本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种三明治夹心结构SERS检测病原菌的方法。
背景技术：
细菌检测是关系公共安全的一个重要领域。传统用于细菌检测的方法有平板计数法，聚合酶链式反应(PCR)，酶联免疫吸附(ELSA)等，它们作为灵敏、高效的微生物定量方法被广泛地使用。但是他们存在需要很长的细菌培养时间、特殊的样品前处理、抗干扰能力差等缺点，因此，开发快速、灵敏度高、特异性强的细菌检测方法，具有重要意义。
表面增强拉曼光谱(SERS)在细菌检测中具有快速、高效、特异性高等优点，由于不同物质具有其特有的指纹图谱，SERS同时也是很好的定性工具。
利用SERS检测细菌的时候，用于特异性抓取细菌的单元是进行细菌有效检测的关键。目前用于抓取细菌的单元包括抗体、适配体、抗生素、苯硼酸等。抗体具有很高的特异性，但是抗体的价格高，稳定性低；适配体的稳定性较高，特异性也高，但是目前筛选到的能用于特异性捕获细菌的适配体种类较少；抗生素的价格低，稳定性高，能特异性吸附细菌，但是抗生素是小分子物质，对细菌的识别位点较少。抗菌肽具有价格低，性质稳定的优点，对细菌也具有特异性吸附能力，相比于抗生素，抗菌肽由于是长链的多肽，抓取细菌时具有更多的识别位点。但如何对抓取的细菌进行分离和鉴别，仍需要设计新的检测策略。
技术实现要素：
针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种三明治夹心结构SERS检测病原菌的方法。本发明方法通过抗菌肽功能化磁性纳米粒子和氧化石墨烯-银包金纳米复合物协同组成的三明治夹心结构用于病原菌的鉴别和检测。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种三明治夹心结构SERS检测病原菌的方法，包括如下步骤：
(1)抗菌肽功能化磁性纳米粒子的制备：
将磁性纳米粒子经表面羧基化修饰后与抗菌肽进行缩合反应，得到抗菌肽功能化磁性纳米粒子；
(2)对巯基苯硼酸修饰的氧化石墨烯-银包金纳米复合物SERS探针的制备：
将氧化石墨烯经巯基化修饰后与银包金纳米粒子混合反应，得到氧化石墨烯-银包金纳米复合物，然后与对巯基苯硼酸混合反应，得到对巯基苯硼酸修饰的氧化石墨烯-银包金纳米复合物SERS探针；
(3)三明治夹心结构SERS检测病原菌：
(a)将抗菌肽功能化磁性纳米粒子和细菌进行孵育，在外磁场作用下将吸附了细菌的磁性纳米粒子分离出来，得到磁性纳米粒子-细菌复合物；
(b)将步骤(a)的磁性纳米粒子-细菌复合物和对巯基苯硼酸修饰的氧化石墨烯-银包金纳米复合物SERS探针共孵育，形成抗菌肽功能化磁性纳米粒子-细菌-SERS探针所组成的三明治夹心结构，在外磁场的作用下将该三明治夹心结构分离出来；
(c)将步骤(b)分离得到的三明治夹心结构通过SERS对不同细菌进行检测鉴别。
进一步地，步骤(1)中所述磁性纳米粒子是指具有超顺磁的纳米粒子，包括但不限于Fe3O4、MnFe2O4等。
进一步地，步骤(1)中所述表面羧基化修饰的方法如下：
将磁性纳米粒子与正硅酸乙酯(TEOS)混合反应，得到硅烷化磁性纳米粒子，然后与羧基乙基硅烷三醇钠盐混合反应，得到表面羧基化修饰的磁性纳米粒子。
进一步地，步骤(1)中所述抗菌肽包括杆菌肽、蛙皮素、多粘菌素E、爪蟾素等具有细菌识别能力的抗菌肽。
进一步地，步骤(2)中所述巯基化修饰的方法如下：
将氧化石墨烯分散到无水乙醇中，然后加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)缩合剂，搅拌混合均匀后加入巯基乙胺反应，得到巯基化氧化石墨烯。
进一步地，步骤(2)中所述银包金纳米粒子通过如下方法制备得到：
搅拌条件下将HAuCl4加入到沸腾的超纯水中，然后加入柠檬酸钠搅拌反应，得到金纳米粒子的分散液，冷却到室温，然后加入抗坏血酸溶液搅拌混合均匀，滴加AgNO3溶液搅拌反应，得到银包金纳米粒子。
进一步地，步骤(2)中所述银包金纳米粒子与氧化石墨烯的质量比为(0.5～15):1。更优选为10:1。
本发明的检测方法具有如下优点及有益效果：
(1)修饰抗菌肽用于捕获细菌，具有价格低，性质稳定，结合位点多的优点；
(2)结合了磁性纳米粒子，可用于样品的富集和除杂，达到更高的检测灵敏度；
(3)将银包金纳米粒子结合到氧化石墨烯上面，对银包金起到了保护的作用，防止银包金被氧化，氧化石墨烯增加了4-MPBA的吸附量；
(4)利用不同种类细菌结合到4-MPBA以后，4-MPBA的拉曼峰发生了特异性变化，对不同种类细菌实现了区分鉴别。
附图说明
图1是本发明实施例中杆菌肽功能化磁性纳米粒子的合成方法及表征：(A)杆菌肽功能化磁性Fe3O4NPs的合成步骤示意图；(B)磁性Fe3O4NPs的TEM图；(C)硅烷化磁性Fe3O4NPs的TEM图；(D)磁性Fe3O4NPs、硅烷化磁性Fe3O4NPs和杆菌肽功能化磁性Fe3O4NPs的磁滞回线图；(E)磁性Fe3O4NPs(a)、硅烷化磁性Fe3O4NPs(b)、杆菌肽功能化磁性Fe3O4NPs(c)的红外光谱图；(F)杆菌肽功能化磁性Fe3O4NPs在光学显微镜下的图；(G)杆菌肽功能化磁性Fe3O4NPs和大肠杆菌孵育，磁分离以后在光学显微镜下的图。
图2是本发明实施例中4-MPAB-GO-Au@Ag SERS tags的合成方法及表征：(A)4-MPBA-GO-Au@Ag SERS tags的合成步骤示意图；(B)从左到右分别是Au@AgNPs、Au@AgNPs和HS-GO混合5min、Au@AgNPs和HS-GO混合10min的外观图；(C～G)不同比例Au@AgNs和HS-GO结合以后的TEM图。
图3是本发明实施例中氧化石墨烯增强基底稳定性的测试结果图。
图4是本发明实施例中检测和鉴别三种致病菌(绿脓杆菌大肠杆菌(p.aeruginosa)，金黄色葡萄球菌(S.aureus)，大肠杆菌(E.coil))的流程原理及结果图。
图5本发明实施例中三明治夹心结构的形成原理及结果图：(A)没有细菌存在时，不能形成三明治夹心结构，SERS tags不能被磁分离出来；(B)没有细菌存在时，拉曼显微镜下只能观察到黑色的磁性Fe3O4团聚物；(C)有细菌存在的时候，形成了三明治夹心结构，SERS tags被磁分离出来；(D)有细菌存在的时候，拉曼显微镜下观察到右金属光泽的物质出现，因为有SERS tags的引入；(E)单纯大肠杆菌的TEM；(F)大肠杆菌形成三明治夹心结构后的TEM。
图6本发明实施例中SERS鉴别三种不同种类致病菌(a)4-MPBA的SERS图；(b)绿脓杆菌SERS图；(c)金黄色葡萄球菌SERS图；(d)大肠杆菌SERS图；(e)杆菌肽功能化-Fe3O4SERS图。
图7本发明实施例中结合PCA鉴别三种不同种类致病菌的图谱及PCA结果图：(A)4-MPBA；(B)金黄色葡萄球菌；(C)绿脓杆菌；(D)大肠杆菌；(E)PCA结果。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例
(1)抗菌肽功能化磁性纳米粒子的制备：
(a)磁性四氧化三铁纳米粒子(Fe3O4NPs)的合成：将1.35g FeCl3·6H2O加入到40mL乙二醇中，搅拌，形成均匀的溶液。继续加入1.0g聚乙二醇(数均分子量为10000)和3.6g NaAc·6H2O，搅拌至完全溶解。将所得混合物转移到到100mL高压反应釜中，在200℃下加热8h。将所得产物磁分离后用乙醇和去离子水分别洗涤3次，得到磁性Fe3O4NPs。
(b)磁性Fe3O4NPs进行硅烷化修饰(包裹正硅酸乙酯TEOS)：取3mL 7.5mg/mL Fe3O4NPs溶液(分散于1.2wt.％氨水)，加入200μL TEOS，超声90min，继续加入10μL TEOS，超声90min，将所得产物磁分离后用乙醇和去离子水分别洗涤3次，得到硅烷化磁性Fe3O4NPs。
(c)硅烷化磁性Fe3O4NPs的羧基化修饰：取1mL 10mg/mL的硅烷化磁性Fe3O4NPs(溶解于10mM磷酸缓冲溶液，pH＝7.4)，加入80μL羧基乙基硅烷三醇钠盐，混合4h。所得产物在磁场下进行分离，用乙醇和去离子水分别洗涤3次，得到羧基化磁性Fe3O4NPs。
(d)杆菌肽功能化磁性Fe3O4NPs的制备：取10mg羧基化磁性Fe3O4NPs，加入到25mL PBS(pH＝7.4)溶液中，再加入16.5mg EDC和10g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，混合4h。随后加入20mg杆菌肽(bacitracin)，继续混合3h。将所得产物磁分离以后，用乙醇和去离子水分别洗涤3次，得到杆菌肽功能化磁性Fe3O4NPs。
参见附图1，A是杆菌肽功能化磁性Fe3O4NPs的合成步骤示意图；B是步骤(a)所得裸露的磁性Fe3O4NPs的透射电镜(TEM)图，可以看出所制备的磁性Fe3O4NPs直径大约在440nm；C是步骤(b)所得硅烷化磁性Fe3O4NPs的TEM图，可以看出，在修饰TEOS以后，磁性磁性Fe3O4NPs的表面包裹了一层薄薄的聚合物，形成核壳结构；D是磁性Fe3O4NPs(Fe3O4)、硅烷化磁性Fe3O4NPs(Fe3O4@SiO2)和杆菌肽功能化磁性Fe3O4NPs(Fe3O4@SiO2@bacitracin)的磁滞回线图，可以看出，裸露的磁性Fe3O4NPs具有很好的超顺磁性，在硅烷化修饰以后，超顺磁性有所降低，继续修饰杆菌肽以后，又稍微降低了一些，但是总体上，仍然具有较好的超顺磁性，可以用于磁分离；E是裸露的磁性Fe3O4NPs(a)，硅烷化磁性Fe3O4NPs(b)和杆菌肽修饰的磁性Fe3O4NPs(c)的红外光谱图，可以看到，磁性Fe3O4NPs在硅烷化和修饰杆菌肽之后，红外光谱图均显示出一定的变化；F是裸露的磁性Fe3O4NPs和大肠杆菌进行孵育，磁分离以后在光学显微镜下进行观察，可以看到，磁性Fe3O4NPs的团聚物清晰可见，但是未见到细菌的存在；G是杆菌肽功能化磁性Fe3O4NPs和大肠杆菌进行孵育，磁分离以后在光学显微镜下进行观察，相比于F，G有白色点出现(大肠杆菌)，说明了磁性Fe3O4NPs修饰杆菌肽以后，可以很好地抓取大肠杆菌。
(2)对巯基苯硼酸修饰的氧化石墨烯-银包金纳米复合物SERS探针(4-MPBA-GO-Au@Ag SERS tag)的制备：
(a)银包金纳米粒子(Au@AgNPs)的合成：在磁力搅拌的情况下，将HAuCl4(0.1M)加入到50mL沸腾的超纯水中，待搅拌均匀后，加入0.75mL的柠檬酸钠(1％重量)溶液到上述的沸腾溶液中；继续搅拌30分钟，得到一个酒红色的分散液即为金纳米粒子的分散液，随后将分散液冷却到室温，用0.22微米的微孔滤膜进行过滤，收集滤液；取10mL获得的滤液和抗坏血酸(0.1M)溶液，在磁力搅拌下充分混合。保持磁力搅拌，在室温下将1mM AgNO3逐滴，每隔30秒滴加一滴，加入到上述溶液中，滴加完后继续搅拌30分钟，得到Au@AgNPs溶液。
(b)巯基化氧化石墨烯的制备：取100mg氧化石墨烯(GO)加入到50mL乙醇中，超声60min，形成2mg/mL的GO乙醇分散液。随后，加入1.9g EDC缩合剂，搅拌12h，使GO表面的羧基充分活化，加入50mL巯基乙胺(1mM)，搅拌4h。将所得产物在9000rpm下离心，用去离子水洗去多余的巯基乙胺，得到了巯基化氧化石墨烯(HS-GO)。
(c)氧化石墨烯-银包金纳米复合物(GO-Au@Ag NPs)的制备：将10mL Au@AgNPs溶液加入到2mL HS-GO(0.1mg/mL)分散液中，搅拌2h，将所得产物在9000rpm下离心，用去离子水洗涤2次，得到GO-Au@Ag NPs。
(d)4-MPBA-GO-Au@Ag SERS tag的制备：取6mL对巯基苯硼酸(4-MPBA，0.01mg/mL)溶液，和步骤(c)所得到的GO-Au@Ag NPs进行混合4h。将产物在9000rpm下离心，用去离子水洗涤2次，得到4-MPBA-GO-Au@Ag SERS tag。
参见附图2，A是4-MPBA-GO-Au@Ag的合成步骤示意图；B从左到右分别是Au@Ag NPs、Au@Au NPs和HS-GO混合5min、Au@Au NPs和HS-GO混合10min的外观图，可以看到，Au@Au NPs加入到HS-GO之后，由于GO上的HS很快就吸附了Au@Ag NPs，所以Au@AgNPs的颜色在短时间内发生了很大的变化；C～G是不同质量比例Au@AgNPs/GO(分别是0.5:1、1:1、5:1、10:1、15:1)制备得到的GO-Au@Ag NPs的TEM图，图上可见，随着Au@AgNPs量的增加，GO片层上吸附的Au@AgNPs逐渐增加，但是当比例超过10:1的时候，由于Au@AgNPs大量存在，使GO片层上的Au@AgNPs大量团聚，所以10:1的比例是最佳的。
参见附图3，对比了Au@Ag NPs和GO-Au@Ag NPs的稳定性，A和B分别是GO-Au@Ag NPs和Au@AgNPs在4℃中储存0天、7天、60天后对R6G的SERS增强效果，图上可见，有GO存在的时候，基底增强效果即使在存放60天以后仍然具有很好的SERS活性，而没有GO存在的时候，基底的增强效果在7天之后就显著地降低。C和D分别是GO-Au@Ag NPs和Au@Ag NPs在阳光下照射0小时、12小时、72小时后对R6G的SERS增强效果，图上可见，有GO存在的时候，基底增强效果在光照下没有显著影响，而没有GO存的时候，基底的SERS活性显著降低。说明GO在稳定基底SERS活性中起到很大作用。
(3)三明治夹心结构SERS检测和鉴别三种致病菌(绿脓杆菌大肠杆菌(p.aeruginosa)，金黄色葡萄球菌(S.aureus)，大肠杆菌(E.coil))：
(a)将杆菌肽功能化磁性Fe3O4NPs和细菌的实际样品进行混合，孵育1h，在磁场下将细菌/磁性Fe3O4NPs结合物分离出来，用PBS洗去未结合的细菌，得到磁性纳米粒子-细菌复合物；
(b)往步骤(a)所得磁性纳米粒子-细菌复合物中加入4-MPBA-GO-Au@Ag SERS tag，孵育1h，将得到的SERS tag/细菌/磁性Fe3O4NPs三明治夹心结构磁分离，用PBS洗去多余的SERS tag，用于后续的SERS检测。
(c)对于不同种类的细菌，通过SERS检测得到的对应的指纹图谱，可以进行鉴别。
本步骤检测和鉴别三种致病菌的流程原理及结果如附图4所示。
参考附图5，A和B表示在没有细菌存在的时候，由于不能形成三明治夹心结构，SERS tag不能被磁分离出来，在拉曼显微镜下只看到了黑色的Fe3O4团聚物；C和D表示在有细菌存在的时候，由于形成了三明治夹心结构，SERS tags被磁分离出来，在拉曼显微镜下出现了有金属光泽的物质，是SERS tag所引起的；E是单纯的大肠杆菌的TEM图，F是形成了三明治夹心结构的TEM图，可以看到大肠杆菌的表面吸附有Fe3O4和GO-Au@Ag。
参考附图6，是三明治夹心结构策略SERS鉴别三种致病菌的结果。分别是SERS tags(a)，绿脓杆菌大肠杆菌(b)，金黄色葡萄球菌(c)，大肠杆菌(d)，杆菌肽功能化Fe3O4NPs(e)的SERS图谱。图上可见，不同种类的细菌分别呈现了不一样的指纹图谱，可以轻易地鉴别出来。
参考附图7，是利用判别分析(PCA)，采集了大量的细菌的图谱，对鉴别的结果进行统计学分析，图上可见，图上分别是SERS tags(A)，金黄色葡萄球菌(B)，绿脓杆菌大肠杆菌(C)，大肠杆菌(D)。E是PCA分析的结果，图上可见，三种细菌可以很好地分开，说明了可以很好地鉴别三种不同种类的细菌。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。