观察木质部薄壁组织的切片混合染色液和切片的制备方法与流程

本发明是关于一种生物切片制备的技术领域，特别是涉及一种观察木质部薄壁组织的切片混合染色液和切片的制备方法。

背景技术：

制作木质部切片是植物解剖学研究的常用手段。木本植物的木质部主要由导管(或管胞)、纤维组织和薄壁组织组成。薄壁组织是木质部中的活细胞，具有存储、传递水和营养物质的功能，为了加强对植物种间功能、策略差异的研究，现在迫切需要对木本植物薄壁组织的性状进行研究。

但是目前常用的制作木质部切片的染色剂对薄壁组织和纤维组织的着色都是纯色，或者二者的颜色区分不明显，所以难以通过颜色区分薄壁组织和纤维组织。比如常用的染色剂有间苯三酚(phloroglucinol)、龙胆紫(gentianviolet)、甲苯胺蓝(toluidineblue)及包含番红(safranin)和快绿(fastgreen)的混合液都无法非常显著、直观地区分开纤维组织和薄壁组织。

制备石蜡切片、树脂切片的方法都需要加入包埋剂，加入包埋剂的切片方法往往需要透明、包埋、切片、脱蜡(脱包埋剂)、染色、封片等流程，制备过程较为复杂，往往一批样品做下来需要花费几天的时间，耗时很长。此外，包埋剂浸入植物组织也会破坏薄壁组织这种活细胞的活性，进一步难以区分薄壁组织和纤维组织。

番红，也称作番红o、基本红2或藏红t，是用在组织学和细胞学的生物染色剂。阿尔辛蓝，英文名称：alcianblue，cas：12040-44-7：分子式：c56h68cl4cun16s4，中文别名：阿尔新兰、阿尔新蓝，具有如下结构式：

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种观察木质部薄壁组织的切片混合染色液，其能够解决现有木质部切片制作方法复杂、耗时时间长且薄壁组织和纤维组织不易区分的问题。

为实现上述目的，本发明提供了一种观察木质部薄壁组织的切片混合染色液，包括：番红乙醇溶液和阿尔辛蓝水溶液；其中，番红乙醇溶液和阿尔辛蓝水溶液的体积比是30～40:60～70。

在一优选的实施方式中，所述番红乙醇溶液的浓度是0.008～0.012g/ml，阿尔辛蓝水溶液的浓度是0.008～0.012g/ml；优选的，所述番红乙醇溶液的浓度是0.009～0.011g/ml，阿尔辛蓝水溶液的浓度是0.009～0.011g/ml；最优选的，所述番红乙醇溶液的浓度是0.010g/ml，阿尔辛蓝水溶液的浓度是0.010g/ml。

在一优选的实施方式中，所述番红乙醇溶液的溶剂是体积百分比浓度为40％～60％的乙醇溶液；优选的，所述乙醇溶液的体积百分比浓度为50％。

采用该浓度乙醇溶液可使番红溶解效果好，溶解速度快，溶解彻底且无残渣。

在一优选的实施方式中，所述阿尔辛蓝水溶液的溶剂选自纯净水、去离子水或蒸馏水中任意一种。

在一优选的实施方式中，所述番红乙醇溶液和阿尔辛蓝水溶液的体积比是32～37:62～67；优选的，所述番红乙醇溶液和阿尔辛蓝水溶液的体积比是35:65。

本发明的另一目的在于提供一种切片混合染色液的制备方法，所述切片混合染色液为上述任意一种切片混合染色液，制备步骤包括：采用乙醇溶解番红，配制成浓度为0.008～0.012g/ml的番红乙醇溶液；采用纯净水溶解阿尔辛蓝，配制成浓度为0.008～0.012g/ml的阿尔辛蓝水溶液；将所述番红乙醇溶液和阿尔辛蓝水溶液按体积比30～40:60～70的比例进行混合，配制成所述切片混合染色液。

本发明的另一目的在于提供一种切片的制备方法，所述切片为木质部切片，包括以下步骤：

(1)将新鲜的木质部样品在水中浸泡吸水，得到吸水后的木质部样品；

(2)将步骤(1)浸泡后的木质部样品切出横截面切片；以及

(3)将所得切片浸入上述任意一种切片混合染色液中进行染色，染色时间为3～5min，然后用梯度乙醇溶液进行脱水，得到脱水染色后的木质部切片。

在一优选的实施方式中，上述步骤(1)中，木质部样品在水中浸泡的时间是3min～6h。

在一优选的实施方式中，上述步骤(2)中，所述横截面切片的厚度是18～20μm。

在一优选的实施方式中，上述步骤(3)中，所述梯度乙醇溶液的体积百分比浓度是1～100％。

在一优选的实施方式中，上述步骤(3)中，染色后的切片先用纯净水进行清洗，然后在吸水纸上蘸干水分，再分别用50％的乙醇、75％的乙醇、95％的乙醇进行脱水，取出脱水后的切片在吸水纸上蘸干水分和乙醇；优选的，每个梯度乙醇的脱水时间是3～5s。

在一优选的实施方式中，进一步将上述步骤(3)所得脱水染色后的木质部切片放置于载玻片上，滴加加拿大树胶，盖上盖玻片，压平，制成永久切片。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明切片混合染色液中番红染色纤维组织，阿尔辛蓝染色薄壁组织，该混合染色液染色后的木质部切片中可以同时清晰地观察到木质部横截面的薄壁组织、纤维组织和导管(或管胞)，能够明显地区分木质部的纤维组织和薄壁组织，克服了传统切片方法中染色剂难以通过颜色区分这两种组织的缺点。

(2)本发明采用体积比是30～40:60～70的番红乙醇溶液和阿尔辛蓝水溶液的混合染色液对木质部切片进行染色，切片成像效果远远好于未经染色液染色和仅通过单一染色液染色的效果，未经染色液染色的木质部切片的薄壁组织和纤维组织无颜色区别，仅通过单一染色液染色的木质部切片的薄壁组织和纤维组织为一种颜色，二者均无法通过区分薄壁组织和纤维组织；另外，采用该体积比的番红乙醇溶液和阿尔辛蓝水溶液的混合染色液相对其他番红乙醇溶液和阿尔辛蓝水溶液体积比的混合染色液的染色效果更好，采用其他体积比的番红乙醇溶液和阿尔辛蓝水溶液的混合染色液所得染色木质部切片的薄壁组织和纤维组织的颜色区别不明显，不能清晰区分木质部的纤维组织和薄壁组织，而采用体积比是30～40:60～70的番红乙醇溶液和阿尔辛蓝水溶液的混合染色液所得切片的薄壁组织和纤维组织的颜色区别非常明显。

(3)相比现在常用的其他切片制备方法，本方法不需包埋材料，可直接快速制作成永久切片用于后续观察，整个制备时间不超过10分钟，整个切片制备时间短，适用于所有木本植物，可应用于木本植物的解剖学研究中。

附图说明

图1是经本发明实施例1混合染色液染色后显微镜下观察得到的白蜡树种木质部横截面切片的效果显示图，其中薄壁组织呈蓝色、纤维组织呈红色；

图2是经本发明实施例1混合染色液染色后显微镜下观察得到的海州常山树种木质部横截面切片的效果显示图，其中薄壁组织呈蓝色、纤维组织呈红色；

图3是经本发明实施例1混合染色液染色后显微镜下观察得到的柿树树种木质部横截面切片的效果显示图，其中薄壁组织呈蓝色、纤维组织呈红色；

图4是经本发明实施例1混合染色液染色后显微镜下观察得到的皂荚树种木质部横截面切片的效果显示图，其中薄壁组织呈蓝色、纤维组织呈红色；

图5是经对比例1不经染色后显微镜下观察得到的白蜡树种木质部横截面切片的效果显示图；

图6是经对比例2甲苯胺蓝染色液染色后显微镜下观察得到的白蜡树种木质部横截面切片的效果显示图；

图7是经对比例3混合染色液a染色后显微镜下观察得到的白蜡树种木质部横截面切片的效果显示图；

图8是经对比例4混合染色液b染色后显微镜下观察得到的白蜡树种木质部横截面切片的效果显示图。

主要附图标记说明：

1-薄壁组织，2-纤维组织，3-导管。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

番红：购自于索莱宝(solarbio)，商品号：s8020；

阿尔辛蓝(alcianblue)：购自于索莱宝(solarbio)，商品号：a8140。

实施例1：一种用于木质部切片染色的混合染色液的制备方法

制备步骤包括：采用体积百分比浓度为50％的乙醇溶解番红，配制成浓度为0.010g/ml的番红乙醇溶液；采用纯净水溶解阿尔辛蓝，配制成浓度为0.010g/ml的阿尔辛蓝水溶液；将番红乙醇溶液和阿尔辛蓝水溶液按体积比35∶65混合，配制成混合染色液。

实施例2：一种用于木质部切片染色的混合染色液的制备方法

制备步骤包括：采用体积百分比浓度为50％的乙醇溶解番红，配制成浓度为0.010g/ml的番红乙醇溶液；采用纯净水溶解阿尔辛蓝，配制成浓度为0.010g/ml的阿尔辛蓝水溶液；将番红乙醇溶液和阿尔辛蓝水溶液按体积比40∶60混合，配制成混合染色液。

实施例3：一种用于木质部切片染色的混合染色液的制备方法

制备步骤包括：采用体积百分比浓度为50％的乙醇溶解番红，配制成浓度为0.010g/ml的番红乙醇溶液；采用纯净水溶解阿尔辛蓝，配制成浓度为0.010g/ml的阿尔辛蓝水溶液；将番红乙醇溶液和阿尔辛蓝水溶液按体积比30∶70混合，配制成混合染色液。

实施例4：一种白蜡木质部切片快速染色的染色方法

制备步骤包括：将白蜡木质部样品在水中浸泡30min/h，使得样品材料充分吸水；将浸泡后的白蜡木质部样品切出厚度为18μm的横截面切片；取1ml实施例1所得混合染色液，将所得切片浸入其中进行染色，染色时间为3min；然后用纯净水清洗3s后用吸水纸蘸干切片的水分；再分别用体积百分比浓度为50％的乙醇、体积百分比浓度为75％的乙醇、体积百分比浓度为95％的乙醇脱水，每次乙醇脱水时间是3s，取出后在吸水纸上蘸干水分和乙醇，得到脱水染色后的白蜡木质部切片。

将所得脱水染色后的白蜡木质部切片铺平于载玻片上，滴加加拿大树胶，盖上盖玻片，压平，制成永久切片，于光学显微镜下观察、拍照，得到图1经实施例1混合染色液染色后显微镜下观察得到的白蜡树种木质部横截面切片的效果显示图。从该图可知，薄壁组织在切片中呈蓝色，纤维组织在切片中呈红色，可以非常清晰地观察到木质部横截面的薄壁组织、纤维组织和导管，能够明显区分出白蜡木质部的纤维组织和薄壁组织。

实施例5：一种海州常山木质部切片快速染色的染色方法

制备步骤包括：将海州常山木质部样品在水中浸泡30min/h，使得样品材料充分吸水；将浸泡后的海州常山木质部样品切出厚度为18μm的横截面切片；取1ml实施例1所得混合染色液，将所得切片浸入其中进行染色，染色时间为3min；然后用纯净水清洗3s后用吸水纸蘸干切片的水分；再分别用体积百分比浓度为50％的乙醇、体积百分比浓度为75％的乙醇、体积百分比浓度为95％的乙醇脱水，每次乙醇脱水时间是3s，取出后在吸水纸上蘸干水分和乙醇，得到脱水染色后的海州常山木质部切片。

将所得脱水染色后的海州常山木质部切片铺平于载玻片上，滴加加拿大树胶，盖上盖玻片，压平，制成永久切片，于光学显微镜下观察、拍照，得到图2经实施例1混合染色液染色后显微镜下观察得到的海州常山树种木质部横截面切片的效果显示图。从该图可知，薄壁组织在切片中呈蓝色，纤维组织在切片中呈红色，可以非常清晰地观察到木质部横截面的薄壁组织、纤维组织和导管，能够明显区分出海州常山木质部的纤维组织和薄壁组织。

实施例6：一种柿树木质部切片快速染色的染色方法

制备步骤包括：将柿树木质部样品在水中浸泡30min/h，使得样品材料充分吸水；将浸泡后的柿树木质部样品切出厚度为18μm的横截面切片；取1ml实施例1所得混合染色液，将所得切片浸入其中进行染色，染色时间为3min；然后用纯净水清洗3s后用吸水纸蘸干切片的水分；再分别用体积百分比浓度为50％的乙醇、体积百分比浓度为75％的乙醇、体积百分比浓度为95％的乙醇脱水，每次乙醇脱水时间是3s，取出后在吸水纸上蘸干水分和乙醇，得到脱水染色后的柿树木质部切片。

将所得脱水染色后的柿树木质部切片铺平于载玻片上，滴加加拿大树胶，盖上盖玻片，压平，制成永久切片，于光学显微镜下观察、拍照，得到图3经实施例1混合染色液染色后显微镜下观察得到的柿树树种木质部横截面切片的效果显示图。从该图可知，薄壁组织在切片中呈蓝色，纤维组织在切片中呈红色，可以非常清晰地观察到木质部横截面的薄壁组织、纤维组织和导管，能够明显区分出柿树木质部的纤维组织和薄壁组织。

实施例7：一种皂荚木质部切片快速染色的染色方法

制备步骤包括：将皂荚木质部样品在水中浸泡30min/h，使得样品材料充分吸水；将浸泡后的皂荚木质部样品切出厚度为18μm的横截面切片；取1ml实施例1所得混合染色液，将所得切片浸入其中进行染色，染色时间为3min；然后用纯净水清洗3s后用吸水纸蘸干切片的水分；再分别用体积百分比浓度为50％的乙醇、体积百分比浓度为75％的乙醇、体积百分比浓度为95％的乙醇脱水，每次乙醇脱水时间是3s，取出后在吸水纸上蘸干水分和乙醇，得到脱水染色后的皂荚木质部切片。

将所得脱水染色后的皂荚木质部切片铺平于载玻片上，滴加加拿大树胶，盖上盖玻片，压平，制成永久切片，于光学显微镜下观察、拍照，得到图4经实施例1混合染色液染色后显微镜下观察得到的皂荚树种木质部横截面切片的效果显示图。从该图可知，薄壁组织在切片中呈蓝色，纤维组织在切片中呈红色，可以非常清晰地观察到木质部横截面的薄壁组织、纤维组织和导管，能够明显区分出皂荚木质部的纤维组织和薄壁组织。

对比例1：不对切片染色

直接通过上述实施例4相同的方法处理白蜡木质部切片，但是不对切片进行染色，得到图5经对比例1不经染色后显微镜下观察得到的白蜡树种木质部横截面切片的效果显示图。

从该图可知，白蜡树种的木质部薄壁组织和纤维组织无颜色区别，从而无法区分。

对比例2：采用解剖学研究中常用的甲苯胺蓝染色液对切片染色

通过上述实施例4相同的方法处理白蜡木质部切片，所不同的是采用的染色液为甲苯胺蓝，得到图6经对比例2甲苯胺蓝染色液染色后显微镜下观察得到的白蜡树种木质部横截面切片的效果显示图。

从该图可知，白蜡树种的木质部薄壁组织和纤维组织均为蓝色，无法通过颜色区分薄壁组织和纤维组织。

对比例3：采用不同体积比的番红乙醇溶液和阿尔辛蓝水溶液的混合染色液对切片染色

通过上述实施例4相同的方法处理白蜡木质部切片，所不同的是采用的染色液为混合染色液a，得到图7经对比例3混合染色液a染色后显微镜下观察得到的白蜡树种木质部横截面切片的效果显示图。其中，混合染色液a包括：0.010g/ml的番红乙醇溶液和0.010g/ml的阿尔辛蓝水溶液，番红乙醇溶液和阿尔辛蓝水溶液的体积比是15:95。

从该图可知，白蜡树种的木质部薄壁组织和纤维组织颜色无明显区别，无法区分这两种组织。

对比例4：采用不同体积比的番红乙醇溶液和阿尔辛蓝水溶液的混合染色液对切片染色

采用上述混合染色液4，并通过上述实施例4相同的方法处理白蜡木质部切片，得到图8经对比例4混合染色液b染色后显微镜下观察得到的白蜡树种木质部横截面切片的效果显示图。其中，采用的混合染色液b包括：0.010g/ml的番红乙醇溶液和0.010g/ml的阿尔辛蓝水溶液，番红乙醇溶液和阿尔辛蓝水溶液的体积比是50:50。

从该图可知，勉强可通过颜色区分白蜡树种的木质部薄壁组织和纤维组织，但是效果不如实施例4得到的图1清晰，区分效果也不如图1明显。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。