本发明涉及一种乳腺细胞癌变的检测方法，属于生物活性细胞检测领域。
背景技术：
复杂的细胞活动，如dna修复，氧化活性，细胞程序性死亡和转录调控通常是由多个相互关联的错综复杂的信号通路控制。生物学的传统工作集中在信号转导通路的单一成分的研究。虽然这些研究都在发现各种信号成分上取得显著的进步，但是复杂的细胞过程和他们的调控的充分瓦解要求在时间和空间上多个相关参数同时进行检测。作为一个重要的细胞过程，氧化还原稳态的维持依赖于活性氧(ros)的产生和消除系统的相互作用。这种系统的失调会导致氧化应激，造成生物学上的破坏，并且牵涉到各种病理情况，包括癌症，心血管疾病，炎症和退行性疾病。
《生物传感器与生物电子学》于2011年发表了一篇论文：双功能电光纳米探针实时检测单细胞中局部的生物化学过程(biosensorsandbioelectronics26(2011)4484–4490)。该文章提供了一种高效准确检测乳腺细胞癌变的检测方法，该方法通过添加刺激物能够实时地得到不同的单个活细胞内原位的dcf荧光光子数响应。但是该方法对h2o2的反应时间较长，能够检测的h2o2释放的总量较低，无法检测超低量的h2o2；但乳腺癌早期时h2o2的浓度极低，因此该方法不适用于早期乳腺癌的检测。另一方面早期癌症的检测或筛选对病人的早期治疗具有极为重要的意义。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种高效准确超灵敏检测乳腺细胞癌变的检测方法，该方法通过添加刺激物能够实时地得到不同的单个活细胞内原位的dcf荧光光子数响应。
说明：人正常乳腺上皮细胞株：英文缩写-mcf10a；人乳腺癌细胞株：英文缩写-mcf7；人皮表生长因子受体-2：英文缩写-her2，人皮表生长因子受体-2过表达的人乳腺癌细胞株：英文缩写-mcf7/her2。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下:
一种高效准确超灵敏检测乳腺细胞癌变的检测方法，包括如下步骤：
步骤1，选择人乳腺上皮细胞株mcf10a、人乳腺癌细胞株mcf7、her2过表达的mcf7细胞株(mcf7/her2)作为试验用细胞株，并对试验用细胞株进行消化吹打处理形成细胞悬液；
步骤2，用血球计数板测定细胞悬液中的细胞密度，以细胞密度为1×104个细胞/cm2接种到细胞浴槽的盖玻片上用于细胞附着；
步骤3，细胞分别附着24h、24.5h、25h、25.5h后，用pbs缓冲液冲洗粘附在盖玻片上的细胞3次，在37℃用染料dcfh-da染色细胞30分钟，孵育后，将染色的细胞用pbs缓冲液冲洗三次后向细胞浴槽中加入100μl的pbs缓冲液；
步骤4，将细胞浴槽放入纳米光电生化检测仪，调整纳米探头与细胞的相对位置，检测过程中添加刺激物pma并同时记录细胞内dcf的荧光光子数响应。
其中，步骤1中，先将试验用细胞株用pbs缓冲液清洗，清洗后用0.25％的胰蛋白酶溶液消化细胞，细胞消化后用含血清(血清的质量百分浓度为10％)的新鲜培养基终止消化，将混悬液吸到离心管中，1000r/min离心5min，得到的沉淀物用含血清的培养基重悬吹匀即可。
其中，步骤2中，所述细胞浴槽的盖玻片为细胞可爬壁生长的盖玻片。
其中，步骤3中，所述染料dcfh-da的浓度分别为20μm、25μm、30μm、35μm。
其中，步骤3中，所述染料dcfh-da的激发波长为485nm，发射波长为530nm。
其中，步骤4中，所述纳米探头是尖端通光，尖端尺寸在100nm左右的镀膜纳米探头。
其中，步骤4中，所述纳米探头通过微操作系统进行控制移动。
其中，步骤4中，所述纳米探头与细胞的相对位置通过倒置荧光生物显微镜进行观察调整。
其中，步骤4中，所述检测荧光光子响应过程中添加刺激物pma的浓度分别为10μm、15μm,20μm、25μm。
本发明的有益效果如下。
本发明实时检测揭示了在癌细胞中比正常细胞有明显更高的氧化响应，这表明细胞恶性肿瘤与氧化应激强度相关，而且较高的抗氧化水平是耐药性的原因，为在纳米级的环境中探测化学动力学以阐明关键生物过程提供了一个独特的应用方向，刺激物pma是一种能激活蛋白激酶c(pkc)的甘油二酯类似物，应用于引发靶细胞中的氧化反应。
具体实施方式
实施例1
一种高效准确检测乳腺细胞癌变的检测方法，包括如下步骤：
步骤1，选择人乳腺上皮细胞株mcf10a作为试验用细胞株，在显微镜下观察其生长状态，去除原有培养基，用pbs缓冲液清洗细胞1-2次，向培养瓶中加入2ml0.25％的胰蛋白酶溶液消化细胞，待细胞消化结束，加入2ml含血清的新鲜培养基终止消化，将混悬液吸到离心管中，1000r/min离心5min，得到的沉淀物用含血清的培养基重悬吹匀；
步骤2，用血球计数板测定细胞悬液中的细胞密度，以细胞密度为1×104个细胞/cm2接种到细胞浴槽的盖玻片上用于细胞附着，此盖玻片为细胞可爬壁生长的盖玻片；
步骤3，细胞附着24h后，用pbs缓冲液冲洗粘附在盖玻片上的细胞3次，在37℃用20μm的染料dcfh-da染色细胞30分钟。孵育后，将染色的细胞用pbs缓冲液冲洗三次后向细胞浴槽中加入100μl的pbs缓冲液；
步骤4，将细胞浴槽放入纳米光电生化检测仪，在倒置荧光生物显微镜下，通过微操作系统调整尖端通光，尖端尺寸在100nm左右的镀膜纳米探头与细胞的相对位置，检测过程中添加10μm的刺激物pma并同时记录细胞内dcf的荧光光子数响应。
染料dcfh-da的激发波长为485nm，发射波长为530nm。刺激物pma是一种能激活蛋白激酶c(pkc)的甘油二酯类似物，应用于引发靶细胞中的氧化反应。
通过dcf荧光光子数可以看出，在加入刺激物pma之前正常细胞内维持良好的氧化状态，在加入刺激后正常细胞内的活性氧水平稍微增加并逐渐趋于平缓，说明正常细胞内有良好的氧化还原系统能及时的消除外界的氧化应激。
实施例2
一种高效准确检测乳腺细胞癌变的检测方法，包括如下步骤：
步骤1，选择人乳腺癌细胞株mcf7作为试验用细胞株，在显微镜下观察其生长状态，去除原有培养基，用pbs缓冲液清洗细胞1-2次，向培养瓶中加入2ml0.25％的胰蛋白酶溶液消化细胞，待细胞消化结束，加入2ml含血清的新鲜培养基终止消化，将混悬液吸到离心管中，1000r/min离心5min，得到的沉淀物用含血清的培养基重悬吹匀；
步骤2，用血球计数板测定细胞悬液中的细胞密度，以细胞密度为1×104个细胞/cm2接种到细胞浴槽的盖玻片上用于细胞附着，此盖玻片为细胞可爬壁生长的盖玻片；
步骤3，细胞附着25h后，用pbs缓冲液冲洗粘附在盖玻片上的细胞3次，在37℃用20μm的染料dcfh-da染色细胞30分钟，孵育后，将染色的细胞用pbs缓冲液冲洗三次后向细胞浴槽中加入100μl的pbs缓冲液；
步骤4，将细胞浴槽放入纳米光电生化检测仪，在倒置荧光生物显微镜下，通过微操作系统调整尖端通光，尖端尺寸在100nm左右的镀膜纳米探头与细胞的相对位置，检测过程中添加10μm的刺激物pma并同时记录细胞内dcf的荧光光子数响应。
染料dcfh-da的激发波长为485nm，发射波长为530nm。刺激物pma是一种能激活蛋白激酶c(pkc)的甘油二酯类似物，应用于引发靶细胞中的氧化反应。
通过dcf荧光光子数可以看出，在加入刺激物pma之前癌症细胞内维持良好的氧化状态，在加入刺激物后癌症细胞内的活性氧水平急剧增加并逐步递增，说明癌症细胞内的氧化还原系统处于不正常的状态，不能及时消除外界的氧化应激。
实施例3
一种高效准确检测乳腺细胞癌变的检测方法，包括如下步骤：
步骤1，选择her2过表达的mcf7细胞株(mcf7/her2)作为试验用细胞株，在显微镜下观察其生长状态，去除原有培养基，用pbs缓冲液清洗细胞1-2次，向培养瓶中加入2ml0.25％的胰蛋白酶溶液消化细胞，待细胞消化结束，加入2ml含血清的新鲜培养基终止消化，将混悬液吸到离心管中，1000r/min离心5min，得到的沉淀物用含血清的培养基重悬吹匀；
步骤2，用血球计数板测定细胞悬液中的细胞密度，以细胞密度为1×104个细胞/cm2接种到细胞浴槽的盖玻片上用于细胞附着，此盖玻片为细胞可爬壁生长的盖玻片；
步骤3，细胞附着25.5h后，用pbs缓冲液冲洗粘附在盖玻片上的细胞3次，在37℃用20μm的染料dcfh-da染色细胞30分钟。孵育后，将染色的细胞用pbs缓冲液冲洗三次后向细胞浴槽中加入100μl的pbs缓冲液；
步骤4，将细胞浴槽放入纳米光电生化检测仪，在倒置荧光生物显微镜下，通过微操作系统调整尖端通光，尖端尺寸在100nm左右的镀膜纳米探头与细胞的相对位置，检测过程中添加10μm的刺激物pma并同时记录细胞内dcf的荧光光子数响应。
染料dcfh-da的激发波长为485nm，发射波长为530nm。刺激物pma是一种能激活蛋白激酶c(pkc)的甘油二酯类似物，应用于引发靶细胞中的氧化反应。
本发明基于背景论文中所描述的工艺，对以下参数进行多次优化，得出如下组合，具体结果见表1-表3。
表格1：mcf10a
备注：第1行组合为背景技术论文中原来参数及结果，第2-4行为优化工艺参数及结果。
表格2：mcf7
备注：第1行组合为背景技术论文中原来参数及结果，第2-4行为优化工艺参数及结果。
表格3：mcf7/her2
备注：第1行组合为背景技术论文中原来参数及结果，第2-4行为优化工艺参数及结果。
表4：本发明最佳优化工艺参数所得结果与背景技术论文参数所得结果比较。
备注：最佳优化工艺参数所得结果为表1-3中第4行数据；论文工艺参数所得结果为表1-3中第1行数据。
从以上结果(表1-3)可以看出，通过优化参数，释放时间大幅减少，峰值浓度大幅提高，能够检测到的h2o2释放总量也显著提高，具体比较数据见表4；因此本发明中优化后的工艺参数极大的提高了本检测方法的检测效率和准确率，同时也大幅提高了灵敏度。