响外部细胞膜的完整性。该鞘流体中的粘度剂可起到保持样品流体料流中的细胞的活力的作用，从而在细胞膜或细胞壁横越样品流体带与鞘流体包层之间的界面时或者说是从样品流体料流延伸到流动鞘流体中时使细胞的结构(例如，形状)和内容物(例如，细胞核)保持完整。

通常，当细胞或粒子沿着流通池在样品流体带内流动时存在作用于细胞或粒子的压缩力。因此，细胞可与鞘流体接触，同时细胞因变窄过渡区而处于压缩状态或者说是经受压缩力。鞘流体的粘度剂可起到保护被压缩的细胞免于在从薄样品流体带出现并暴露于粘性鞘流体时(至少在细胞到达图像捕获位点之前)破碎或毁坏的作用。因此，鞘流体的粘度剂组合物可充当细胞保护剂，同时还增强粒子或粒子内内容物的配向。

参照图4k和图4l，在一些情况下，细胞或粒子的部分可延伸到薄样品流体带r之外并进入周围的鞘流体中。如在共同未决的美国专利申请no.____中讨论，所鞘流体可包含抑制或防止鞘流体破坏或裂解细胞或粒子的细胞保护剂。例如，鞘流体可包含当将细胞暴露于鞘流体的化学环境时维持细胞壁的结构完整性的细胞保护剂。相似地，细胞保护剂也可在细胞经历流通池几何形状所引起的任何剪切力和样品流体与鞘流体之间的速度和/或粘度差时起到维持细胞壁的结构完整性的作用。相关地，保护剂可保护细胞或粒子免受样品流体与鞘流体之间的速度差所引起的力的影响。这样，细胞在到达图像捕获位点时保持其活力。

剪切力在样品流体带与鞘流体包封之间的界面处可能是显著的。根据一些实施例，流通池流路内的流动可由抛物线流动剖面表征。根据一些实施例，尺寸足够大的粒子将经受一定量的剪切力，甚至在此类粒子被完全容纳在单一流体相内时(即，在鞘流体包层内或者在样品流体带内)。

在一些情况下，鞘流体的速度可与样品流体的速度不同。例如，鞘流体可以80mm/s行进而样品流体可以60mm/s行进。因此，在一些情况下，样品流体以慢于周围包层的鞘流体速度的样品流体速度离开远侧插管端口。因此，鞘流体可起到沿着插管的流路拖动样品流体的作用，从而加速样品流体并降低样品流体带的厚度。样品流体带保持总体积和质量不变，因此当其行进得越快时变得越薄。根据一些实施例，鞘流体和样品流体在图像捕获位点处具有约20与200mm/s之间的速度。

通常，当样品流体从插管出口向图像捕获位点行进时，样品流体的速度增加。在一些情况下，在图像捕获位点处样品流体的速度是样品流体离开插管远侧部分的插管端口时的速度的40倍。根据一些实施例，样品带的横截面积的减小与速度的增加呈线性关系。根据一些实施例，如果在插管出口处的鞘流体速度高于样品带速度，则这将增大成像区域处的最终样品带速度。

鞘流体可起到对样品流体带和样品流体带内的粒子施加显著的剪切力的作用。一些力平行于流动方向，而粒子也可能遇到垂直于流动方向的力。通常，当鞘流体和样品流体接近图像捕获位点或区时，鞘流体和样品流体以相同的速度或接近相同的速度行进。因此，当鞘流体和样品流体通过图像捕获位点时在它们之间的边界或界面可呈现出与远侧插管出口处或渐缩过渡区处的边界或界面相比更低的剪切力。例如，在渐缩过渡区处，鞘流体包层与样品流体带之间的边界或界面可处于过渡中，以使得最初较慢较厚的样品带变得更快更薄，并且样品流体中的粒子变得更配向。换句话说，剪切力在渐缩过渡区可能是突出的，并可向图像捕获位点耗散。在图像捕获位点处的剪切力可由抛物线剖面表示，并可远低于渐缩过渡区处的剪切力。因此，细胞或粒子可在通过过渡区时经受更高的剪切力，并在通过图像捕获位点时经受更低的剪切力。根据一些实施例，鞘流体与样品流体之间的粘度差可使红血细胞配向并从而聚焦。根据一些实施例，鞘流体与样品流体之间的粘度差可使白血细胞配向并从而聚焦。相关地，可得到因料流的几何变窄和鞘流体与样品流体之间的速度差而配向并聚焦的细胞和细胞器组分的增强的成像结果。

如本文别处所述，并参照图4k和4l，当鞘流体和样品流体r流过流通池的流路尺寸缩减段或过渡区并流向成像位点432k或432l时，与鞘流体粘度和样品流体粘度之间的粘度差相关的鞘流体和样品流体r之间的相互作用所引起的粘度流体聚焦作用，与和流路尺寸缩减段或过渡区相关的鞘流体和样品流体r之间的相互作用所引起的几何流体聚焦作用相结合，在成像位点432k或432l处在多个粒子的至少一些中提供靶标成像状态。

在一些情况下，靶标成像状态是相对于成像位点处的焦平面f的靶标取向。例如，如图4k-1中所描绘，粒子(rbc)可从焦平面f位移一定的距离。在一些情况下，靶标取向涉及相对于成像位点432k-1的焦平面f的靶标粒子取向。粒子可以是血细胞，诸如红血细胞、白血细胞或血小板。如这里所示，成像位点432k-1处的流路可限定基本上与焦平面f平行或共面的p平面。在一些情况下，粒子的一部分可沿着焦平面f定位，而粒子的中心部分则可从焦平面f偏置。在一些情况下，靶标取向涉及相对于成像位点432k-1的焦平面f的靶标位置。例如，靶标位置可涉及对粒子进行定位以使得粒子的至少一部分沿着焦平面f设置。在一些情况下，靶标位置可涉及对粒子进行定位以使得粒子与焦平面f之间的距离不超过特定阈值。在一些情况下，靶标位置涉及相对于成像位点432k-1的焦平面f的靶标粒子位置。在一些情况下，靶标位置处于离焦平面f的距离d或不到距离d处，其中距离d对应于位置公差。可对鞘流体与样品流体之间的粘度差进行选择以便在流通池内实现带形样品料流的所需定位(例如，相对于流路平面p和/或焦平面f)。在一些情况下，可对粘度差进行选择以便实现处于位置公差d或不到位置公差d的靶标粒子位置。

在一些情况下，焦平面f具有如图4k-2中所指示的视野厚度或深度，而粒子(rbc)具有相对于焦平面厚度的靶标成像状态。例如，粒子的靶标位置可在焦平面f内或至少部分地在焦平面f内。在一些情况下，高光学分辨率成像设备或相机可具有约7μm的视野深度或焦平面厚度。在一些情况下，视野深度或焦平面厚度具有约2μm至约10μm范围内的值。在一些情况下，相机的视野深度类似于或等于图像捕获位点处的样品带厚度。

在一些情况下，靶标取向可涉及相对于成像位点处的焦平面f的靶标配向。例如，靶标配向可指示由粒子限定的平面与焦平面f配向，不超过如图4k-3所示的相对于图像捕获位点432k-3的焦平面f的特定角度α。在一些情况下，靶标成像状态可涉及对样品中的不良配向粒子的数量或百分比的限制。例如，鞘流体与样品流体r之间的粘度差可有效将血液流体样品中的红血细胞成像取向不良配向限制到小于约10％。也就是说，样品中的100个红血细胞中的90个或更多个红血细胞可配向以使得其主表面面向成像设备(如图4k-1和4k-2中所描绘)或使得那90个或更多个rbc的配向在基本上平行于流动方向的平面的20度内(例如，rbc配向角度α为20度或更小)。如本文其他地方所讨论，在一些情况下，至少92％的非球形粒子(诸如rbc)可在基本上平行于流动方向的平面中配向。在一些情况下，至少75％与95％之间的非球形粒子(诸如rbc)可基本上配向，即，在基本上平行于流动方向的平面的20度内(例如，配向角度α为20度或更小)。根据一些实施例，90％或更多的某些粒子(例如，红血细胞和/或血小板)可横向于成像设备的成像轴取向。

在一些情况下，本发明的实施例包括与如本文所述的血液学系统一起使用的组合物，诸如鞘流体或粒子和细胞内细胞器配向液体(pioal)。此类鞘流体或pioal适用于组合式粘度和几何流体聚焦视觉分析仪。pioal可起到引导或促进给定粘度的血液样品流体流过视觉分析仪的变窄流通池过渡区的作用。pioal可包含粘度比样品的粘度更高的流体。与粘度差相关的pioal流体和样品流体之间的相互作用所引起的粘度流体聚焦作用，与和变窄流通池过渡区相关的pioal流体和样品流体之间的相互作用所引起的几何流体聚焦作用相结合，可有效地在视觉分析仪的成像位点在多个粒子的至少一些中提供靶标成像状态，同时维持血液样品流体中的细胞的活力。

图4m描绘了具有内部细胞器(诸如小叶410m)的示例性中性粒细胞400m(一种类型的白血细胞)。因样品流体与鞘流体之间的粘度差，内部细胞器可在细胞内配向，如图4n所指示。因此，内部细胞器可通过图像捕获设备430m有效地成像，而细胞器不彼此重叠。也就是说，不是如图4m中所描绘的小叶彼此堆叠，当从图像捕获设备的成像轴或光轴观察时，小叶配向和并排，如图4n中所描绘。因此，可在捕获的图像中更有效地看见小叶。内部细胞器配向是样品流体与鞘流体之间的粘度差令人惊讶且出人意料的结果。因此，使用粘度差、流体动力流和几何压缩特征实现了对应于细胞配向和处于焦点内的增强的成像结果。

如本文别处所述，并参照图4m和4n，当鞘流体和样品流体r流过流通池的流路尺寸缩减段或过渡区并流向图像捕获设备430m或430n的成像位点时，与鞘流体粘度和样品流体粘度之间的粘度差相关的鞘流体和样品流体r之间的相互作用所引起的粘度流体聚焦作用，与和流路尺寸缩减段或过渡区相关的鞘流体和样品流体r之间的相互作用所引起的几何流体聚焦作用相结合，在成像位点处在多个粒子的至少一些中提供靶标成像状态。根据一些实施例，靶标成像状态可对应于成像状态的分布。

在一些情况下，靶标成像状态可涉及相对于成像位点处的焦平面的靶标粒子内结构取向(例如，配向和/或定位)。例如，如图4n中所描绘，内部结构410m(例如，细胞内结构、细胞器、小叶等)可相对于焦平面f取向。在一些情况下，靶标配向涉及相对于成像位点处的焦平面f的靶标粒子内结构配向，类似于图4k-3中所描绘的粒子配向关系。在一些情况下，靶标位置涉及相对于成像位点处的焦平面的靶标粒子内结构位置，类似于图4k-1中所描绘的粒子位置关系。在一些情况下，粒子内结构的靶标取向既可包括相对于焦平面的靶标配向也可包括相对于焦平面的靶标位置。在一些情况下，靶标成像状态可涉及成像位点处的靶标变形。例如，如图4n中所描绘，粒子400m具有与图4m中所描绘的粒子形状相比压缩的形状。因此，可以看出的是，流通池的运行可对粒子形状产生侧向压缩作用。相关地，粒子内特征可在粒子本身的形状被压缩时在位置或方向上取向(例如，相对于焦平面f和/或带形流平面配向)。根据一些实施例，鞘流体与样品流体之间的速度差可在流动料流内产生摩擦，而鞘流体与样品流体之间的粘度差可放大该流体动力摩擦。

可使用流过流通池的样品流体的图像执行多种血液学或血液粒子分析技术中的任一种。通常，图像分析可涉及确定某些细胞或粒子参数，或测量、检测或评价某些细胞或粒子特征。例如，图像分析可涉及评价细胞或粒子尺寸、细胞核特征、细胞质特征、细胞内细胞器特征等。相关地，分析技术可涵盖某些计数或分类方法或诊断测试，包括白血细胞(wbc)分类。在一些情况下，使用流通池得到的图像可支持5分法wbc分类测试。在一些情况下，使用流通池得到的图像可支持9分法wbc分类测试。相关地，参照图4，处理器440可包括存储介质或与存储介质操作性地相连，所述存储介质具有计算机应用程序，所述计算机应用程序被配置成在被处理器执行时导致系统400基于得自图像捕获设备的图像区分不同类型的细胞。例如，诊断或测试技术可用于区分各种细胞(例如，中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、晚幼粒细胞、中幼粒细胞、早幼粒细胞和母细胞)。

方法

图5描绘了根据本发明实施例的用于使血液流体样品中的粒子成像的示例性方法500的各方面。方法500可包括将血液流体样品注入流通池的流路中，如步骤510所指示。方法还可以包括通过使具有相对于所述流通池固定的位置的成像靶标成像来使图像捕获设备聚焦，如步骤520所指示。此外，方法可包括采集粒子的聚焦图像，如步骤530所指示。使用图像捕获设备在流动料流内聚焦的图像可适用于粒子表征和计数，其中使用位移距离使图像捕获设备聚焦于样品流动料流。

图6示出了用于对血液流体样品中的粒子成像的示例性方法的各方面。如这里所示，方法600可包括如步骤610所指示使鞘流体沿着流通池的流路流动；如步骤620所指示将流体样品注入流通池内的流动鞘流体中以使得流体样品在样品流动料流中流动；如步骤630所指示在与流通池相关的温度处于第一温度时，使图像捕获设备聚焦于流动料流达到第一焦点状态；如步骤640所指示使用图像捕获设备在第一焦点状态下采集流动料流内的第一亚组的粒子的第一聚焦图像；如步骤650所指示确定与流通池相关的温度已经历从第一温度到第二温度的变化；如步骤660所指示响应于温度的变化及流通池温度与所需焦点之间的已知关系而自动地将图像捕获设备的焦点从第一焦点状态调节到第二焦点状态以及如步骤670所指示使用图像捕获设备在第二焦点状态下采集流动料流内的第二亚组的粒子的第二聚焦图像。

剪切应变速率

图7和8描绘了根据本发明实施例的对于流通池中某些流动条件的剪切应变速率值的各方面。在这些附图的每一个中，使用30％甘油鞘流体。在一些情况下，粘度可具有2.45×10^-3的值。剪切应变值可等于粘度值乘以应变速率值得到的乘积。参照图7，样品可具有0.3μl/s的流速，而鞘流体可具有21μl/s的流速。参照图8，样品可具有1μl/s的流速，而鞘流体可具有70μl/s的流速。在这些图的每一个中，可以看出，流动展示出朝向中心(c)的更低的应变值和朝向周边(p)的更高的应变值。此类应变值在一些实施例中可对应于不对称流通池构形。

如图7中所描绘，根据一些实施例，朝向流动料流的中心(c)部分的更低的应变速率可具有约500(1/s)或更低的值，而朝向流动料流的周边(p)的更高的应变速率可具有约3000(1/s)或更高的值。如图8中所描绘，根据一些实施例，朝向流动料流的中心(c)部分的更低的应变速率可具有约1000(1/s)或更低的值，而朝向流动料流的周边(p)的更高的应变速率可具有约9000(1/s)或更高的值。

因此，可以看出，更低的样品和鞘流体速率(例如，图7)对应于更低的应变速率，而更高的样品和鞘流体速率(例如，图8)对应于更高的应变速率。应当理解，本发明的实施例涵盖使用对应于各种粘度值、各种应变速率值和/或各种剪切应力值的样品和/或鞘流体。

自聚焦靶标

返回参照图1，粒子成像系统可包括相对于流通池22固定的自聚焦光栅或成像靶标44。自聚焦靶标44可用于获得流过流通池的血液流体粒子的聚焦图像。

图9a描绘了根据本发明实施例的示例性自聚焦靶标900。如这里所示，靶标900包括不透明环形带或光圈910和透明中心或孔920。在操作中，成像设备聚焦于带910并通过孔捕获图像。如本文别处所讨论，图像捕获方法可涉及首先聚焦(或自聚焦)于带910，然后在通过孔920获得图像之前调节图像捕获设备与样品流体料流之间的距离。因此，带910可提供图像捕获设备的自聚焦系统可对其检测和聚焦的靶标，并且靶标的某些部分(例如，边缘或段)可包括在图像中。在一些情况下，靶标可以具有中心孔的铬圆盘的形式提供。示例性靶标可设置有胶粘或固定到流通池的直径为约0.5mm的中心针孔。中心针孔或孔920的尺寸可被选择为使得捕获的图像940中可见不透明环形带910的仅四个边缘部分930，如图9b中所示。因此，环形带910不干扰细胞图像的捕获(例如，光可穿过孔920以照明样品粒子，并且视野基本上不受环形带妨碍)。这样，带910仅在图像的拐角中显现。

图10描绘了根据本发明实施例的示例性自聚焦或成像靶标1000。靶标1000包括带或边界1010和中心孔1020。带或光圈1010可为不透明的，并且孔1020可为透明的。图11示出了根据本发明实施例的另一个示例性自聚焦靶标1100。靶标1100包括带或边界1110和中心孔1120。带或光圈1110可为不透明的，并且孔1120可为透明的。根据一些实施例，自聚焦靶标1100提供顶部和底部上具有50黑色像素的图像。在一些情况下，自聚焦靶标1100提供约65.3μm的流通池聚焦偏移量(fcfo)。

图12a描绘了根据本发明实施例的示例性自聚焦靶标1200。靶标1200呈现为信箱设计，并且包括第一或上边界1210和第二或下边界1220。靶标1200还包括第一与第二边界之间的孔或透明通路1230。根据一些实施例，靶标具有约4mm的直径，并且信箱的高度为265μm。在一些情况下，上边界和下边界可呈现为半圆，并且可用沉积金属诸如氧化铬或一些其他不透明材料制备。

图12b示出了自聚焦靶标1200的中心部分的近距离视图。如这里所示，第一边界1210包括负/正数值刻度和居中的零值。第二边界1220包括类似的刻度。在一些情况下，刻度增量为100μm。根据一些实施例，刻度可用于有利于流通池的定位使得成像设备或相机的视野可集中于样品料流。如这里所示，样品料流1240在垂直于第一和第二边界的刻度的方向上流动。作为聚焦方案的一部分，图像捕获设备可操作以聚焦于存在于边界1210、1220上的数字或其他字符或可成像对象。

本发明的实施例涵盖用于解决与使用粒子分析系统相关的热漂移的技术，由于所述热漂移，此类热效应可损害用成像设备获得的图像的质量。图13a描绘了具有热传感器1370、反射器1380和自聚焦靶标1344的流通池1320的局部侧视图。在粒子分析系统的操作期间，热效应可导致样品料流缓慢漂移偏离成像设备的焦点。例如，热效应可由来自灯的辐射热使流通池热膨胀所引起。此外，热效应可由传导性和辐射性加热使流通池和光具座组件(oba)组件热膨胀所引起。在一些实施例中，oba的某些部件可膨胀，这可导致聚焦误差。例如，此类部件可包括将相机24保持在一起的金属板、保持或连接到流通池的金属板、或将流通池和相机24保持在一起的金属板。图13b描绘了具有热传感器1370和自聚焦靶标1344的流通池1320的局部透视图。此外，图13c描绘了具有热传感器1370、反射器1380和自聚焦靶标1344的流通池1320的另一个透视图。

图13b描绘了具有热传感器1370和自聚焦或成像靶标1344的流通池1320的局部透视图。根据本发明的一些实施例，可使用与分析仪相关的热传感器所感测的温度，使图像捕获设备聚焦于样品流动料流。例如，温度可对应于样品流体温度、鞘流体温度、流通池温度或图像捕获设备温度。在一些情况下，温度为流通池的成像位点处的温度。在一些情况下，温度为成像位点下游位置处的温度。在一些情况下，温度为成像位点上游位置处的温度。根据本发明的一些实施例，可使用与分析仪相关的温度变化率，使图像捕获设备聚焦于样品流动料流。例如，温度变化率对应于样品流体温度变化率、鞘流体温度变化率、流通池温度变化率或图像捕获设备温度变化率。

图13c描绘了具有热传感器1370、反射器1380和自聚焦或成像靶标1344的流通池1320的另一个透视图。反射器1380可操作以减少或限制被流通池1320吸收的热的量。例如，反射器1380可阻断由闪光灯1342辐射的热，如图13a中所指示。因此，反射器1380可使灯的热冲击最小化。反射器1342也可减少灯所产生的炫光和光散射，从而得到改善的图像质量。热传感器1370定位在流体流通道附近并与图像捕获位点相邻，以使得可获得准确的温度读数。来自温度传感器的信息可用于使图像捕获设备聚焦于样品流体带料流。本文所公开的示例性自聚焦技术可基于出现于分析仪某些元件内的温度波动。

根据一些实施例，用于使血液流体样品中的粒子成像的方法可包括使鞘流体沿着流通池的流路流动，以及将血液流体样品注入流通池内的流动鞘流体中从而血液流体样品以流动料流宽度大于流动料流厚度的样品流动料流流动，使得流通池具有相关温度。此外，方法可包括在与流通池相关的温度处于第一温度时，使图像捕获设备沿着成像轴聚焦于流动料流达到第一焦点状态，以及使用处于第一焦点状态的图像捕获设备采集流动料流内的第一亚组粒子的第一聚焦图像。而且，方法还可包括确定与流通池相关的温度已经历从第一温度到第二温度的变化，以及响应于温度的变化及流通池温度与所需焦点之间的已知关系而自动地将图像捕获设备的焦点从第一焦点状态调节到第二焦点状态。此外，方法可包括使用图像捕获设备在第二焦点状态下采集流动料流内的第二亚组的粒子的第二聚焦图像。

在一些情况下，调节图像捕获设备的焦点的过程包括使用温度的变化及流通池温度与所需焦点之间的已知关系来调节图像捕获设备与流通池之间的距离。在一些情况下，调节图像捕获设备的焦点的过程包括使用温度的变化及流通池温度与所需焦点之间的已知关系来调节图像捕获设备的焦距。

聚焦图像

图14a和14b提供了根据本发明实施例的截面侧视图，其示出了成像系统和方法的各方面。参照图14a，粒子分析系统1400a诸如血液学分析仪可被配置用于组合式粘度和几何流体聚焦，例如使用流通池和粘性鞘流体技术诸如共同待审的美国专利申请_____中所述的那些，所述专利的内容以引用方式并入本文中。使用粒子分析系统使血液流体样品中的粒子成像的示例性方法可包括使鞘流体1410a沿着粒子分析系统的流通池1430a的流路1420a流动。流路1420a可至少部分地由流通池的相对流通池壁1422a、1424a限定。鞘流体1410a可具有与血液流体样品的粘度不同的粘度。成像方法还可包括将血液流体样品注入流通池1430a内的流动鞘流体1410a中，以使得血液流体样品流体在样品流动料流1440a中流动。样品流动料流1440a可具有大于流动料流厚度的流动料流宽度。样品流动料流1440a也可流过流路尺寸的缩减段并横越成像轴1450a。在图14a图示中，流动的方向为从左到右。

另外，通过使具有相对于流通池1430a固定的位置的成像靶标1470a成像来使图像捕获设备1460a聚焦。例如，如此处所描绘，成像靶标1470a可具有相对于流通池的照明窗口1480a固定的位置。在一些情况下，成像靶标1470a可嵌入窗口1480a内或固定在窗口1480a上。方法也可包括用图像捕获设备1460a采集样品流体的粒子(例如，至少部分地设置在流动料流1440a内的粒子1490a)的聚焦图像。聚焦图像适用于粒子表征和计数。

可使用位移距离使图像捕获设备1460a聚焦于样品流动料流1440a。例如，位移距离可对应于样品流动料流1440a与成像靶标1470a之间的距离d。鞘流体1410a与血液流体样品之间的粘度差，与流路尺寸的缩减段相结合，有效地在成像轴1450a处流体聚焦样品流动料流1440a中的样品流体，同时保持血液流体样品中的细胞的活力。例如，与粘度差相关的鞘流体1410a和样品流体料流1440a之间的相互作用所引起的粘度流体聚焦作用，与和流路尺寸的缩减段相关的鞘流体1410a和样品流体料流1440a之间的相互作用所引起的几何流体聚焦作用相结合，可有效地在成像轴1450a处在流体样品粒子的至少一些中提供靶标成像状态，同时鞘流体1410a中的粘度剂保持样品流体料流1440a中细胞的活力，使得细胞从样品流体料流1440a延伸到流动鞘流体1410a中时细胞的结构和内容物完整。

当使用位移距离使图像捕获设备1460a聚焦于样品流动料流1440a时，图像捕获设备1460a可在成像轴1450a处或在与成像轴1450a相关的图像捕获位点处获得样品流动料流1440a内的粒子或细胞的图像。在一些情况下，可用照明源或灯1426a照明粒子。可在粒子接近成像轴1450a时，在粒子横越成像轴1450a时和/或在粒子远离成像轴1450a流动时，获得样品流动料流1440a的图像。

图14b描绘了替代流通池构形的各方面，其中成像靶标1470b具有相对于流通池1430b的观察孔窗口1482b固定的位置。例如，成像靶标1470b可嵌入窗口1482b内或固定在窗口1482b上。如这里所示，成像方法可包括通过使具有相对于流通池1430b固定的位置的成像靶标1470b成像来使图像捕获设备1460b聚焦。此外，可使用位移距离使图像捕获设备1460b聚焦于样品流动料流1440b。例如，位移距离可对应于样品流动料流1440b与成像靶标1470b之间的距离d。

图14c描绘了流通池1430c的截面端视图，示出了自聚焦或成像靶标的各自替代设置位置。例如，成像靶标1472c可位于流通池1430c的观察孔窗口1482c。任选地，成像靶标1474c可位于流通池1430c的照明窗口1480c。还任选地，成像靶标1476c可位于侧向流通池壁(例如，1432c和/或1434c)中。可使用位移距离使图像捕获设备1460c聚焦于样品流动料流1440c，所述样品流动料流包封在鞘流体1410c内。在一些实施例中，位移距离可对应于沿着成像轴1450c在样品流动料流1440c(或由流动料流1440c限定的中心平面1441c)与观察孔窗口成像靶标1472c之间的距离d1或由该距离限定。在一些实施例中，位移距离可对应于沿着成像轴在样品流动料流1440a(或中心平面1441c)与照明窗口成像靶标1476c之间的距离d2或由该距离限定。在一些实施例中，位移距离可对应于沿着成像轴在样品流动料流1440a(或中心平面1441c)与流通池侧壁成像靶标1474c之间的距离d3或由该距离限定。在一些情况下，距离d3具有大于零的值。在一些情况下，距离d3具有零的值；即，样品流动料流1440a(或中心平面1441c)与成像靶标1474c共面的情形。在一些情况下，可以限定不基于距离d1、距离d2或距离d3计算的位移距离。例如，位移距离可为由流通池或血液学分析仪制造商提供的预定数或值。

根据一些实施例，样品流动料流1440c在成像轴处可具有约2μm至约10μm范围内的厚度t1。在一些情况下，流路或鞘流体1410c在成像轴处可具有约150μm的厚度t2。如这里所示，成像靶标1472c可位于观察孔窗口1482c上，所述观察孔窗口设置在样品流动料流1440c与图像捕获设备1460c之间。在一些情况下，成像靶标(例如，1474c)可位于照明窗口1480c与观察孔窗口1482c之间。如本文别处所讨论，采集聚焦图像的方法可包括使用位移距离调节图像捕获设备1460c与流通池1430c之间的距离。在一些情况下，如本文别处所讨论，采集聚焦图像的方法可包括使用位移距离调节图像捕获设备1460c的焦距。在一些情况下，采集聚焦图像的方法可包括调节图像捕获设备1460c与流通池1430c之间的距离，并且调节距离的方法包括将流通池1430c移动到例如更靠近图像捕获设备1460c的位置，或离图像捕获设备1460c更远的位置。

如图14d中所描绘，图像捕获设备1460d的第一焦距可对应于图像捕获设备1460d与成像靶标1470d之间的距离d1(例如，沿着成像轴1450d)，并且图像捕获设备1460d的第二焦距可对应于图像捕获设备1460d与样品流动料流1440d(或由样品流动料流限定的中心平面)之间的距离d2(例如，沿着成像轴1450d)。在一些情况下，成像靶标可位于流通池中的另一个位置，例如如图14c中所描绘。根据一些实施例，位移距离可对应于第一焦距(或距离d1)与第二焦距(或距离d2)之间的距离差。可使用该位移距离(例如，d1与d2之间的差值)使图像捕获设备1460d聚焦于样品流动料流1440d。

图15描绘了正视图，示出了自聚焦光栅(或成像靶标)的实施例，所述自聚焦光栅(或成像靶标)例如可位于照明孔口或窗口上、观察孔或窗口上，或位于另一流通池位置。随着高光学分辨率成像设备的距离或位置相对于带形样品料流移动，靶标可逐渐变弱。如图9-12b中所描绘，成像或聚焦靶标(自聚焦光栅)可位于将出现样品的视区的周边。返回参照图15，可以看出还可能的是，聚焦靶标可由位于视野中的对比形状限定。

当成像设备聚焦于自聚焦光栅(靶标)(图15中的图b)时，如由设备成像的形状被明确限定并且可用于如本文所述的自聚焦，即寻找靶标与成像设备之间的距离，在该距离处，在沿着与所述形状交叉的线(诸如如箭头所示的线)定位的相邻像素之间所述形状产生幅度上的最高对比度。图b中所描绘的焦点配置对应于图16a中所描绘的类似焦点配置。如图16a所示，图像捕获设备的焦平面与自聚焦靶标配向，并且因此图像捕获设备处于适当位置以获得自聚焦靶标的清晰图像。

返回参照图15，当例如通过调节物镜的工作距离或物镜与其焦平面之间的距离使工作位置(例如，成像设备的焦平面)远离自聚焦光栅(在图15中的自聚焦光栅的左侧和右侧所示的图a和c中示出)移动时，聚焦靶标形状当前偏离焦点，并且在高光学分辨率成像设备聚焦于带形样品料流的位置处，聚焦靶标形状完全不再能分辨(参见图15中的图d)。图d中所描绘的焦点配置可对应于图16b中所描绘的类似焦点配置。如图16b所示，图像捕获设备的焦平面与样品流体料流配向，并且因此图像捕获设备处于适当位置以获得样品流动料流中的粒子的清晰图像。图16a的焦平面与图16b的焦平面间隔距离d。如图16b所示，通过将图像捕获设备移动距离d，可以也将焦平面移动距离d，并且因此将焦平面从自聚焦靶标移动到样品流动料流。在一些情况下，可通过内部调节图像捕获设备的焦距同时保持图像捕获设备处于相对于流通池的固定位置，使焦平面从自聚焦靶标移动到样品流动料流。在一些情况下，可通过内部调节图像捕获设备的焦距同时调节图像捕获设备相对于流通池的位置，使焦平面从自聚焦靶标移动到样品流动料流。自聚焦形状可提供于视野内且相对于流通池固定的任何位置处，诸如在照明开口或窗口上、或在穿过其引导高光学分辨率成像设备的观察孔或窗口的前方或后方、或在附接到光电管以保持靶标处于待成像的位置的夹具处。

根据一些实施例，当高光学分辨率成像设备在位移距离内移动并且自聚焦光栅偏离焦点时，出现在焦点内的特征是血细胞而非自聚焦光栅。在图15的实施例中，自聚焦光栅由视野中的形状限定。所述形状为有限尺寸的相对薄的离散形式，并且因此在移动位移距离之后，当聚焦于带形样品料流时所述形式在数字化图像中基本上不可见。在尺寸适合血液学(血细胞)成像应用的流通池中，典型的位移距离可为例如50至100μm。在一些实施例中，自聚焦特征保持高光学分辨率成像设备处于最佳焦距的1μm内。

因此，图15中所述的特征提供用于测定位移距离的示例性技术。例如，测定位移距离的方法可包括自聚焦过程，所述自聚焦过程涉及将测试流体样品注入鞘流体中以形成流通池内的测试样品流动料流，以及使用图像捕获设备获得成像靶标的第一聚焦图像。第一聚焦图像可对应于图15中的图b，其中聚焦成像靶标和图像捕获设备限定第一焦距。如此处所描绘，图像捕获设备的焦平面或工作距离/位置定位在成像靶标处。自聚焦过程也可包括使用图像捕获设备获得测试样品流动料流的第二聚焦图像。第二聚焦图像可对应于图15的图d，其中聚焦测试样品流动料流和图像捕获设备限定第二焦距。如此处所描绘，图像捕获设备的焦平面或工作距离/位置定位在成像靶标处。自聚焦过程还可包括通过计算第一焦距与第二焦距之间的差值来获得位移距离。在一些情况下，测试流体样品与血液流体样品相同并且测试样品流动料流与样品流动料流相同。在一些情况下，自聚焦过程建立与图像捕获设备相关的焦平面，并且焦平面相对于图像捕获设备保持静止。在一些情况下，自聚焦图像捕获设备的过程包括从多个焦点位置中确定最佳焦点位置。

根据一些实施例，可在不使用温度数据的情况下使图像捕获设备聚焦于样品流动料流。例如，图像捕获设备聚焦于样品流动料流的过程可独立于图像捕获设备的温度进行。在一些情况下，成像靶标可包括用于将图像捕获设备的成像轴相对于样品流动料流定位的刻度(例如，如图12b中所描绘)。在一些情况下，成像靶标可包括相对于成像轴配向的光圈，使得成像粒子设置在由光圈限定的孔内，并且在自聚焦期间使光圈的一个或多个边缘部分成像。

在示例性实施例中，自聚焦技术可将流通池定位在离样品料流的最佳焦点位置的±1μm内。在一些情况下，实施例涵盖这样的自聚焦技术，其可自动地使成像系统聚焦而不需要单独的聚焦液体或溶液或任何用户干预。示例性自聚焦技术也可考虑次优聚焦性能的机械原因，诸如漂移或热膨胀，其可造成成像设备物镜与流通池之间的距离的波动。在一些情况下，据观察样品流在流通池内的位置可以非常稳定并且与温度无关。因此，示例性成像技术可涉及聚焦于流通池中的成像靶标，以及使用固定偏移量实现对样品料流的最佳聚焦。

根据一些实施例，成像系统上使用的显微镜物镜具有0.75的数值孔径，产生±0.5μm的理论视野深度(dof)。在某些实验性尝试中，据观察可在离最佳焦点±1.25μm处获得良好图像质量。还据观察，实际或实验视野深度可与理论视野深度不同。例如，在某些实验性尝试中，据观察，视野深度为约2.5至3μm。根据某些实验研究，已确定用于将流通池定位在±1.25μm内的自聚焦性能可确保良好图像质量。在一些实施例中，自聚焦系统可操作以将流通池定位在离样品料流的最佳焦点位置的±1μm内。在某些实验性尝试中，据观察如本文所公开的自聚焦技术可重复地定位流通池中的靶标，且标准偏差小于0.3μm。在一些情况下，试验自聚焦系统运行证实了出色的可重复性(标准偏差≤0.23μm)并且能够确定样品料流的焦点位置在离优化度量位置<0.6μm内，所述优化度量位置在±1μm位置公差内。在各种温度条件下的另外自聚焦试验运行也表现出出色的定位性能(例如，流通池定位在最佳焦点位置的所需±1μm公差内)。自动化分析仪系统的该准确程度非常适于一致地且可靠地从如本文别处所公开的薄带流动料流中流动的血液流体样品在对应于标准实验条件的操作温度范围内获得粒子的高质量图像。

可使用计算机或具有硬件、软件和/或固件的其他处理器来执行本文描述的计算或操作中的每一个。各个方法步骤可通过模块执行，并且所述模块可包括被布置用于执行本文所述的方法步骤的多种多样的数字和/或模拟数据处理硬件和/或软件中的任何一种。所述模块任选地包括数据处理硬件，该数据处理硬件由于具有与其相关联的适当机器编程代码而适于执行这些步骤中的一个或多个，用于两个或更多个步骤(或两个或更多个步骤的部分)的模块被集成到单个处理器板中或采用多种多样的集成式和/或分布式处理架构中的任何一种被分成不同的处理器板。这些方法和系统通常将采用有形介质，该有形介质收录有具有用于执行上述方法步骤的指令的机器可读代码。合适的有形介质可包括存储器(包括易失性存储器和/或非易失性存储器)、存储介质(诸如软盘、硬盘、磁带等上的磁记录；光学存储器诸如cd、cd-r/w、cd-rom、dvd等上的磁记录；或任何其他数字或模拟存储介质)，等等。

本公开中所论述的所有专利、专利公布、专利申请、期刊论文、书籍、技术参考手册等全文以引用方式并入本文中以用于所有目的。

在附图中描绘或上文所述的组件的不同布置，以及未示出或描述的组件和步骤也是可行的。相似地，一些特征结构和子组合是可用的，且它们可以在与其他特征结构和子组合无关的情况下被采用。出于例示性和非限制性的目的描述了本发明的实施例，但可供选择的实施例对于本专利的读者而言将是显而易见的。在某些情况下，方法步骤或操作可按不同的顺序执行或实施，或者可对操作进行添加、删除或修改。应当理解，在本发明的某些方面，可用多个部件来替换单个部件，并且可用单个部件来替换多个部件，以提供元件或结构或者执行给定的一种或多种功能。除了这种替换将不能有效实践本发明的某些实施例的情况之外，这种替换被视为在本发明的范围之内。因此，本发明不限于上文所述或在附图中描绘的实施例，并且可以在不脱离下方权利要求的范围的前提下，创造各种实施例和进行各种修改。